Name: adult zebrafish injury models to study the effects of prednisolone in regenerating bone tissue
Uploaded: 2018-10-18T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue at JoVE.com

इस अध्ययन के एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था अपक्षयी चिकित्सा ड्रेसडेन के केंद्र ("Zebrafish के रूप में एक मॉडल के तंत्र को जानने के लिए glucocorticoid-प्रेरित हड्डी हानि") और इसके अलावा ड्यूश Forschungsgemeinschaft के अनुदान से (Transregio ६७, परियोजना ३८७६५३७८५) ते FK. हम बोनी फिन किरणों में calvariae और फ्रैक्चर के trepanation प्रदर्शन पर उनके मार्गदर्शन और सहायता के लिए जन Kaslin और अविनाश Chekuru के लिए बहुत आभारी हैं । प्रयोगों डिजाइन, प्रदर्शन किया और किलो और FK द्वारा विश्लेषण किया गया । FK ने पांडुलिपि लिखी । हम भी Katrin Lambert, निकोल Cudak, और तकनीकी सहायता और चर्चा के लिए Knopf और ब्रांड लैब्स के अंय सदस्यों को धंयवाद देना चाहूंगा । हमारा धंयवाद भी उत्कृष्ट मछली की देखभाल के लिए मैरिका फिशर और जितका Michling को जाता है और पांडुलिपि को ठीक करने के लिए Henriette Knopf और जोश क्यूरी ।

सभी विधियां यहां वर्णित Landesdirektion ड्रेसडेन द्वारा अनुमोदित किए गए थे (संख्या की अनुमति: az 24D-9168.11-1/2008-1, az 24-9168.11-1/2011-52, az 24-9168.11-1/2013-5, az 24-9168.11-1/2013-14, az डीडी 24.1-5131/354/87) ।
1. सामग्री और समाधान की तैयारी
नोट: Prednisolone, अंय ग...

