Name: adult zebrafish injury models to study the effects of prednisolone in regenerating bone tissue
Uploaded: 2018-10-18T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue at JoVE.com

Deze studie werd gesteund door een subsidie van het centrum van regeneratieve therapieën Dresden ("zebravis als model te ontrafelen van de mechanismen van glucocorticoide-geïnduceerde botverlies"), en daarnaast door een subsidie van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (Transregio 67, project 387653785) naar de FK. We zijn zeer dankbaar aan Jan Kaslin en Avinash Chekuru voor hun advies en assistentie bij het uitvoeren van Schedeltrepanatie van de calvariae en fracturen in benige fin rays. Experimenten werden ontworpen, uitgevoerd en geanalyseerd door KG en FK. FK schreef het manuscript. Wij zouden ook willen bedanken Katrin Lambert, Nicole Cudak, en andere leden van de Knopf en merk labs voor technische bijstand en discussie. Onze dank gaat ook uit aan Marika Fischer en Jitka Michling voor uitstekende vis zorg en Henriette Knopf en Josh Currie voor proeflezen van het manuscript.

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de Landesdirektion Dresden (toestaan van getallen: AZ 24D-9168.11-1/2008-1 met AZ 24-9168.11-1/2011-52, AZ 24-9168.11-1/2013-5, AZ 24-9168.11-1/2013-14, AZ DD24.1-5131/354/87).
1. bereiding van materialen en oplossingen
Opmerking: Prednisolon, zoals andere glucocorticoïden, leidt tot immunosuppressie. Aldus, moeten voorzorgsmaatregelen worden getroffen om te voorkomen dat infectie in behandelde dieren tij...

