Name: adult zebrafish injury models to study the effects of prednisolone in regenerating bone tissue
Uploaded: 2018-10-18T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי מענק מרכז של משובי טיפולים דרזדן ("דג זברה כמודל לפענח את המנגנונים של אובדן עצם המושרה glucocorticoid"), בנוסף על ידי מענק של פתוח (Transregio 67, פרויקט 387653785) כדי FK. אנחנו מאוד אסירי תודה. Jan Kaslin, Chekuru אווינאש עבור שלהם הדרכה וסיוע על ביצוע trepanation של calvariae, שברים סנפיר גרמית קרני הניסויים היו תוכנן, שבוצעה, נותחו על ידי ק ג, FK. FK כתב היד. כן נרצה להודות Katrin למברט, ניקול Cudak וחברים אחרים של מעבדות קנופף וברנד לקבלת סיוע טכני ודיון. תודתנו גם הולך אל פישר מריקה, Jitka Michling לטיפול דגים מעולה, הנרייטה קנופף, ג'וש קורי להגהת כתב היד.

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על-ידי דרזדן Landesdirektion (היתר מספרים: AZ 24D-9168.11-1/2008-1, AZ 24-9168.11-1/2011-52, AZ 24-9168.11-1/2013-5, AZ 24-9168.11-1/2013-14, AZ DD24.1-5131/354/87).
1. הכנת חומרים ופתרונות
הערה: Prednisolone, כמו אחרים glucocorticoids, מוביל החיסוני. לפיכך, אמצעי זהירות חייב להילקח כדי למנוע זיהום אצל מטופל?...