<ol>
	<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book. A Guide for The Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). 385, (2000).</li><li>Xu, C., Volkery, S., Siekmann, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intubation-based+anesthesia+for+long-term+time-lapse+imaging+of+adult+zebrafish.">Intubation-based anesthesia for long-term time-lapse imaging of adult zebrafish.</a> Nature Protocols. 10 (12), 2064-2073 (2015).</li><li>Kaufman, C. K., White, R. M., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetic+screening+in+the+zebrafish+embryo.">Chemical genetic screening in the zebrafish embryo.</a> Nature Protocols. 4 (10), 1422-1432 (2009).</li><li>Paul, S., Crump, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+on+skeletal+cell+plasticity+from+studying+jawbone+regeneration+in+zebrafish.">Lessons on skeletal cell plasticity from studying jawbone regeneration in zebrafish.</a> Bonekey Reports. 5, 853 (2016).</li><li>Witten, P. E., Harris, M. P., Huysseune, A., Winkler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+teleost+fish+provide+new+insights+into+human+skeletal+diseases.">Small teleost fish provide new insights into human skeletal diseases.</a> Methods in Cell Biology. 138, 321-346 (2017).</li><li>den Uyl, D., Bultink, I. E., Lems, W. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthesia+and+euthanasia+in+zebrafish.">Anesthesia and euthanasia in zebrafish.</a> Institute of Laboratory Animal Resources Journal. 53 (2), 192-204 (2012).</li><li>Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf+signaling+instructs+position-dependent+growth+rate+during+zebrafish+fin+regeneration.">Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration.</a> Development. 132, 5173-5183 (2005).</li><li>Hirasawa, T., Kuratani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+vertebrate+skeleton:+morphology,+embryology,+and+development.">Evolution of the vertebrate skeleton: morphology, embryology, and development.</a> Zoological Letters. 1, 2 (2015).</li><li>Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+of+neuroepithelial-like+and+radial+glia-like+progenitor+cells+in+cerebellar+regeneration.">Distinct roles of neuroepithelial-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration.</a> Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).</li><li>Knopf, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerates+via+Dedifferentiation+of+Osteoblasts+in+the+Zebrafish+Fin.">Regenerates via Dedifferentiation of Osteoblasts in the Zebrafish Fin.</a> Developmental Cell. 20 (5), 713-724 (2011).</li><li>van Eeden, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+affecting+somite+formation+and+patterning+in+the+zebrafish,+Danio+rerio.">Mutations affecting somite formation and patterning in the zebrafish, Danio rerio.</a> Development. 123, 153-164 (1996).</li><li>Walker, M. B., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-color+acid-free+cartilage+and+bone+stain+for+zebrafish+larvae.">A two-color acid-free cartilage and bone stain for zebrafish larvae.</a> Biotechnic &amp; Histochemistry. 82 (1), 23-28 (2007).</li><li>Kyritsis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+inflammation+initiates+the+regenerative+response+in+the+adult+zebrafish+brain.">Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain.</a> Science. 338 (6112), 1353-1356 (2012).</li><li>Oppedal, D., Goldsmith, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+screen+to+identify+novel+inhibitors+of+fin+regeneration+in+zebrafish.">A chemical screen to identify novel inhibitors of fin regeneration in zebrafish.</a> Zebrafish. 7 (1), 53-60 (2010).</li><li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish.">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).</li><li>Spoorendonk, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+and+Cyp26b1+are+critical+regulators+of+osteogenesis+in+the+axial+skeleton.">Retinoic acid and Cyp26b1 are critical regulators of osteogenesis in the axial skeleton.</a> Development. 135 (22), 3765-3774 (2008).</li><li>Gioia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chaperone+activity+of+4PBA+ameliorates+the+skeletal+phenotype+of+Chihuahua,+a+zebrafish+model+for+dominant+osteogenesis+imperfecta.">The chaperone activity of 4PBA ameliorates the skeletal phenotype of Chihuahua, a zebrafish model for dominant osteogenesis imperfecta.</a> Human Molecular Genetics. 26 (15), 2897-2911 (2017).</li><li>Fiedler, I. A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severely+impaired+bone+material+quality+in+Chihuahua+zebrafish+resembles+classical+dominant+human+osteogenesis+imperfecta.">Severely impaired bone material quality in Chihuahua zebrafish resembles classical dominant human osteogenesis imperfecta.</a> Journal of Bone and Mineral Research. , (2018).</li><li>Fisher, S., Jagadeeswaran, P., Halpern, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiographic+analysis+of+zebrafish+skeletal+defects.">Radiographic analysis of zebrafish skeletal defects.</a> Developmental Biology. 264 (1), 64-76 (2003).</li><li>Hayes, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+deformity+in+aged+zebrafish+is+accompanied+by+degenerative+changes+to+their+vertebrae+that+resemble+osteoarthritis.">Spinal deformity in aged zebrafish is accompanied by degenerative changes to their vertebrae that resemble osteoarthritis.</a> PLoS One. 8 (9), e75787 (2013).</li><li>Mitchell, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+osteoarthritis+genetics+in+zebrafish.">New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish.</a> Osteoarthritis Cartilage. 21 (2), 269-278 (2013).</li><li>Fleming, A., Sato, M., Goldsmith, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+in+vivo+screening+for+bone+anabolic+compounds+with+zebrafish.">High-throughput in vivo screening for bone anabolic compounds with zebrafish.</a> Journal of Biomolecular Screening. 10 (8), 823-831 (2005).</li><li>de Vrieze, E., Zethof, J., Schulte-Merker, S., Flik, G., Metz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+osteogenic+compounds+by+an+ex+vivo+sp7:luciferase+zebrafish+scale+assay.">Identification of novel osteogenic compounds by an ex vivo sp7:luciferase zebrafish scale assay.</a> Bone. 74, 106-113 (2015).</li></ol>

Zebrafish कई संबंध में कंकाल अनुसंधान में उपयोगी साबित कर दिया है । चयनित म्यूटेंट ऐसे आस्टियोजेनेसिस imperfecta या पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस के रूप में मानव रोग के पहलुओं की नकल23,24,<sup class="xre...