<ol>
	<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book. A Guide for The Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). 385, (2000).</li><li>Xu, C., Volkery, S., Siekmann, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intubation-based+anesthesia+for+long-term+time-lapse+imaging+of+adult+zebrafish.">Intubation-based anesthesia for long-term time-lapse imaging of adult zebrafish.</a> Nature Protocols. 10 (12), 2064-2073 (2015).</li><li>Kaufman, C. K., White, R. M., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetic+screening+in+the+zebrafish+embryo.">Chemical genetic screening in the zebrafish embryo.</a> Nature Protocols. 4 (10), 1422-1432 (2009).</li><li>Paul, S., Crump, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+on+skeletal+cell+plasticity+from+studying+jawbone+regeneration+in+zebrafish.">Lessons on skeletal cell plasticity from studying jawbone regeneration in zebrafish.</a> Bonekey Reports. 5, 853 (2016).</li><li>Witten, P. E., Harris, M. P., Huysseune, A., Winkler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+teleost+fish+provide+new+insights+into+human+skeletal+diseases.">Small teleost fish provide new insights into human skeletal diseases.</a> Methods in Cell Biology. 138, 321-346 (2017).</li><li>den Uyl, D., Bultink, I. E., Lems, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+glucocorticoid-induced+osteoporosis.">Advances in glucocorticoid-induced osteoporosis.</a> Current Rheumatology Reports. 13 (3), 233-240 (2011).</li><li>Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+high+content,+in+vivo+model+of+glucocorticoid-induced+osteoporosis.">A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis.</a> Biotechnology Journal. 1 (6), 651-655 (2006).</li><li>de Vrieze, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prednisolone+induces+osteoporosis-like+phenotype+in+regenerating+zebrafish+scales.">Prednisolone induces osteoporosis-like phenotype in regenerating zebrafish scales.</a> Osteoporosis International. 25 (2), 567-578 (2014).</li><li>Pasqualetti, S., Congiu, T., Banfi, G., Mariotti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alendronate+rescued+osteoporotic+phenotype+in+a+model+of+glucocorticoid-induced+osteoporosis+in+adult+zebrafish+scale.">Alendronate rescued osteoporotic phenotype in a model of glucocorticoid-induced osteoporosis in adult zebrafish scale.</a> International Journal Of Experimental Pathology. 96 (1), 11-20 (2015).</li><li>Geurtzen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+Suppressive+and+Bone+Inhibitory+Effects+of+Prednisolone+in+Growing+and+Regenerating+Zebrafish+Tissues.">Immune Suppressive and Bone Inhibitory Effects of Prednisolone in Growing and Regenerating Zebrafish Tissues.</a> Journal of Bone and Mineral Research. , (2017).</li><li>Geurtzen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+osteoblasts+dedifferentiate+in+response+to+traumatic+bone+injury+in+the+zebrafish+fin+and+skull.">Mature osteoblasts dedifferentiate in response to traumatic bone injury in the zebrafish fin and skull.</a> Development. 141 (11), 2225-2234 (2014).</li><li>Matthews, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthesia+and+euthanasia+in+zebrafish.">Anesthesia and euthanasia in zebrafish.</a> Institute of Laboratory Animal Resources Journal. 53 (2), 192-204 (2012).</li><li>Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf+signaling+instructs+position-dependent+growth+rate+during+zebrafish+fin+regeneration.">Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration.</a> Development. 132, 5173-5183 (2005).</li><li>Hirasawa, T., Kuratani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+vertebrate+skeleton:+morphology,+embryology,+and+development.">Evolution of the vertebrate skeleton: morphology, embryology, and development.</a> Zoological Letters. 1, 2 (2015).</li><li>Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+of+neuroepithelial-like+and+radial+glia-like+progenitor+cells+in+cerebellar+regeneration.">Distinct roles of neuroepithelial-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration.</a> Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).</li><li>Knopf, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerates+via+Dedifferentiation+of+Osteoblasts+in+the+Zebrafish+Fin.">Regenerates via Dedifferentiation of Osteoblasts in the Zebrafish Fin.</a> Developmental Cell. 20 (5), 713-724 (2011).</li><li>van Eeden, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+affecting+somite+formation+and+patterning+in+the+zebrafish,+Danio+rerio.">Mutations affecting somite formation and patterning in the zebrafish, Danio rerio.</a> Development. 123, 153-164 (1996).</li><li>Walker, M. B., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-color+acid-free+cartilage+and+bone+stain+for+zebrafish+larvae.">A two-color acid-free cartilage and bone stain for zebrafish larvae.</a> Biotechnic &amp; Histochemistry. 82 (1), 23-28 (2007).</li><li>Kyritsis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+inflammation+initiates+the+regenerative+response+in+the+adult+zebrafish+brain.">Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain.</a> Science. 338 (6112), 1353-1356 (2012).</li><li>Oppedal, D., Goldsmith, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+screen+to+identify+novel+inhibitors+of+fin+regeneration+in+zebrafish.">A chemical screen to identify novel inhibitors of fin regeneration in zebrafish.</a> Zebrafish. 7 (1), 53-60 (2010).</li><li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish.">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).</li><li>Spoorendonk, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+and+Cyp26b1+are+critical+regulators+of+osteogenesis+in+the+axial+skeleton.">Retinoic acid and Cyp26b1 are critical regulators of osteogenesis in the axial skeleton.</a> Development. 135 (22), 3765-3774 (2008).</li><li>Gioia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chaperone+activity+of+4PBA+ameliorates+the+skeletal+phenotype+of+Chihuahua,+a+zebrafish+model+for+dominant+osteogenesis+imperfecta.">The chaperone activity of 4PBA ameliorates the skeletal phenotype of Chihuahua, a zebrafish model for dominant osteogenesis imperfecta.</a> Human Molecular Genetics. 26 (15), 2897-2911 (2017).</li><li>Fiedler, I. A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severely+impaired+bone+material+quality+in+Chihuahua+zebrafish+resembles+classical+dominant+human+osteogenesis+imperfecta.">Severely impaired bone material quality in Chihuahua zebrafish resembles classical dominant human osteogenesis imperfecta.</a> Journal of Bone and Mineral Research. , (2018).</li><li>Fisher, S., Jagadeeswaran, P., Halpern, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiographic+analysis+of+zebrafish+skeletal+defects.">Radiographic analysis of zebrafish skeletal defects.</a> Developmental Biology. 264 (1), 64-76 (2003).</li><li>Hayes, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+deformity+in+aged+zebrafish+is+accompanied+by+degenerative+changes+to+their+vertebrae+that+resemble+osteoarthritis.">Spinal deformity in aged zebrafish is accompanied by degenerative changes to their vertebrae that resemble osteoarthritis.</a> PLoS One. 8 (9), e75787 (2013).</li><li>Mitchell, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+osteoarthritis+genetics+in+zebrafish.">New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish.</a> Osteoarthritis Cartilage. 21 (2), 269-278 (2013).</li><li>Fleming, A., Sato, M., Goldsmith, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+in+vivo+screening+for+bone+anabolic+compounds+with+zebrafish.">High-throughput in vivo screening for bone anabolic compounds with zebrafish.</a> Journal of Biomolecular Screening. 10 (8), 823-831 (2005).</li><li>de Vrieze, E., Zethof, J., Schulte-Merker, S., Flik, G., Metz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+osteogenic+compounds+by+an+ex+vivo+sp7:luciferase+zebrafish+scale+assay.">Identification of novel osteogenic compounds by an ex vivo sp7:luciferase zebrafish scale assay.</a> Bone. 74, 106-113 (2015).</li></ol>

