Name: adult zebrafish injury models to study the effects of prednisolone in regenerating bone tissue
Uploaded: 2018-10-18T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue at JoVE.com

Questo studio è stato sostenuto da una sovvenzione del centro di rigenerativa terapie Dresda ("Zebrafish come modello di svelare i meccanismi di perdita dell'osso indotta da glucocorticoidi") e inoltre da una sovvenzione della Deutsche Forschungsgemeinschaft (Transregio 67, progetto 387653785) a FK. Siamo molto grati a Jan Kaslin e Avinash Chekuru per il loro orientamento e assistenza su come eseguire la trapanazione dei calvariae e fratture in raggi della pinna ossuta. Esperimenti sono stati progettati, eseguiti e analizzati da KG e FK. FK ha scritto il manoscritto. Vorremmo anche ringraziare Katrin Lambert, Nicole Cudak e gli altri membri dei laboratori Knopf e marca per assistenza tecnica e la discussione. Il nostro grazie va anche a Marika Fischer e Jitka Michling per la cura del pesce eccellente e di Henriette Knopf e Josh Currie di correzione il manoscritto per.

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal Landesdirektion di Dresda (permesso di numeri: AZ D 24-9168.11-1/2008-1, AZ 24-9168.11-1/2011-52, AZ 24-9168.11-1/2013-5, AZ 24-9168.11-1/2013-14, AZ DD24.1-5131/354/87).
1. preparazione dei materiali e delle soluzioni
Nota: Prednisolone, come altri glucocorticoidi, conduce all'immunosoppressione. Così, precauzione deve essere presa per prevenire l'infezione negli animali trattati durante l'esperimento. A tal fine...

<ol>
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Zebrafish si sono dimostrati utili nella ricerca scheletrico in molti riguardi. Mutanti selezionati imitano gli aspetti della malattia umana come l'osteogenesi imperfetta o osteoartrite23,24,25,26,27, e le larve, come pure le scale vengono utilizzate per identificare composti anabolizzanti osso piccola molecola schermi7,<sup ...

Zebrafish rappresentano un potente modello animale per studiare la malattia e lo sviluppo dei vertebrati. Questo è dovuto al fatto che essi sono piccoli animali che si riproducono molto bene e che il loro genoma è completamente sequenziato e suscettibili di manipolazione1. Altri vantaggi includono la possibilità di eseguire imaging continuato dal vivo in diverse fasi, compreso formazione immagine in vivo di zebrafish adulto2e la possibilità di eseguire gli schermi della droga a resa elevata in zebrafish larve3. Inoltre, zebrafish possiedono un'elevata capacità rigenerativa in una varietà di organi e tessuti tra cui osso e così servire come un sistema utile per studiare la malattia scheletrica e riparare4,5.
Osteoporosi indotta da glucocorticoidi (GIO) è una malattia che deriva dal trattamento a lungo termine con glucocorticoidi, ad esempio nel corso del trattamento di malattia autoimmune come l'asma o l'artrite reumatoide. GIO si sviluppa in circa il 30% dei pazienti trattati con glucocorticoidi e rappresenta un problema sanitario importante6; Pertanto, è importante studiare l'impatto di immunosoppressione sul tessuto osseo in grande dettaglio. Negli ultimi anni sono stati sviluppati vari modelli di zebrafish a che fare con la patogenesi di GIO. Perdita dell'osso glucocorticoide-mediata è stata indotta in larve di zebrafish, ad esempio, che ha portato all'identificazione di composti contromisure aumentando la massa di una droga schermo7. Inoltre, gli effetti inibitori dell'osso indotta da glucocorticoidi hanno stati imitati in zebrafish scale sia in vitro che in vivo8,9. Queste analisi sono molto convincenti approcci, soprattutto quando si tratta per l'identificazione di nuovi farmaci immunosoppressivi e osso anabolizzanti. Tuttavia, solo in parte prendono in considerazione l'endoscheletro e non sono stati eseguiti in un contesto rigenerativo. Pertanto, non consentono l'indagine degli effetti glucocorticoide-mediata durante rapida modalità di formazione dell'osso adulto, rigenerativa.
Qui, presentiamo un protocollo che consente ai ricercatori di studiare glucocorticoide-mediata effetti sulle ossa di zebrafish adulto in fase di rigenerazione. Modelli di lesione includono l'amputazione parziale della pinna caudale zebrafish, trapanazione del cranio, così come la creazione delle fratture di pinna ray (Figura 1A-1 C) e sono combinati con glucocorticoidi esposizione tramite incubazione (Figura 1E ). Abbiamo recentemente utilizzato una parte del presente protocollo per descrivere le conseguenze dell'esposizione al prednisolone, uno dei farmaci comunemente prescritti del corticosteroide, il zebrafish adulto rigenerante pinna e cranio osseo10. In zebrafish, gestione di prednisolone porta alla proliferazione degli osteoblasti in diminuzione, differenziazione degli osteoblasti incompleta e rapida induzione dell'apoptosi nel lignaggio del monocito/macrofago10. In questo protocollo, descriviamo anche come fratture possono essere introdotta nella singola aletta ossuta ray segmenti11, come questo approccio può essere utile quando si studia glucocorticoide-mediata effetti sull'osso che si verificano durante la riparazione di frattura. I metodi presentati qui contribuiranno all'ulteriore indirizzo base dei meccanismi di azione glucocorticoide in rapida rigenerazione dell'osso e possono essere impiegati anche in altri contesti sistemica di somministrazione del farmaco nel contesto della rigenerazione dei tessuti di zebrafish.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Prednisolone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt forceps</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>BD027R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Braun</td>
			<td>5518059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>840004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection needle (0.3x13 mm)</td>
			<td>BD Beckton Dickinson</td>
			<td>30400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro drill</td>
			<td>Cell Point Scientific</td>
			<td>67-1000</td>
			<td>distributed e.g. by Harvard Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel burrs (0.5 &#181;m diameter)</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>19007-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artemia ssp.</td>
			<td>Sanders</td>
			<td>425GR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette (plastic, Pastette)</td>
			<td>Alpha Labs</td>
			<td>LW4111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin red S powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian blue 8 GX</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16 FA</td>
			<td>with QIMAGING RETIGA-SRV camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MVX10</td>
			<td>with Olympus DP71 or DP80 camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adult zebrafish injury models to study the effects of prednisolone in regenerating bone tissue