Zebrafish हड्डीवाला विकास और रोग का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली पशु मॉडल का प्रतिनिधित्व करते हैं । यह तथ्य यह है कि वे छोटे जानवर है कि बहुत अच्छी तरह से नस्ल और है कि उनके जीनोम पूरी तरह से अनुक्रम है और1हेरफेर के लिए उत्तरदाई है की वजह से है । अन्य लाभों में विभिन्न चरणों में जारी लाइव इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए विकल्प शामिल हैं, जिसमें vivo इमेजिंग में वयस्क zebrafish2, और zebrafish लार्वा3में उच्च प्रवाह दवा स्क्रीन करने की क्षमता । इसके अतिरिक्त, zebrafish हड्डी सहित अंगों और ऊतकों की एक किस्म में एक उच्च अपक्षयी क्षमता के अधिकारी, और इस तरह एक उपयोगी प्रणाली कंकाल रोग और मरंमत के अध्ययन के रूप में सेवा4,5।
Glucocorticoid-प्रेरित ऑस्टियोपोरोसिस (गियो) एक रोग है कि ग्लुकोकोर्तिकोइद के साथ दीर्घकालिक उपचार से परिणाम, इस तरह के अस्थमा या रुमेटी गठिया के रूप में स्व-प्रतिरक्षित रोग उपचार के दौरान उदाहरण के लिए । गियो glucocorticoid-इलाज रोगियों के बारे में 30% में विकसित और एक प्रमुख स्वास्थ्य6अंक का प्रतिनिधित्व करता है; इसलिए, यह महान विस्तार में अस्थि ऊतक पर प्रतिरक्षादमन के प्रभाव की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है । हाल के वर्षों में गियो के रोगजनन से निपटने zebrafish मॉडल की एक किस्म विकसित किया गया है । Glucocorticoid-मध्यस्थता हड्डी हानि zebrafish लार्वा में प्रेरित किया गया है, उदाहरण के लिए, जो एक दवा स्क्रीन7में बढ़ती हड्डी द्रव्यमान की पहचान के लिए प्रतिक्रियात्मक यौगिकों के नेतृत्व में. इसके अलावा, glucocorticoid-प्रेरित अस्थि निरोधात्मक प्रभाव zebrafish तराजू में दोनों विट्रो में और vivo8,9में नकल उतारा गया है । इन परख दृष्टिकोण बहुत कायल हैं, खासकर जब यह उपंयास immunosuppressive और हड्डी anabolic दवाओं की पहचान की बात आती है । हालांकि, वे केवल आंशिक रूप से खाते में ले endoskeleton और एक अपक्षयी संदर्भ में नहीं किया गया है । इस प्रकार, वे वयस्क, अपक्षयी अस्थि गठन के तेजी से मोड के दौरान glucocorticoid मध्यस्थता प्रभाव की जांच की अनुमति नहीं है ।
यहां, हम एक शोधकर्ताओं को सक्षम करने के लिए अध्ययन करने के लिए glucocorticoid-मध्यस्थ प्रभाव वयस्क zebrafish उत्थान के दौर से गुजर हड्डियों पर । चोट मॉडल zebrafish caudal फिन के आंशिक विच्छेदन, खोपड़ी के trepanation, साथ ही फिन रे भंग (आंकड़ा 1a-1C) के निर्माण में शामिल हैं, और गर्मी के माध्यम से glucocorticoid जोखिम के साथ संयुक्त कर रहे हैं (चित्रा 1E ). हम हाल ही में इस प्रोटोकॉल के एक हिस्से का इस्तेमाल किया है prednisolone, आमतौर पर निर्धारित corticosteroid दवाओं में से एक के लिए जोखिम के परिणामों का वर्णन, वयस्क zebrafish पर फिन और खोपड़ी10अस्थि चूकने । zebrafish में, prednisolone प्रशासन में कमी osteoblast प्रसार, अपूर्ण osteoblast भेदभाव और apoptosis के monocyte/मैक्रोफेज वंश10में तेजी से प्रेरण की ओर जाता है । इस प्रोटोकॉल में, हम भी कैसे भंग एकल बोनी फिन रे खंडों11में पेश किया जा सकता का वर्णन है, के रूप में इस दृष्टिकोण फ्रैक्चर की मरंमत के दौरान होने वाली हड्डी पर glucocorticoid मध्यस्थता प्रभाव का अध्ययन करते समय उपयोगी हो सकता है । यहां प्रस्तुत तरीकों को आगे तेजी से पुनः उत्पन्न हड्डी में glucocorticoid कार्रवाई के अंतर्निहित तंत्र को संबोधित करने में मदद मिलेगी और भी zebrafish ऊतक पुनर्जनन के संदर्भ में प्रणालीगत दवा प्रशासन के अन्य सेटिंग्स में नियोजित किया जा सकता है.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Prednisolone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt forceps</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>BD027R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Braun</td>
			<td>5518059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>840004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection needle (0.3x13 mm)</td>
			<td>BD Beckton Dickinson</td>
			<td>30400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro drill</td>
			<td>Cell Point Scientific</td>
			<td>67-1000</td>
			<td>distributed e.g. by Harvard Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel burrs (0.5 &#181;m diameter)</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>19007-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artemia ssp.</td>
			<td>Sanders</td>
			<td>425GR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette (plastic, Pastette)</td>
			<td>Alpha Labs</td>
			<td>LW4111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin red S powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian blue 8 GX</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16 FA</td>
			<td>with QIMAGING RETIGA-SRV camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MVX10</td>
			<td>with Olympus DP71 or DP80 camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adult zebrafish injury models to study the effects of prednisolone in regenerating bone tissue