Zebravis hebben bewezen nuttig in skelet onderzoek in vele opzichten. Geselecteerde mutanten nabootsen aspecten van menselijke ziekten zoals osteogenesis imperfecta of artrose23,24,25,26,27, en zowel de larven als de schalen worden gebruikt om bot anabole stoffen in kleine molecuul schermen7,28,</...

Zebravis vertegenwoordigen een krachtige diermodel gewervelde ontwikkeling en ziekte te studeren. Dit is de wijten aan het feit dat ze zijn kleine dieren die zeer goed fokken en dat hun genoom volledig gesequenceerd en vatbaar voor manipulatie-1 is. Andere voordelen zijn de optie voor het uitvoeren van verdere levende imaging in verschillende stadia, met inbegrip van in vivo imaging van volwassen zebrafish2, en de mogelijkheid voor het uitvoeren van hoge-doorvoer drug schermen in zebrafish larven3. Bovendien, zebravis bezitten een hoge regeneratief vermogen in een verscheidenheid van organen en weefsels, waaronder bot, en dus dienen als een nuttig systeem te bestuderen skelet ziekte en repareren van4,5.
Glucocorticoide-geïnduceerde osteoporose (GIO) is een ziekte die het gevolg is van langdurige behandeling met glucocorticoïden, bijvoorbeeld in het kader van behandeling van het auto-immune ziekten zoals reumatoïde artritis of astma. GIO ontwikkelt zich in ongeveer 30% van de glucocorticoide-behandelde patiënten en vertegenwoordigt een belangrijke gezondheid kwestie6; Daarom is het belangrijk om te onderzoeken de impact bij immuunsuppressie op botweefsel in groot detail. In de afgelopen jaren een scala aan zebrafish modellen die zich bezighouden met de pathogenese van GIO zijn ontwikkeld. Glucocorticoide-gemedieerde botverlies heeft zijn geïnduceerd in zebrafish larven, bijvoorbeeld, die hebben geleid tot de identificatie van achteraf verbindingen verhoging van de botmassa in een drug scherm7. Bovendien glucocorticoide-geïnduceerde bot remmende effecten hebben is geïmiteerd zebrafish schalen zowel in vitro als in vivo8,9. Deze testen zijn erg overtuigend benaderingen, met name als het gaat om de identificatie van nieuwe immunosuppressieve en bot anabole drugs. Echter zij slechts gedeeltelijk rekening wordt gehouden met de endoskeleton en niet zijn uitgevoerd in een regeneratieve context. Dus, laat ze niet het onderzoek van glucocorticoide-gemedieerde effecten tijdens snelle modi van volwassen, regeneratieve biomineralisatie.
Hier presenteren we een protocol waarmee onderzoekers glucocorticoide-gemedieerde effecten op volwassen zebrafish botten regeneratie ondergaan te bestuderen. Letsel modellen omvatten gedeeltelijke amputatie van de zebravis caudal fin, Schedeltrepanatie van de schedel, alsmede de oprichting van fin ray fracturen (figuur 1A-1 C), en worden gecombineerd met glucocorticoide blootstelling via incubatie (figuur 1E ). Onlangs hebben we een deel van dit protocol gebruikt om te beschrijven de gevolgen van blootstelling aan de prednisolon, één van de algemeen voorgeschreven corticosteroïd drugs, op volwassen zebrafish fin en schedel bot10regenereren. In zebrafish leidt prednisolon administratie tot verminderde osteoblast proliferatie, onvolledige osteoblast differentiatie en snelle inductie van apoptosis in de monocyt/macrofaag afkomst10. In dit protocol, ook beschrijven we hoe fracturen kunnen worden ingevoerd in één bony fin ray segmenten11, zoals deze aanpak nuttig zijn kan bij de studie van glucocorticoide-gemedieerde effecten op bot die zich kunnen voordoen tijdens de reparatie van de breuk. De methoden die hier gepresenteerd zal bijdragen tot verdere adres onderliggende mechanismen van glucocorticoide actie in snel herstel van bot en kunnen ook worden gebruikt in andere instellingen van systemische drug administration in de context van zebravis weefselregeneratie.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Prednisolone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt forceps</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>BD027R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Braun</td>
			<td>5518059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>840004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection needle (0.3x13 mm)</td>
			<td>BD Beckton Dickinson</td>
			<td>30400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro drill</td>
			<td>Cell Point Scientific</td>
			<td>67-1000</td>
			<td>distributed e.g. by Harvard Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel burrs (0.5 &#181;m diameter)</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>19007-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artemia ssp.</td>
			<td>Sanders</td>
			<td>425GR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette (plastic, Pastette)</td>
			<td>Alpha Labs</td>
			<td>LW4111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin red S powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian blue 8 GX</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16 FA</td>
			<td>with QIMAGING RETIGA-SRV camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MVX10</td>
			<td>with Olympus DP71 or DP80 camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adult zebrafish injury models to study the effects of prednisolone in regenerating bone tissue