<ol>
	<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book. A Guide for The Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). 385, (2000).</li><li>Xu, C., Volkery, S., Siekmann, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intubation-based+anesthesia+for+long-term+time-lapse+imaging+of+adult+zebrafish.">Intubation-based anesthesia for long-term time-lapse imaging of adult zebrafish.</a> Nature Protocols. 10 (12), 2064-2073 (2015).</li><li>Kaufman, C. K., White, R. M., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetic+screening+in+the+zebrafish+embryo.">Chemical genetic screening in the zebrafish embryo.</a> Nature Protocols. 4 (10), 1422-1432 (2009).</li><li>Paul, S., Crump, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+on+skeletal+cell+plasticity+from+studying+jawbone+regeneration+in+zebrafish.">Lessons on skeletal cell plasticity from studying jawbone regeneration in zebrafish.</a> Bonekey Reports. 5, 853 (2016).</li><li>Witten, P. E., Harris, M. P., Huysseune, A., Winkler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+teleost+fish+provide+new+insights+into+human+skeletal+diseases.">Small teleost fish provide new insights into human skeletal diseases.</a> Methods in Cell Biology. 138, 321-346 (2017).</li><li>den Uyl, D., Bultink, I. E., Lems, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+glucocorticoid-induced+osteoporosis.">Advances in glucocorticoid-induced osteoporosis.</a> Current Rheumatology Reports. 13 (3), 233-240 (2011).</li><li>Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+high+content,+in+vivo+model+of+glucocorticoid-induced+osteoporosis.">A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis.</a> Biotechnology Journal. 1 (6), 651-655 (2006).</li><li>de Vrieze, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prednisolone+induces+osteoporosis-like+phenotype+in+regenerating+zebrafish+scales.">Prednisolone induces osteoporosis-like phenotype in regenerating zebrafish scales.</a> Osteoporosis International. 25 (2), 567-578 (2014).</li><li>Pasqualetti, S., Congiu, T., Banfi, G., Mariotti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alendronate+rescued+osteoporotic+phenotype+in+a+model+of+glucocorticoid-induced+osteoporosis+in+adult+zebrafish+scale.">Alendronate rescued osteoporotic phenotype in a model of glucocorticoid-induced osteoporosis in adult zebrafish scale.</a> International Journal Of Experimental Pathology. 96 (1), 11-20 (2015).</li><li>Geurtzen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+Suppressive+and+Bone+Inhibitory+Effects+of+Prednisolone+in+Growing+and+Regenerating+Zebrafish+Tissues.">Immune Suppressive and Bone Inhibitory Effects of Prednisolone in Growing and Regenerating Zebrafish Tissues.</a> Journal of Bone and Mineral Research. , (2017).</li><li>Geurtzen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+osteoblasts+dedifferentiate+in+response+to+traumatic+bone+injury+in+the+zebrafish+fin+and+skull.">Mature osteoblasts dedifferentiate in response to traumatic bone injury in the zebrafish fin and skull.</a> Development. 141 (11), 2225-2234 (2014).</li><li>Matthews, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthesia+and+euthanasia+in+zebrafish.">Anesthesia and euthanasia in zebrafish.</a> Institute of Laboratory Animal Resources Journal. 53 (2), 192-204 (2012).</li><li>Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf+signaling+instructs+position-dependent+growth+rate+during+zebrafish+fin+regeneration.">Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration.</a> Development. 132, 5173-5183 (2005).</li><li>Hirasawa, T., Kuratani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+vertebrate+skeleton:+morphology,+embryology,+and+development.">Evolution of the vertebrate skeleton: morphology, embryology, and development.</a> Zoological Letters. 1, 2 (2015).</li><li>Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+of+neuroepithelial-like+and+radial+glia-like+progenitor+cells+in+cerebellar+regeneration.">Distinct roles of neuroepithelial-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration.</a> Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).</li><li>Knopf, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerates+via+Dedifferentiation+of+Osteoblasts+in+the+Zebrafish+Fin.">Regenerates via Dedifferentiation of Osteoblasts in the Zebrafish Fin.</a> Developmental Cell. 20 (5), 713-724 (2011).</li><li>van Eeden, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+affecting+somite+formation+and+patterning+in+the+zebrafish,+Danio+rerio.">Mutations affecting somite formation and patterning in the zebrafish, Danio rerio.</a> Development. 123, 153-164 (1996).</li><li>Walker, M. B., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-color+acid-free+cartilage+and+bone+stain+for+zebrafish+larvae.">A two-color acid-free cartilage and bone stain for zebrafish larvae.</a> Biotechnic &amp; Histochemistry. 82 (1), 23-28 (2007).</li><li>Kyritsis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+inflammation+initiates+the+regenerative+response+in+the+adult+zebrafish+brain.">Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain.</a> Science. 338 (6112), 1353-1356 (2012).</li><li>Oppedal, D., Goldsmith, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+screen+to+identify+novel+inhibitors+of+fin+regeneration+in+zebrafish.">A chemical screen to identify novel inhibitors of fin regeneration in zebrafish.</a> Zebrafish. 7 (1), 53-60 (2010).</li><li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish.">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).</li><li>Spoorendonk, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+and+Cyp26b1+are+critical+regulators+of+osteogenesis+in+the+axial+skeleton.">Retinoic acid and Cyp26b1 are critical regulators of osteogenesis in the axial skeleton.</a> Development. 135 (22), 3765-3774 (2008).</li><li>Gioia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chaperone+activity+of+4PBA+ameliorates+the+skeletal+phenotype+of+Chihuahua,+a+zebrafish+model+for+dominant+osteogenesis+imperfecta.">The chaperone activity of 4PBA ameliorates the skeletal phenotype of Chihuahua, a zebrafish model for dominant osteogenesis imperfecta.</a> Human Molecular Genetics. 26 (15), 2897-2911 (2017).</li><li>Fiedler, I. A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severely+impaired+bone+material+quality+in+Chihuahua+zebrafish+resembles+classical+dominant+human+osteogenesis+imperfecta.">Severely impaired bone material quality in Chihuahua zebrafish resembles classical dominant human osteogenesis imperfecta.</a> Journal of Bone and Mineral Research. , (2018).</li><li>Fisher, S., Jagadeeswaran, P., Halpern, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiographic+analysis+of+zebrafish+skeletal+defects.">Radiographic analysis of zebrafish skeletal defects.</a> Developmental Biology. 264 (1), 64-76 (2003).</li><li>Hayes, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+deformity+in+aged+zebrafish+is+accompanied+by+degenerative+changes+to+their+vertebrae+that+resemble+osteoarthritis.">Spinal deformity in aged zebrafish is accompanied by degenerative changes to their vertebrae that resemble osteoarthritis.</a> PLoS One. 8 (9), e75787 (2013).</li><li>Mitchell, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+osteoarthritis+genetics+in+zebrafish.">New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish.</a> Osteoarthritis Cartilage. 21 (2), 269-278 (2013).</li><li>Fleming, A., Sato, M., Goldsmith, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+in+vivo+screening+for+bone+anabolic+compounds+with+zebrafish.">High-throughput in vivo screening for bone anabolic compounds with zebrafish.</a> Journal of Biomolecular Screening. 10 (8), 823-831 (2005).</li><li>de Vrieze, E., Zethof, J., Schulte-Merker, S., Flik, G., Metz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+osteogenic+compounds+by+an+ex+vivo+sp7:luciferase+zebrafish+scale+assay.">Identification of novel osteogenic compounds by an ex vivo sp7:luciferase zebrafish scale assay.</a> Bone. 74, 106-113 (2015).</li></ol>