Zebrafish विच्छेदन के बाद उपांग (पंख) सहित विभिन्न अंगों, पुनर्जीवित करने में सक्षम हैं । यह हड्डी है, जो चोट के बाद लगभग दो सप्ताह के भीतर regenerations के उत्थान शामिल है । इसके अलावा, zebrafish खोपड़ी के trepanation के बाद तेजी से हड्डी को चंगा करने में सक्षम हैं, और मरंमत भंग कि आसानी से zebrafish बोनी फिन किरणों में पेश किया जा सकता है । इन चोट परख व्यावहारिक प्रयोगात्मक मानदंड का प्रतिनिधित्व करने के लिए तेजी से हड्डी बनाने पर प्रशासित दवाओं के प्रभाव का परीक्षण । यहां, हम इन 3 चोट मॉडल और प्रणालीगत glucocorticoid उपचार है, जो हड्डी निरोधात्मक और immunosuppressive प्रभाव डालती के साथ उनके संयुक्त उपयोग के उपयोग का वर्णन । हम कैसे वयस्क zebrafish में immunosuppressive उपचार के लिए तैयार करने के लिए पर एक कार्यप्रवाह प्रदान करते हैं, समझाने कैसे फिन विच्छेदन, calvarial हड्डियों के trepanation, और पंख भंग करने के लिए, और वर्णन कैसे ग्लुकोकोर्तिकोइद के उपयोग दोनों हड्डी बनाने को प्रभावित करता है osteoblasts और monocyte/मैक्रोफेज वंश की कोशिकाओं अस्थि ऊतक में जन्मजात उन्मुक्ति के भाग के रूप में ।

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल बार प्रयोग किया गया है zebrafish फिन और खोपड़ी10,11,16के उत्थान के पाठ्यक्रम में तेजी से हड्डी गठन प्रेरित करने के लिए । prednisolone प्रशासन की प्...

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Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

वयस्क Zebrafish चोट मॉडल Prednisolone के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए अस्थि ऊतक पुनः उत्पन्न करने में

यहां, हम 3 वयस्क zebrafish चोट मॉडल और immunosuppressive दवा उपचार के साथ उनके संयुक्त उपयोग का वर्णन । हम पुनः उत्पन्न होने वाले ऊतकों के इमेजिंग पर और अस्थि mineralization का पता लगाने पर मार्गदर्शन प्रदान करते हैं ।

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...