Zebravis kunnen verschillende organen, met inbegrip van de aanhangsels (vinnen) regenereren na amputatie. Het gaat hierbij om de regeneratie van bot, die binnen ongeveer twee weken na verwonding verrot. Bovendien, zebravis kunnen genezen been snel na Schedeltrepanatie van de schedel, en repareren van fracturen die gemakkelijk kunnen worden ingevoerd in zebrafish bony fin rays. Deze schade assays vertegenwoordigen haalbaar experimentele paradigma's voor het testen van het effect van door de overheid gereguleerde drugs over de snelle vorming van bot. Hier beschrijven we het gebruik van deze 3 letsel modellen en hun gecombineerd gebruik met systemische glucocorticoide behandeling, die bot remmende en immunosuppressieve effecten oefent. Wij bieden een workflow op hoe te bereiden voor immunosuppressieve behandeling in volwassen zebrafish, het uitvoeren van fin amputatie, Schedeltrepanatie van calvarial beenderen en fracturen van de fin, illustreren en beschrijven hoe het gebruik van glucocorticoïden is van invloed op de vorming van zowel bot Botcellen en cellen van de monocyt/macrofaag afkomst als onderdeel van aangeboren immuniteit in botweefsel.

Het protocol hier gepresenteerd is herhaaldelijk gebruikt voor het opwekken van snelle biomineralisatie in de loop van de regeneratie van de zebravis fin en schedel10,11,16. In combinatie met de onderhavige methode van toediening van prednisolon, kunnen studies over de prednisolon effecten tijdens bot regeneratie worden nagestreefd. Bijvoorbeeld, kunnen studies over biomineralisatie en mineralisa...

