Name: adult zebrafish injury models to study the effects of prednisolone in regenerating bone tissue
Uploaded: 2018-10-18T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue at JoVE.com

Cette étude a été financée par une subvention de la centre de régénérative thérapies Dresde (« poisson-zèbre comme un modèle à élucider les mécanismes de la perte osseuse induite par les glucocorticoïdes ») et, en outre, grâce à une subvention de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (Transregio 67, projet 387653785) au FK. Nous sommes très reconnaissants à Jan Kaslin et Avinash Chekuru pour leurs conseils et leur aide sur l’exécution de trépanation du cranienne et fractures dans les rayons des nageoires osseuses. Des expériences ont été conçus, effectués et analysés par KG et FK. FK a écrit le manuscrit. Nous tenons également à remercier Katrin Lambert, Nicole Cudak et autres membres des laboratoires Knopf et marque pour une assistance technique et de la discussion. Notre gratitude va également Marika Fischer et Jitka Michling pour soins excellents poissons et Henriette Knopf et Josh Currie pour la relecture du manuscrit.

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par la Landesdirektion de Dresde (numéros de permis : AZ 24D-9168.11-1/2008-1, 24-9168.11-1/2011-52 AZ, AZ 24-9168.11-1/2013-5, AZ 24-9168.11-1/2013-14, AZ DD24.1-5131/354/87).
1. préparation des matériaux et des Solutions
NOTE : Prednisolone, comme autres glucocorticoïdes, mène à l’immunosuppression. Ainsi, la précaution doit être prise pour prévenir l’infection chez les animaux traités pendant ...

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	<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book. A Guide for The Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). 385, (2000).</li><li>Xu, C., Volkery, S., Siekmann, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intubation-based+anesthesia+for+long-term+time-lapse+imaging+of+adult+zebrafish.">Intubation-based anesthesia for long-term time-lapse imaging of adult zebrafish.</a> Nature Protocols. 10 (12), 2064-2073 (2015).</li><li>Kaufman, C. K., White, R. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+and+Cyp26b1+are+critical+regulators+of+osteogenesis+in+the+axial+skeleton.">Retinoic acid and Cyp26b1 are critical regulators of osteogenesis in the axial skeleton.</a> Development. 135 (22), 3765-3774 (2008).</li><li>Gioia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chaperone+activity+of+4PBA+ameliorates+the+skeletal+phenotype+of+Chihuahua,+a+zebrafish+model+for+dominant+osteogenesis+imperfecta.">The chaperone activity of 4PBA ameliorates the skeletal phenotype of Chihuahua, a zebrafish model for dominant osteogenesis imperfecta.</a> Human Molecular Genetics. 26 (15), 2897-2911 (2017).</li><li>Fiedler, I. A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severely+impaired+bone+material+quality+in+Chihuahua+zebrafish+resembles+classical+dominant+human+osteogenesis+imperfecta.">Severely impaired bone material quality in Chihuahua zebrafish resembles classical dominant human osteogenesis imperfecta.</a> Journal of Bone and Mineral Research. , (2018).</li><li>Fisher, S., Jagadeeswaran, P., Halpern, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiographic+analysis+of+zebrafish+skeletal+defects.">Radiographic analysis of zebrafish skeletal defects.</a> Developmental Biology. 264 (1), 64-76 (2003).</li><li>Hayes, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+deformity+in+aged+zebrafish+is+accompanied+by+degenerative+changes+to+their+vertebrae+that+resemble+osteoarthritis.">Spinal deformity in aged zebrafish is accompanied by degenerative changes to their vertebrae that resemble osteoarthritis.</a> PLoS One. 8 (9), e75787 (2013).</li><li>Mitchell, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+osteoarthritis+genetics+in+zebrafish.">New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish.</a> Osteoarthritis Cartilage. 21 (2), 269-278 (2013).</li><li>Fleming, A., Sato, M., Goldsmith, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+in+vivo+screening+for+bone+anabolic+compounds+with+zebrafish.">High-throughput in vivo screening for bone anabolic compounds with zebrafish.</a> Journal of Biomolecular Screening. 10 (8), 823-831 (2005).</li><li>de Vrieze, E., Zethof, J., Schulte-Merker, S., Flik, G., Metz, J. 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Poisson zèbre sont avérés utiles pour la recherche squelettique à bien des égards. Des mutants sélectionnés reproduisent les aspects des maladies humaines telles que l’ostéogenèse imparfaite ou arthrose23,24,25,26,27, et des larves ainsi que des échelles sont utilisées pour identifier les composés anabolisants osseux en petites molécules écrans...