यह विधि विशेष रूप से हड्डियों में ऊतक उत्थान पर दवाओं के प्रतिकूल प्रभावों का अध्ययन करने के लिए इम्यूनोसप्रेसिव चिकित्सकीय हस्तक्षेप के क्षेत्र में महत्वपूर्ण सवालों के जवाब देने में मदद कर सकती है। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह दवा पूरक मछली के पानी में घायल ज़ेब्राफिश के विसर्जन द्वारा प्रणालीगत दवा जोखिम के साथ ज़ेब्राफ़िश अस्थि उत्थान के पिछले मॉडलों को जोड़ती है। प्रक्रिया शुरू करने से पहले, ऑटोक्लेव एक एल्यूमीनियम पन्नी ने प्रति जेब्राफिश 600 मिलीलीटर बीकर और प्रयोग के लिए मछली के पानी की कांच की बोतलों की एक उचित संख्या को कवर किया और ब्याज के प्रयोगात्मक नियंत्रण समाधानों में इम्यूनोसप्रेसिव दवा तैयार की।एक विच्छेदन चोट के लिए, कुंद संदंश का उपयोग ध्यान से एक १०० मिलीमीटर पेट्री डिश के उलट ढक्कन पर अपने पार्श्व पक्ष पर एक एनेस्थेटाइज्ड जेब्राफिश जगह है और एक स्केलपेल का उपयोग करने के लिए ५०% फिन फिर से काटना । फिर मछली को उचित प्रायोगिक एजेंट के साथ पूरक मछली के पानी के 300 मिलीलीटर युक्त एक ऑटोक्लेव बीकर में रखें और जेब्राफ़िश भागने को रोकने के लिए पन्नी के साथ बीकर को कवर करें। फिन फ्रैक्चर की चोट को प्रेरित करने के लिए, एक एनेस्थेटाइज्ड जेब्राफिश को 100 मिलीमीटर एगर उठे हुए पेट्री डिश में एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे रखें और एक इंजेक्शन सुई को बोनी फिन रे सेगमेंट में थोड़ा पुश करें जब तक कि एक दरार दिखाई न दे।फिन में बहुत अधिक फ्रैक्चर पेश करना महत्वपूर्ण है क्योंकि इससे स्थिरता बहुत ख़राब हो सकती है। फिर मछली को उचित प्रायोगिक एजेंट के साथ पूरक मछली के पानी के 300 मिलीलीटर युक्त एक ऑटोक्लेवेड बीकर में स्थानांतरित करें। एक कैल्विकल खोपड़ी की चोट उत्पन्न करने के लिए, ईमानदार स्थिति में एक एनेस्थेटाइज्ड जेब्राफ़िश पकड़ें ताकि कैल्वेरियल हड्डियों को आसानी से विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत कल्पना की जाती है।ललाट हड्डी के केंद्र पर एक 500 माइक्रोमीटर ड्रिल बिट से लैस एक घूर्णन माइक्रो ड्रिल रखें और धीरे से एक छेद माइक्रो ड्रिल burr के आकार का उत्पादन करने के लिए हड्डी को छूने। चोट का उत्पादन करते समय ड्रिल को बाद में स्थानांतरित नहीं करना और ऊतक के प्रतिरोध के तुरंत रुकने के लिए महत्वपूर्ण है। अन्यथा दिमाग को नुकसान होगा।फिर मछली को उपयुक्त प्रायोगिक एजेंट के साथ पूरक मछली के पानी के 300 मिलीलीटर युक्त एक ऑटोक्लेवेड बीकर में रखें। जेब्राफिश और मछली के पानी को एक उपयुक्त अस्थायी कंटेनर में स्थानांतरित करके और ताजा दवा पूरक मछली के पानी के साथ बीकर को फिर से भरने से रोजाना बीकर्स में पानी बदलें। इसके बाद जेब्राफिश को उसके बीकर में लौटाने के लिए फिश नेट का इस्तेमाल करें।कुल दो दिनों तक चलने वाले उपचारों के लिए, जेब्राफिश को न खिलाएं। लंबे प्रयोगों के दौरान, हर दूसरे दिन रची आर्टेमिया एसएसपी के 0.5 से एक मिलीलीटर के साथ जेब्राफिश खिलाएं। फिन चोट विश्लेषण के लिए, ठीक फसल और ठीक संदंश का उपयोग करने के लिए स्टंप के एक किनारे पर फिन समझ ।विपरीत स्टंप किनारे हड़पने के लिए संदंश की एक दूसरी जोड़ी का प्रयोग करें और थोड़ा पकवान जो 10 से 20 सेकंड के लिए ठंडा 4% पीएफए शामिल है के नीचे पर ऊतक प्रेस । आवश्यक के रूप में फिन सपाट दोहराएं। फिन को अब बिना कर्लिंग के फ्लैट रखना चाहिए।