Watch this Scientific Journal Video about Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue at JoVE.com

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Volwassen Zebrafish letsel modellen te bestuderen van de effecten van prednisolon in het herstel van botweefsel

Hier beschrijven we 3 volwassen zebrafish letsel modellen en hun gecombineerd gebruik met immunosuppressieve medicamenteuze behandeling. Wij bieden begeleiding over de beeldvorming van het herstel van de weefsels en bot mineralisatie daarin opsporen.

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van immunosuppressieve therapeutische interventie voor het bestuderen van de nadelige effecten van geneesmiddelen op weefselregeneratie, met name in botten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het combineert verleden modellen van Zebrafish bot regeneratie met systemische blootstelling aan geneesmiddelen door onderdompeling van de gewonde Zebrafish in drug aangevuld viswater. Voordat u met de procedure begint, bedekte autoclave één aluminiumfolie 600 milliliter bekerglas per Zebrafish en een passend aantal glazen flessen viswater voor het experiment en bereidt het immunosuppressieve medicijn voor in experimentele controleoplossingen van belang.Voor een amputatie letsel, gebruik botte tangen om zorgvuldig plaats een verdoofde Zebrafish op zijn laterale kant op de ingeverserde deksel van een 100 millimeter petrischaal en gebruik een scalpel om 50% van de vin resect. Plaats vervolgens de vis in een autoclaved beker met 300 milliliter viswater aangevuld met de juiste experimentele agent en bedek het bekerglas met folie om te voorkomen dat Zebrafish ontsnappen. Om een fin fractuur letsel te induceren, plaats een verdoofde Zebrafish op zijn laterale kant in een 100 millimeter agarose gecoate petrischaal onder een ontleden microscoop en duw een injectie naald iets in een benige vin straal segment totdat een scheur verschijnt.Het is belangrijk om niet te veel breuken in de vin te introduceren, omdat dit de stabiliteit sterk zou kunnen schaden. Breng de vis vervolgens over in een autoclaved beker met 300 milliliter viswater aangevuld met het juiste experimentele middel. Om een calvarial schedelletsel te genereren, houd een verdoofde Zebrafish in de rechte positie, zodat de calvarial botten gemakkelijk worden gevisualiseerd onder een dissectie microscoop.Plaats een roterende microboor uitgerust met een boorbit van 500 micrometer over het midden van het frontale bot en raak het bot voorzichtig aan om een gat te maken ter grootte van de micro boorbraam. Het is van cruciaal belang om de boor niet zijdelings te verplaatsen tijdens het produceren van de schade en onmiddellijk te stoppen zodra de weerstand van het weefsel daalt. Anders zullen de hersenen beschadigd raken.Plaats vervolgens de vis in een autoclaved beker met 300 milliliter viswater aangevuld met de juiste experimentele agent. Verander het water in de bekers dagelijks door de Zebrafish en het viswater over te brengen in een geschikte tijdelijke container en het bekerglas bij te vullen met vers medicijn aangevuld viswater. Gebruik dan een visnet om de Zebrafish terug te brengen naar zijn beker.Voor behandelingen van maximaal twee dagen in totaal, niet voeden de Zebrafish. Tijdens langere experimenten, voeden de Zebrafish met 0,5 tot een milliliter uitgebroed Artemia SSP elke tweede dag. Voor fin letsel analyse, oogst de fijne en gebruik fijne tangen om de vin te grijpen aan een rand van de stomp.Gebruik een tweede paar tangen om de tegenovergestelde stomp rand te grijpen en iets druk op het weefsel op de bodem van de schotel die koude 4% PFA bevat gedurende 10 tot 20 seconden. Herhaal de vinafvlakking indien nodig. De vin moet nu plat liggen zonder curling.Voor langdurige monsteropslag na fixatie, was het weefsel met drie PBS-wasbeurten van 20 minuten en een opgaande methanolserie. De monsters kunnen vervolgens worden opgeslagen in 100% methanol bij min 20 graden Celsius. Voor Alizarin Red kleuring, rehydraat methanol opgeslagen monsters in een dalende methanol serie gevolgd door twee 20 minuten wasbeurten in PBS en een vijf minuten wassen in gedeïsized water.Voeg na de laatste wasbeurt alizarin rode oplossing toe aan het monsterweefsel en ontcubeer het monster bij kamertemperatuur met schommelen voor de juiste kleuringsperiode. Om de monsters te wissen, behandel het weefsel met de afnemende 1%kaliumhydroxide glycerol serie. Bewaar de monsters vervolgens in een 0-1%kaliumhydroxide tot 80%glyceroloplossing en monteer de weefsels met 80%glycerol voor het verbeelden.Voor Calcein kleuring, uitbroeden tot drie Zebrafish tegelijkertijd in 100 millimeter Calcein oplossing gedurende 20 minuten in een glazen beker bedekt met aluminiumfolie. Breng de Zebrafish aan het einde van de incubatie naar een container met viswater en laat de vissen kort zwemmen voordat ze naar een nieuwe container viswater worden overgebracht. Na 20 minuten in de tweede beker om levende beelden van vin regenereert te verwerven, plaats een verdoofde Zebrafish op een agarose gecoate Petri schotel en beeld de vin door stereo microscopie.Om beelden van de regenererende schedelbotten te verwerven, plaatst u de Zebrafish rechtop in een spons en beeldt u de schedel door fluorescentiemicroscopie in beeld. Behandeling met Prednisolone, vergelijkbaar met andere glucocorticoïden, leidt tot een algehele remming van vinregeneratie, waaronder botvorming zoals gedetecteerd door Alizarin Rode kleuring van vast staartvinweefsel. Ook heeft het medicijn een vertragend effect op de sluiting van calvarialschedelletsel.Als gevolg van immunosuppressie kunnen verminderde macrofaagnummers ook worden gedetecteerd door immunohistochemie op bevroren weefselsecties, zoals blijkt uit anti-mCherry en anti-GFP-antilichaamvlekken en transgene MPEG-1 mCherry gekruist met Osterix NGFP Zebrafish op zebravisschedelweefselmonsters van met Prednisolone behandelde dieren. Tijdens een poging tot deze procedures is het belangrijk om de variabiliteit in de botregeneratie snelheid te minimaliseren door het uitvoeren van de schade essays in een zeer reproduceerbare manier. Het is ook van cruciaal belang voor eenpersoonshuis Zebrafish in autoclaved bekers met autoclaved viswater om microbiële infectie te voorkomen.Dit protocol zal helpen om de onderliggende mechanismen van glucocorticoïde actie verder aan te pakken. Bijvoorbeeld, in de context van glucocorticoïde geïnduceerde osteoporose en kan ook worden aangepast voor het gebruik van andere geneesmiddelen en andere Zebrafish bot.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