Poisson zèbre représentent un puissant modèle animal pour étudier la maladie et du développement des vertébrés. Cela est dû au fait qu’ils sont des petits animaux qui se reproduisent très bien et que leur génome est entièrement séquencé et ouvert aux manipulations1. D’autres avantages incluent la possibilité d’effectuer une imagerie live continue à différentes étapes, y compris en vivo imagerie du poisson-zèbre adulte2et la capacité d’exécuter des écrans de drogues à haut débit dans les larves de poisson zèbre3. En outre, poisson zèbre possèdent une grande capacité régénératrice dans une variété d’organes et de tissus, y compris les os et donc constituer un système utile pour étudier les maladies squelettiques et réparer4,5.
L’ostéoporose induite par les glucocorticoïdes (GIO) est une maladie qui résulte d’un traitement à long terme avec des glucocorticoïdes, par exemple dans le cadre du traitement des maladies auto-immunes telles que de l’asthme ou l’arthrite rhumatoïde. GIO se développe chez environ 30 % des patients traités par glucocorticoïdes et représente une édition de santé majeur6; par conséquent, il est important d’étudier l’impact de l’immunosuppression sur tissu osseux dans les moindres détails. Ces dernières années une variété de modèles de poisson-zèbre traitant de la pathogenèse du SCAD ont été développés. La perte osseuse médiée par les glucocorticoïdes a été induite chez les larves de poisson zèbre, par exemple, qui a conduit à l’identification des composés avertissent augmente la masse osseuse chez un médicament écran7. En outre, les effets inhibiteurs osseuse induite par les glucocorticoïdes ont été imités en écailles de poisson-zèbre fois in vitro et in vivo,8,9. Ces tests sont très convaincants des approches, surtout quand il s’agit d’identifier de nouveaux médicaments anabolisants immunosuppresseurs et OS. Cependant, ils seulement partiellement tiennent compte de l’endosquelette et n’ont pas été effectuées dans un contexte régénératrice. Ainsi, ils ne permettent pas l’enquête des effets médiés par les glucocorticoïdes lors des modes rapides de la formation osseuse adulte, régénératrice.
Nous présentons ici un protocole permettant aux chercheurs d’étudier les effets médiés par les glucocorticoïdes sur OS de poisson-zèbre adulte en cours de régénération. Modèles de lésion incluent amputation partielle de la nageoire caudale du poisson-zèbre, trépanation du crâne, ainsi que la création des fractures de ray nageoire (Figure 1 a-1 C) et sont combinés avec des glucocorticoïdes exposition via l’incubation (Figure 1E ). Nous avons récemment utilisé une partie du présent protocole pour décrire les conséquences de l’exposition à la prednisolone, un des médicaments couramment prescrits corticostéroïde, le poisson-zèbre adulte régénérant nageoire et crâne OS10. Chez le poisson zèbre, administration de prednisolone entraîne la prolifération ostéoblastique une diminution, la différenciation ostéoblastique incomplète et rapide induction de l’apoptose dans la lignée de monocytes/macrophages10. Dans le présent protocole, on décrit aussi comment les fractures peuvent être introduits dans seul aileron osseuses ray segments11, que cette approche peut être utile lorsque l'on étudie les effets médiés par les glucocorticoïdes sur l’os qui se produisent au cours de la réparation de la fracture. Les méthodes présentées ici vont aidera à résoudre qui sous-tendent les mécanismes d’action des glucocorticoïdes dans la régénération osseuse de rapidement et peuvent également être employées dans d’autres contextes d’administration systémique de médicaments dans le cadre de la régénération tissulaire de poisson-zèbre.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Prednisolone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt forceps</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>BD027R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Braun</td>
			<td>5518059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>840004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection needle (0.3x13 mm)</td>
			<td>BD Beckton Dickinson</td>
			<td>30400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro drill</td>
			<td>Cell Point Scientific</td>
			<td>67-1000</td>
			<td>distributed e.g. by Harvard Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel burrs (0.5 &#181;m diameter)</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>19007-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artemia ssp.</td>
			<td>Sanders</td>
			<td>425GR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette (plastic, Pastette)</td>
			<td>Alpha Labs</td>
			<td>LW4111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin red S powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian blue 8 GX</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16 FA</td>
			<td>with QIMAGING RETIGA-SRV camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MVX10</td>
			<td>with Olympus DP71 or DP80 camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adult zebrafish injury models to study the effects of prednisolone in regenerating bone tissue