निर्धारण के बाद दीर्घकालिक नमूना भंडारण के लिए, ऊतक को तीन 20 मिनट पीबीएस वॉश और एक आरोही मेथनॉल श्रृंखला के साथ धोएं। इसके बाद नमूनों को माइनस 20 डिग्री सेल्सियस पर १००% मेथनॉल में स्टोर किया जा सकता है । अलीज़ारिन रेड स्टेनिंग के लिए, एक उतरते मेथनॉल श्रृंखला में मेथनॉल संग्रहीत नमूनों को फिर से हाइड्रेट करें और इसके बाद पीबीएस में दो 20 मिनट की वॉश और डिओनाइज्ड पानी में १ ५ मिनट की धुलाई ।अंतिम धोने के बाद, नमूना ऊतक में अलीज़ारिन लाल समाधान जोड़ें और उचित धुंधला अवधि के लिए कमाल के साथ कमरे के तापमान पर नमूना इनक्यूबेट करें। नमूनों को साफ करने के लिए, कम 1% पोटेशियम हाइड्रोक्साइड ग्लिसेरोल श्रृंखला के साथ ऊतक का इलाज करें। फिर नमूनों को एक से एक 0.1% पोटेशियम हाइड्रोक्साइड में 80% ग्लाइस्रोल समाधान के लिए स्टोर करें और कल्पना के लिए 80% ग्लाइस्रोल के साथ ऊतकों को माउंट करें।कैल्सीन धुंधला के लिए, एल्यूमीनियम पन्नी से ढके ग्लास बीकर में 20 मिनट के लिए कैल्सीन समाधान के 100 मिलीमीटर में एक साथ तीन जेब्राफिश तक इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के अंत में, ज़ेब्राफिश को मछली के पानी के एक कंटेनर में स्थानांतरित करें और मछली को मछली के पानी के एक नए कंटेनर में स्थानांतरित करने से पहले संक्षेप में तैरने दें। फिन रिजेनरेट की लाइव छवियों को प्राप्त करने के लिए दूसरी बीकर में 20 मिनट के बाद, एक एनेस्थेटाइज्ड ज़ेब्राफ़िश को एक एगर उठे हुए पेट्री डिश पर रखें और स्टीरियो माइक्रोस्कोपी द्वारा फिन की छवि करें।पुनर्जीवित खोपड़ी हड्डियों की छवियों को प्राप्त करने के लिए, जेब्राफिश को एक स्पंज में सीधा रखें और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा खोपड़ी की छवि करें। अन्य ग्लूकोकॉर्टिकोइड के समान प्रीनिसोलोन के साथ उपचार, स्थिर कौडल फिन ऊतक के अलीज़ारिन रेड धुंधला द्वारा पता लगाया गया हड्डी गठन सहित फिन पुनर्जनन का समग्र अवरोध होता है। इसी तरह, दवा कैलवरियल खोपड़ी चोट बंद होने पर प्रभाव में देरी हुई है।इम्यूनोसप्रेसियन के कारण, जमे हुए ऊतक वर्गों पर इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री द्वारा कम मैक्रोफेज संख्या का भी पता लगाया जा सकता है जैसा कि एंटी-मचेरी और एंटी-जीएफपी एंटीबॉडी स्टेनिंग और ट्रांसजेनिक एमपीईजी-1 रीचेरी का उपयोग करके प्रिडनिसोलोन से इलाज किए गए जानवरों से जेब्राफिश खोपड़ी ऊतक नमूनों पर ओस्टेरिक्स एनजीएफपी जेब्राफिश के साथ पार किया जाता है। इन प्रक्रियाओं का प्रयास करते समय अत्यधिक प्रजनन तरीके से चोट निबंधों को बाहर ले जाकर अस्थि उत्थान गति में परिवर्तनशीलता को कम करना महत्वपूर्ण है। माइक्रोबियल संक्रमण से बचने के लिए ऑटोक्लेव मछली के पानी वाले ऑटोक्लेव्ड बीकर्स में सिंगल हाउस जेब्राफिश के लिए भी महत्वपूर्ण है।यह प्रोटोकॉल ग्लूकोकॉर्टिकोइड कार्रवाई के अंतर्निहित तंत्रों को और संबोधित करने में मदद करेगा। उदाहरण के लिए, ग्लूकोकॉर्टिकोइड प्रेरित ऑस्टियोपोरोसिस के संदर्भ में और अन्य दवाओं और अन्य जेब्राफिश हड्डी के उपयोग के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है।

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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