Nier Regeneratie in Adult zebravis door Gentamicin geïnduceerd letsel

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Mechanische vatverwonding in zebravis embryo&#39;s

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

Gebruik van de Teton systeem om te studeren moleculaire mechanismen van zebravis Regeneratie

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

Protocollen voor het analyseren van de rol van Paneth Cellen in het regenereren van de muizen darm met behulp van voorwaardelijke<em&gt; Cre-lox</em&gt; Mouse Modellen

The epithelial surface of the mammalian intestine is a dynamic tissue that renews every 3 - 7 days. Understanding this renewal process identified a ...

Combining Intravital Fluorescent Microscopy (IVFM) with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Combining Intravital Fluorescent Microscopy IVFM with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Intravital Fluorescent microscopie (IVFM) te combineren met genetische modellen om te studeren van Engraftment dynamiek van hematopoietische cellen aan het beenmerg Niches

Increasing evidence indicates that normal hematopoiesis is regulated by distinct microenvironmental cues in the BM, which include specialized cellular ...

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

Het bouwen van Finite Element modellen te onderzoeken zebravis Jaw biomechanica

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In vivo beeldvorming van transgene Gene Expression Individuele retinale voorouders in chimère zebravis embryo&#39;s to Cell Nonautonomous Invloeden Studie

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish

Histologische analyses van acute alcoholische leverbeschadiging bij zebravis

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissectie en immunefluorescentie kleuring van Mushroom lichaam en fotoreceptor neuronen in de hersenen van de volwassen Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...