דג זברה הוכיחו מועיל במחקר שלד לגבי רבים. מוטציות שנבחר לחקות היבטים של מחלות אנושיות כגון פרכת או דלקת מפרקים ניוונית23,24,25,26,27, הזחלים, כמו גם סולמות משמשות כדי לזהות העצם תרכובות סטרואידים אנבוליים ?...

דג זברה מייצגים במודל בעלי חיים רב עוצמה ללמוד פיתוח חוליות ומחלות. זה בשל העובדה כי הם חיות קטנות זה מתרבים טוב מאוד, כי הגנום שלהם הוא מלא ברצף, לבצע מניפולציה1. יתרונות נוספים כוללים את האפשרות לבצע הדמיה חיה המשך בשלבים שונים, לרבות ויוו הדמיה של דג זברה בוגרת2והיכולת לבצע תפוקה גבוהה סמים מסכי דג זברה הזחלים3. בנוסף, דג זברה בעלי קיבולת גבוהה משובי במגוון של איברים ורקמות כולל העצם, ובכך לשמש מערכת שימושי כדי ללמוד מחלת השלד ותיקון4,5.
אוסטאופורוזיס glucocorticoid-induced (ג'יו) היא מחלה הנובעת טיפול לטווח ארוך עם glucocorticoids, למשל במהלך טיפול מחלות אוטואימוניות כגון אסטמה או דלקת מפרקים שגרונית. ג'יו מתפתח אצל כ- 30% מהחולים שטופלו glucocorticoid ומייצגת בעיה בריאות ור6; לכן, חשוב לחקור את ההשפעה של החיסוני על רקמת העצם בפירוט רב. בשנים האחרונות פותחו מגוון דגמים דג זברה העוסקים בפתוגנזה של ג'יו. איבוד העצם בתיווך glucocorticoid יש כבר המושרה בדג זברה הזחלים, לדוגמה, אשר הובילה הזיהוי של תרכובות counteractive הגדלת מסת העצם אצל סמים מסך7. יתר על כן, עצם המושרה glucocorticoid מעכבות ההשפעות יש כבר חיקה של דג זברה מאזני גם במבחנה וגם ויוו8,9. מבחני אלה הם מאוד משכנע גישות, במיוחד כשמדובר הזיהוי של הרומן סמים אנבוליים לדיכוי המערכת החיסונית ועצמות. עם זאת, הם רק בחלקו לקחת בחשבון את השלד, לא בוצעו בהקשר משובי. לפיכך, הם אינם מאפשרים את חקירת glucocorticoid בתיווך ההשפעות במהלך מהיר מצבים של היווצרות העצם למבוגרים, משובי.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול המאפשר לחוקרים ללמוד glucocorticoid בתיווך ההשפעות על עצמות דג זברה מבוגרים שעברו התחדשות. פציעה מודלים כוללים קטיעה חלקית של סנפיר דג זברה סימטרית, trepanation של הגולגולת, כמו גם היצירה של פין ריי שברים (איור 1Aג-1), בשילוב עם חשיפה הדגירה ויה glucocorticoid (איור 1E ). השתמשנו לאחרונה חלק של פרוטוקול זה כדי לתאר את ההשלכות של חשיפה prednisolone, אחת התרופות הסטרואידים שנקבע בדרך כלל, על דג זברה בוגרת התחדשות העצם סנפיר והגולגולת10. דג זברה, מוביל מינהל prednisolone אוסטאובלסט ירד התפשטות, בידול אוסטאובלסט לא שלם של אינדוקציה מהירה של אפופטוזיס שושלת היוחסין מונוציט/מקרופאג10. ב פרוטוקול זה, גם נתאר כמה שברים יכול להיות מוחדרים יחידה פין גרמית ריי מקטעי11, כמו גישה זו עשויה להיות שימושית כאשר לומדים בתיווך glucocorticoid השפעות על עצם המתרחשים במהלך תיקון שבר. השיטות המובאות כאן יסייע לכתובת נוספות שבבסיס מנגנוני הפעולה glucocorticoid במהירות התחדשות העצם, עשוי גם להיות מועסק בהגדרות אחרות של ניהול סמים מערכתית בהקשר של התחדשות רקמות דג זברה.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Prednisolone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt forceps</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>BD027R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Braun</td>
			<td>5518059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>840004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection needle (0.3x13 mm)</td>
			<td>BD Beckton Dickinson</td>
			<td>30400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro drill</td>
			<td>Cell Point Scientific</td>
			<td>67-1000</td>
			<td>distributed e.g. by Harvard Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel burrs (0.5 &#181;m diameter)</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>19007-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artemia ssp.</td>
			<td>Sanders</td>
			<td>425GR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette (plastic, Pastette)</td>
			<td>Alpha Labs</td>
			<td>LW4111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin red S powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian blue 8 GX</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16 FA</td>
			<td>with QIMAGING RETIGA-SRV camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MVX10</td>
			<td>with Olympus DP71 or DP80 camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adult zebrafish injury models to study the effects of prednisolone in regenerating bone tissue