Zebrafish sono in grado di rigenerare i vari organi, tra cui appendici (pinne) dopo l'amputazione. Ciò comporta la rigenerazione dell'osso, che ricresce entro circa due settimane dopo la ferita. Inoltre, zebrafish sono in grado di guarire rapidamente dell'osso dopo la trapanazione del cranio e riparare le fratture che possono essere facilmente introdotto nei raggi della pinna ossuta di zebrafish. Queste analisi di lesioni rappresentano fattibile paradigmi sperimentali per testare l'effetto dei farmaci somministrati su rapidamente formando dell'osso. Qui, descriviamo l'uso di questi modelli di 3 lesioni e loro uso combinato con il trattamento glucocorticoide sistemica, che esercita gli effetti immunosopressivi ed inibitoria dell'osso. Forniamo un flusso di lavoro su come prepararsi per il trattamento immunosopressivo in zebrafish adulto, illustrano come eseguire pinna amputazione, trapanazione delle ossa calvarial e fratture pinna e descrivere come l'uso di glucocorticoidi influenzano entrambi osso formazione osteoblasti e cellule della linea monocito/macrofago come parte dell'immunità innata nel tessuto osseo.

Il protocollo presentato qui è stato utilizzato ripetutamente per indurre la formazione rapida dell'osso nel corso della rigenerazione del zebrafish pinna e cranio10,11,16. In combinazione con il metodo di somministrazione di prednisolone, studi sugli effetti di prednisolone durante la rigenerazione dell'osso possono essere perseguiti. Ad esempio, studi sulla formazione dell'osso e mineralizzazi...

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Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Modelli di lesione di Zebrafish adulto per studiare gli effetti del Prednisolone nella rigenerazione di tessuto osseo

Qui, descriviamo 3 modelli di lesione di zebrafish adulto e loro uso combinato con il trattamento di droga immunosopressiva. Siamo fornire indicazioni su formazione immagine di rigenerare i tessuti e il rilevamento di mineralizzazione dell'osso in esso.