Poisson zèbre sont capables de régénérer des divers organes, y compris les appendices (nageoires) suite à une amputation. Il s’agit de la régénération des os, ce qui repousse dans environ deux semaines après une blessure. En outre, poisson zèbre sont capables de guérir les os rapidement après trépanation du crâne et réparer les fractures qui peuvent être facilement introduits dans les rayons des nageoires osseuses poisson zèbre. Ces tests de blessures représentent des paradigmes expérimentaux faisables pour tester l’effet des médicaments administrés sur la formation rapide d’os. Nous décrivons ici l’utilisation de ces modèles de 3 lésions et leur utilisation combinée avec un traitement aux glucocorticoïdes systémiques, qui exerce des effets inhibiteurs et immunosuppressives osseuse. Nous fournissons un flux de travail sur la façon de préparer un traitement immunosuppresseur chez le poisson zèbre adulte, montrent comment effectuer la nageoire amputation, trépanation de substance OS et fractures de la nageoire et décrire comment l’utilisation des glucocorticoïdes affecte les deux os formant les ostéoblastes et les cellules de la lignée monocyte/macrophage dans le cadre de l’immunité innée dans le tissu osseux.

Le protocole présenté ici a été utilisé à plusieurs reprises pour induire la formation osseuse rapide au cours de la régénération du poisson-zèbre nageoire et crâne10,11,16. En combinaison avec la méthode présentée de l’administration de prednisolone, études sur les effets de la prednisolone pendant la régénération osseuse peuvent être poursuivis. Par exemple, les études sur...

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Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Modèles de lésion du poisson-zèbre adulte pour étudier les effets de la Prednisolone dans la régénération de tissu osseux

Nous décrivons ici 3 modèles de lésion de poisson-zèbre adulte et leur utilisation combinée avec un traitement immunosuppresseur. Nous fournissons des conseils sur l’imagerie de la régénération des tissus et sur la détection de la minéralisation des os qui y sont.