דג זברה מסוגלים להתחדש איברים שונים, כולל תוספות (סנפיר) לאחר קטיעה. פעולה זו כרוכה לרגנרציה של העצם, אשר מתחדש בערך שבועיים לאחר פציעה. יתר על כן, דג זברה מסוגלים לרפא עצם במהירות לאחר trepanation של הגולגולת, ותיקון שברים זה יכול להיות בקלות מוחדרים קרני גרמית סנפיר דג זברה. מבחני פציעה אלה מייצגים פרדיגמות ניסיוני האפשריים כדי לבחון את ההשפעה של תרופות מנוהלת על במהירות ויוצרים העצם. כאן נתאר את השימוש של מודלים אלה פציעה 3 ואת שלהם להשתמש בשילוב עם טיפול מערכתי glucocorticoid, אשר מפעילה עצם מעכבות ואפקטים לדיכוי המערכת החיסונית. אנו מספקים זרימת עבודה כיצד להתכונן לטיפול לדיכוי המערכת החיסונית דג זברה למבוגרים, להמחיש כיצד לבצע קטיעה פין, trepanation של calvarial עצמות, שברים סנפיר, ולתאר כיצד השימוש glucocorticoids משפיעה על שני יוצרי העצם תאי העצם, תאי של שושלת היוחסין מונוציט/מקרופאג כחלק מולדת חסינות רקמת העצם.

פרוטוקול המובאת כאן שימש שוב ושוב כדי לעודד היווצרות העצם מהיר במהלך התחדשות של ה דג זברה סנפיר והגולגולת10,11,16. בשילוב עם שיטת הציג prednisolone המינהל, מחקרים על ההשפעות של prednisolone במהלך התחדשות העצם יכול להיות נרדף. לדוגמה, ני...

Watch this Scientific Journal Video about Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue at JoVE.com

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

דג זברה בוגרת מודלים פציעה ללמוד את השפעות Prednisolone רגנרציה רקמת העצם

כאן נתאר 3 מודלים פציעה דג זברה מבוגרים, שלהם להשתמש בשילוב עם טיפול תרופות לדיכוי המערכת החיסונית. אנו מספקים הדרכה על הדמיה של התחדשות הרקמות ועל גילוי מינרליזציה עצם המצוי בו.