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'intervento terapeutico immunosoppressivo per lo studio degli effetti avversi dei farmaci sulla rigenerazione tissutale, in particolare nelle ossa. Il principale vantaggio di questa tecnica è che combina modelli passati di rigenerazione ossea zebrafish con esposizione sistemica al farmaco mediante immersione del pesce zebra ferito in acqua di pesce integrata nel farmaco. Prima di iniziare la procedura, l'autoclave di un foglio di alluminio copriva un bicchiere da 600 millilitri per Zebrafish e un numero appropriato di bottiglie di vetro di acqua di pesce per l'esperimento e preparava il farmaco immunosoppressivo in soluzioni sperimentali di controllo di interesse.Per una lesione da amputazione, utilizzare forcep smussate per posizionare con cura un zebrafish anestetizzato sul lato laterale sul coperchio inverso di una piastra di Petri di 100 millimetri e utilizzare un bisturi per resect 50% della pinna. Quindi mettere il pesce in un bicchiere autoclavato contenente 300 millilitri di acqua di pesce integrato con un agente sperimentale appropriato e coprire il becher con un foglio per evitare la fuga di Zebrafish. Per indurre una lesione alla frattura della pinna, posizionare un zebrafish anestetizzato sul lato laterale in una piastra di Petri rivestita di agarosio di 100 millimetri sotto un microscopio sezionante e spingere leggermente un ago di iniezione in un segmento di raggi di pinna ossea fino a quando non appare una crepa.È importante introdurre non troppe fratture nella pinna perché ciò potrebbe compromettere notevolmente la stabilità. Quindi trasferire il pesce in un bicchiere autoclavato contenente 300 millilitri di acqua di pesce integrati con l'agente sperimentale appropriato. Per generare una lesione al cranio calvariale, tenere un zebrafish anestetizzato in posizione verticale in modo che le ossa calvariali siano facilmente visualizzate al microscopio a dissezione.Posizionare un micro trapano rotante dotato di una punta di perforazione di 500 micrometri sopra il centro dell'osso frontale e toccare delicatamente l'osso per produrre un foro delle dimensioni della bave del micro trapano. È fondamentale non spostare lateralmente il trapano durante la produzione della lesione e fermarsi immediatamente una volta che la resistenza del tessuto cade. Altrimenti, il cervello sarà danneggiato.Quindi mettere il pesce in un bicchiere autoclavato contenente 300 millilitri di acqua di pesce integrati con l'agente sperimentale appropriato. Cambiare l'acqua nei becher ogni giorno trasferendo il pesce zebra e l'acqua di pesce in un contenitore temporaneo appropriato e riempiendo il becher con acqua di pesce integrata con droghe fresche. Quindi usa una rete di pesce per riportare il pesce zebra al suo becher.Per trattamenti della durata totale fino a due giorni, non nutrire gli Zebrafish. Durante gli esperimenti più lunghi, dai da mangiare allo Zebrafish con da 0,5 a un millilitro di Artemia SSP tratteggiata ogni secondo giorno. Per l'analisi delle lesioni alla pinna, raccogliere la fine e utilizzare forcep fini per afferrare la pinna su un bordo del ceppo.Utilizzare un secondo paio di forcelle per afferrare il bordo del ceppo opposto e premere leggermente il tessuto sul fondo del piatto che contiene freddo 4%PFA per 10-20 secondi. Ripetere l'appiattimento delle pinne se necessario. La pinna ora dovrebbe giacere piatta senza arricciarsi.Per la conservazione a lungo termine del campione dopo la fissazione, lavare il tessuto con tre lavaggi PBS di 20 minuti e una serie crescente di metanolo. I campioni possono quindi essere conservati in metanolo al 100% a meno 20 gradi Celsius. Per la colorazione rossa di Alizarina, il metanolo reidrato ha immagazzinato campioni in una serie di metanolo discendente seguita da due lavaggi di 20 minuti in PBS e un lavaggio di cinque minuti in acqua deionizzata.Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere la soluzione di Alizarin Red al tessuto campione e incubare il campione a temperatura ambiente con dondolo per l'appropriato periodo di colorazione. Per cancellare i campioni, trattare il tessuto con la diminuzione dell'1% di idrossido di potassio serie di glicerolo. Quindi conservare i campioni in una soluzione di idrossido di potassio da uno a uno allo 0,1% all'80% di glicerolo e montare i tessuti con l'80% di glicerolo per l'immaginazione.Per la colorazione Calcein, incubare fino a tre Zebrafish contemporaneamente in soluzione di Calcein da 100 millimetri per 20 minuti in un bicchiere ricoperto di foglio di alluminio. Alla fine dell'incubazione, trasferire il pesce zebra in un contenitore di acqua di pesce e lasciare che il pesce nuoti brevemente prima di trasferirli in un nuovo contenitore di acqua di pesce. Dopo 20 minuti nel secondo becher per acquisire immagini dal vivo di rigenerazioni di pinne, posizionare un zebrafish anestetizzato su una piastra di Petri rivestita di agarosio e osservare la pinna tramite microscopia stereo.Per acquisire immagini delle ossa del cranio rigeneranti, posizionare il pesce zebrato in posizione verticale in una spugna e immagini il cranio mediante microscopia a fluorescenza. Il trattamento con Prednisolone, simile ad altri glucocorticoidi, porta ad un'inibizione generale della rigenerazione delle pinne compresa la formazione ossea come rilevato dalla colorazione rosso alizarina del tessuto delle pinne caudali fisse. Allo stesso modo, il farmaco ha un effetto ritardante sulla chiusura della lesione cranica calvariale.A causa dell'immunosoppressione, il numero ridotto di macrofagi può anche essere rilevato mediante immunoistochimica su sezioni di tessuto congelato come evidenziato dall'uso di colorazione anticorpale anti-mCherry e anti-GFP e MPEG-1 mCherry transgenico incrociato con Osterix NGFP Zebrafish su campioni di tessuto craschi zebrafish di animali trattati con Prednisolone. Durante il tentativo di queste procedure è importante ridurre al minimo la variabilità della velocità di rigenerazione ossea eseguendo i saggi di lesione in modo altamente riproducibile. È anche fondamentale ospitare singolo Zebrafish in becher autoclavati contenenti acqua di pesce autoclavata al fine di evitare infezioni microbiche.Questo protocollo contribuirà ad affrontare ulteriormente i meccanismi sottostanti dell'azione glucocorticoide. Ad esempio, nel contesto dell'osteoporosi indotta da glucocorticoidi e può anche essere adattato per l'uso di altri farmaci e di altri ossa di Zebrafish.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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Biologia dello sviluppo

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