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’intervention thérapeutique immunosuppressrice pour étudier les effets néfastes des médicaments sur la régénération des tissus, en particulier, dans les os. Le principal avantage de cette technique est qu’elle combine les modèles passés de régénération osseuse du poisson zèbre avec l’exposition systémique aux médicaments par immersion du poisson zèbre blessé dans de l’eau de poisson complétée par des médicaments. Avant de commencer la procédure, autoclave une feuille d’aluminium recouvert de 600 millilitres bécher par poisson zèbre et un nombre approprié de bouteilles en verre d’eau de poisson pour l’expérience et de préparer le médicament immunosuppresseur dans des solutions de contrôle expérimental d’intérêt.Pour une blessure d’amputation, utilisez des forceps contondants pour placer soigneusement un poisson zèbre anesthésié sur son côté latéral sur le couvercle inversé d’une boîte de Pétri de 100 millimètres et utilisez un scalpel pour réséquer 50 % de la nageoire. Placez ensuite le poisson dans un bécher autoclavé contenant 300 millilitres d’eau de poisson complété par un agent expérimental approprié et recouvrez le bécher de papier d’aluminium pour empêcher le poisson zèbre de s’échapper. Pour induire une blessure causée par une fracture de la nageoire, placez un poisson zèbre anesthésié sur le côté latéral dans une boîte de Pétri enduite d’agarose de 100 millimètres sous un microscope disséquant et poussez légèrement une aiguille d’injection dans un segment osseux de rayon d’aileron jusqu’à ce qu’une fissure apparaisse.Il est important d’introduire pas trop de fractures dans la nageoire, car cela pourrait grandement nuire à la stabilité. Ensuite, transférez le poisson dans un bécher autoclavé contenant 300 millilitres d’eau de poisson complété par l’agent expérimental approprié. Pour générer une lésion calvariale du crâne, maintenez un poisson zèbre anesthésié en position verticale afin que les os calvariaux soient facilement visualisés au microscope à dissection.Placez une micro-perceuse rotative équipée d’un foret de 500 micromètres au-dessus du centre de l’os frontal et touchez doucement l’os pour produire un trou de la taille de la bavure de forage micro. Il est essentiel de ne pas déplacer la perceuse latéralement tout en produisant la blessure et de s’arrêter immédiatement une fois que la résistance du tissu diminue. Sinon, le cerveau sera endommagé.Placez ensuite le poisson dans un bécher autoclavé contenant 300 millilitres d’eau de poisson complété par l’agent expérimental approprié. Changez l’eau dans les béchers tous les jours en transférant le poisson zèbre et l’eau de poisson dans un récipient temporaire approprié et en remplissant le bécher avec de l’eau de poisson fraîche complétée par la drogue. Ensuite, utilisez un filet de poisson pour retourner le poisson zèbre à son bécher.Pour les traitements d’une durée totale de deux jours, ne nourrissez pas le poisson zèbre. Au cours d’expériences plus longues, nourrir le poisson zèbre avec 0,5 à un millilitre d’Artemia SSP éclos tous les deux jours. Pour l’analyse des blessures aux nageoires, récolter l’amende et utiliser des forceps fins pour saisir l’aileron à un bord de la souche.Utilisez une deuxième paire de forceps pour saisir le bord opposé de la souche et appuyez légèrement sur le tissu sur le fond du plat qui contient froid 4%PFA pendant 10 à 20 secondes. Répétez l’aplatissement des nageoires au besoin. La nageoire doit maintenant être à plat sans curling.Pour l’entreposage à long terme de l’échantillon après la fixation, lavez le tissu avec trois lavages PBS de 20 minutes et une série ascendante de méthanol. Les échantillons peuvent ensuite être stockés dans 100% méthanol à moins 20 degrés Celsius. Pour la coloration rouge Alizarin, réhydrater les échantillons de méthanol stockés dans une série descendante de méthanol suivie de deux lavages de 20 minutes dans PBS et d’un lavage de cinq minutes dans de l’eau déionisée.Après le dernier lavage, ajouter alizarin solution rouge au tissu échantillonné et incuber l’échantillon à température ambiante avec basculement pour la période de coloration appropriée. Pour effacer les échantillons, traiter le tissu avec la diminution de 1% potassium hydroxyde glycérol série. Ensuite, stocker les échantillons dans un à un hydroxyde de potassium 0,1% à 80% solution glycérol et monter les tissus avec 80% glycérol pour imaginer.Pour la coloration de calcéine, incuber jusqu’à trois poissons zèbres simultanément dans 100 millimètres de solution Calcéine pendant 20 minutes dans un bécher en verre recouvert de papier d’aluminium. À la fin de l’incubation, transférer le poisson zèbre dans un récipient d’eau de poisson et laisser les poissons nager brièvement avant de les transférer dans un nouveau récipient d’eau de poisson. Après 20 minutes dans le deuxième bécher pour acquérir des images en direct de la nageoire se régénère, placez un poisson zèbre anesthésié sur une boîte de Pétri enduite d’agarose et imagez la nageoire par microscopie stéréo.Pour obtenir des images des os régénérants du crâne, placez le poisson zèbre droit dans une éponge et imagez le crâne par microscopie par fluorescence. Le traitement par Prednisolone, semblable à d’autres glucocorticoïdes, conduit à une inhibition globale de la régénération des nageoires, y compris la formation osseuse telle que détectée par Alizarin Red colorant le tissu caudal fixe de nageoire. De même, le médicament a un effet retardant sur la fermeture calvariale des lésions du crâne.En raison de l’immunosuppression, les nombres réduits de macrophage peuvent également être détectés par immunohistochimie sur des sections congelées de tissu comme démontré en utilisant la coloration anti-mCherry et anti-GFP anticorps et transgénique MPEG-1 mCherry croisé avec Osterix NGFP Zebrafish sur des échantillons de tissu de crâne de Zebrafish des animaux traités prednisolone. Tout en essayant ces procédures, il est important de minimiser la variabilité de la vitesse de régénération osseuse en effectuant les essais de blessure d’une manière hautement reproductible. Il est également crucial pour la maison unique Zebrafish dans les beakers autoclavés contenant de l’eau de poisson autoclavée afin d’éviter l’infection microbienne.Ce protocole aidera à aborder davantage les mécanismes sous-jacents de l’action glucocorticoïde. Par exemple, dans le contexte de l’ostéoporose induite par le glucocorticoïde et peut également être adapté à l’utilisation d’autres médicaments et d’autres os zebrafish.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

Régénération rénale à l&#39;âge adulte poisson zèbre par gentamicine blessures induites

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Recherche

Biologie du développement

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Blessure mécanique des bateaux dans embryons de poissons zèbres

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

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Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

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Protocoles pour analyser le rôle des cellules de Paneth dans la régénération de l&#39;intestin murin utilisant conditionnelle<em&gt; Cre-lox</em&gt; Modèles de souris

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