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום ההתערבות הטיפולית בדיכוי המערכת החיסון לחקר ההשפעות השליליות של תרופות על התחדשות רקמות, בפרט, בעצמות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משלבת מודלים קודמים של התחדשות עצם זברה עם חשיפה מערכתית לתרופות על ידי טבילה של דג הזברה הפצוע במים דגים בתוספת סמים. לפני תחילת ההליך, autoclave רדיד אלומיניום אחד כיסה 600 מיליליטר לכל זברהפיש ומספר מתאים של בקבוקי זכוכית של מי דגים לניסוי ולהכין את התרופה לדיכוי המערכת החיסון בפתרונות בקרה ניסיוניים של עניין.לפציעה של קטיעה, השתמש במטליות קהות כדי למקם בזהירות דג זברה הרדמה על צידו הצדדי על המכסה ההפוך של צלחת פטרי 100 מילימטר ולהשתמש באזמל כדי לכרות 50% מהסנפיר. לאחר מכן מניחים את הדג לתוך מקור autoclaved המכיל 300 מיליליטר של מי דגים בתוספת חומר ניסיוני מתאים לכסות את המזימה עם רדיד אלומיניום כדי למנוע בריחה זברה. כדי לגרום לפגיעה בשבר בסנפיר, מניחים דג זברה הרדמה בצד הצדדי שלו בצלחת פטרי מצופה 100 מילימטר מתחת למיקרוסקופ ניתוח ודחפו מחט הזרקה מעט לתוך קטע קרן סנפיר גרמי עד שיופיע סדק.חשוב להכניס לא יותר מדי שברים לתוך הסנפיר כי זה עלול לפגוע מאוד ביציבות. ואז להעביר את הדג לתוך מקור autoclaved המכיל 300 מיליליטר של מי דגים בתוספת סוכן ניסיוני המתאים. כדי ליצור פגיעה בגולגולת, החזק דג זברה הרדמה במצב זקוף כך שהעצמות הגולגולתיות יתוארו בקלות תחת מיקרוסקופ ניתוח.מניחים מקדחת מיקרו מסתובבת המצוידת במקדחה של 500 מיקרומטר מעל מרכז העצם הקדמית ונוגעים בעדינות בעצם כדי לייצר חור בגודל של המיקרו-מקדחה בר. זה קריטי לא להזיז את התרגיל באופן מאוחר יותר בעת הפקת הפציעה ולהפסיק מיד לאחר ההתנגדות של הרקמה טיפות. אחרת, המוח ייפגע.ואז למקם את הדג לתוך מקור autoclaved המכיל 300 מיליליטר של מי דגים בתוספת סוכן ניסיוני המתאים. לשנות את המים בפקקים מדי יום על ידי העברת דג הזברה ומי הדגים לתוך מיכל זמני מתאים ומילוי המקור עם מי דגים בתוספת תרופה טרייה. לאחר מכן השתמש ברשת דגים כדי להחזיר את דג הזברה לסק שלה.עבור טיפולים של עד יומיים בסך הכל, אין להאכיל את דג הזברה. במהלך ניסויים ארוכים יותר, להאכיל את הזברה עם 0.5 כדי מיליליטר אחד של ארטמיה SSP בקע בכל יום שני. לניתוח פציעות סנפיר, לקצור את הקנס ולהשתמש מדפים עדין לתפוס את הסנפיר בקצה אחד של הגדם.השתמש זוג שני של מדפים כדי לתפוס את קצה הגדם הנגדי מעט לחץ על הרקמה על החלק התחתון של המנה המכילה קר 4% PFA במשך 10 עד 20 שניות. חזרו על שיטוח הסנפירים לפי הצורך. הסנפיר צריך עכשיו לשכב שטוח ללא קרלינג.לאחסון מדגם לטווח ארוך לאחר קיבעון, לשטוף את הרקמה עם שלוש 20 דקות שטיפות PBS וסדרת מתנול עולה. לאחר מכן ניתן לאחסן את הדגימות ב-100% מתנול במינוס 20 מעלות צלזיוס. עבור כתמים אדומים Alizarin, rehydrate מתנול מאוחסן דגימות בסדרה מתנול יורד ואחריו שתי 20 דקות לשטוף PBS ואחד חמש דקות לשטוף במים deionized.לאחר הכביסה האחרונה, מוסיפים פתרון אדום Alizarin לרקמת המדגם להדגירה את המדגם בטמפרטורת החדר עם נדנדה לתקופת הכתמים המתאימה. כדי לנקות את הדגימות, לטפל ברקמה עם ירידה של 1%אשלגן הידרוקסידי גליצרול סדרה. לאחר מכן לאחסן את הדגימות אחד לאחד 0.1% אשלגן הידרוקסיד כדי 80% גליצרול פתרון ולהוות את הרקמות עם 80% גליצרול לדמיון.עבור ויטראז'ין Calcein, דגירה עד שלושה דגי זברה בו זמנית ב 100 מילימטרים של פתרון Calcein במשך 20 דקות ב זכוכית מכוסה רדיד אלומיניום. בסוף הדגירה, מעבירים את דג הזברה למכל מי דגים ותנו לדגים לשחות לזמן קצר לפני העברתם למכל חדש של מי דגים. לאחר 20 דקות בתוך הקוסם השני כדי לרכוש תמונות חיות של סנפיר מתחדש, מניחים דג זברה הרדמה על צלחת פטרי מצופה אגרוז ודמיין את הסנפיר על ידי מיקרוסקופיה סטריאו.כדי לרכוש תמונות של עצמות הגולגולת המתחדשות, מניחים את דג הזברה זקוף בספוג ומדמים את הגולגולת במיקרוסקופיה פלואורסצנטית. טיפול עם Prednisolone, בדומה glucocorticoids אחרים, מוביל עיכוב כולל של התחדשות הסנפיר כולל היווצרות העצם כפי שזוהה על ידי כתמים אדומים Alizarin של רקמת סנפיר קאודאלי קבוע. באופן דומה, לתרופה יש השפעה מעכבת על סגירת גולגולת גולגולת.בשל דיכוי חיסוני, מספרי מקרופאג מופחתים יכולים גם להיות מזוהים על ידי אימונוהיסטוכימיה על מקטעי רקמה קפואים כפי שמוצג על ידי שימוש אנטי mCherry ו אנטי GFP יכתימות נוגדנים ו MPEG-1 mCherry מהונדס חצה עם Osterix NGFP זברפיש על דגימות רקמת הגולגולת Zebrafish מ בעלי חיים שטופלו Prednisolone. בעת ניסיון הליכים אלה חשוב למזער את השונות במהירות התחדשות העצם על ידי ביצוע מאמרי הפציעה בצורה ניתנת לשחזור מאוד. זה גם חיוני לבית יחיד זברה ב beakers autoclaved המכיל מי דגים autoclaved על מנת למנוע זיהום מיקרוביאלי.פרוטוקול זה יעזור להמשיך לטפל במנגנונים הבסיסיים של פעולה glucocorticoid. לדוגמה, בהקשר של אוסטאופורוזיס המושרה glucocorticoid וייתכן גם להיות מותאם לשימוש בתרופות אחרות ועצם זברה אחרים.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

התחדשות בכליות למבוגרי דג הזברה על ידי גנטמיצין מושרה פגיעה

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

פגיעה כלי מכאנית בעוברי דג הזברה

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

שימוש במערכת טיטון לחקר מולקולרי מנגנוני התחדשות דג הזברה

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

פרוטוקולים לניתוח תפקידם של תאי פנט התחדשות Murine המעי באמצעות מותנה<em&gt; Cre-לקס</em&gt; מודלי עכבר

The epithelial surface of the mammalian intestine is a dynamic tissue that renews every 3 - 7 days. Understanding this renewal process identified a ...

Combining Intravital Fluorescent Microscopy (IVFM) with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Combining Intravital Fluorescent Microscopy IVFM with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

שילוב של מיקרוסקופ פלואורסצנטי Intravital (IVFM) עם דגמים גנטיים בחקר דינמיקה Engraftment Hematopoietic תאים במח העצם נישות

Increasing evidence indicates that normal hematopoiesis is regulated by distinct microenvironmental cues in the BM, which include specialized cellular ...

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

בניית מודלים אלמנטים סופיים לחקור ביומכניקה לסת דג הזברה

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In vivo הדמיה של ביטוי מהונדס ג&#39;ין הפרט רשתית אבות ב Chimeric דג הזברה עוברים לחקר השפעות Cell Nonautonomous

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish

ניתוח היסטולוגית של פגיעה חריפה בכבד אלכוהול דג הזברה

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

הדמיה חיה של עכבר משניים פיוז &#39;ן

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

ניתוח Immunofluorescent מכתים של פטריות הגוף והנפש ומה קולט אור נוירונים במוח למבוגרים דרוזופילה melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...