Name: adult zebrafish injury models to study the effects of prednisolone in regenerating bone tissue
Uploaded: 2018-10-18T14:30:00
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この調査は、グラントのドレスデン中心部再生療法 (「ゼブラフィッシュ モデルとしてステロイド性骨量減少メカニズムを解明する」)、またドイツ研究振興協会 (Transregio 67, プロジェクトの助成金サポートされました。387653785) FK に。彼らの指導と骨ひれ光線の研究と骨折の trepanation の実行支援を 1 月 Kaslin と Avinash Chekuru に非常に感謝しております。実験では、設計、実行と KG と FK によって解析されました。FK は、原稿を書いていた。また、カトリン ・ ランバート、ニコール Cudak、クノップとブランド ラボ テクニカル サポートや議論のための他のメンバーに感謝したいと思います。感謝は、マリカ Fischer および優秀な魚のケアのための Jitka Michling とアンリエット ・ クノップとジョシュ ・ カリー、原稿の校正のためにまた行きます。

ここで説明したすべてのメソッドは、Landesdirektion ドレスデンによって承認された (許可番号: AZ 24 D-9168.11-1/2008-1 AZ 24-9168.11-1/2011-52、AZ 24-9168.11-1/2013-5、AZ 24-9168.11-1/2013-14、アリゾナ州 DD24.1-5131/354/87)。
1. 材料とソリューションの準備
注: プレドニゾロン、他のステロイド薬のようにつながる免疫抑制。したがって、予防措置は、実験中に扱われた動物で?...

<ol>
	<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book. A Guide for The Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). 385, (2000).</li><li>Xu, C., Volkery, S., Siekmann, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intubation-based+anesthesia+for+long-term+time-lapse+imaging+of+adult+zebrafish.">Intubation-based anesthesia for long-term time-lapse imaging of adult zebrafish.</a> Nature Protocols. 10 (12), 2064-2073 (2015).</li><li>Kaufman, C. K., White, R. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+and+Cyp26b1+are+critical+regulators+of+osteogenesis+in+the+axial+skeleton.">Retinoic acid and Cyp26b1 are critical regulators of osteogenesis in the axial skeleton.</a> Development. 135 (22), 3765-3774 (2008).</li><li>Gioia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chaperone+activity+of+4PBA+ameliorates+the+skeletal+phenotype+of+Chihuahua,+a+zebrafish+model+for+dominant+osteogenesis+imperfecta.">The chaperone activity of 4PBA ameliorates the skeletal phenotype of Chihuahua, a zebrafish model for dominant osteogenesis imperfecta.</a> Human Molecular Genetics. 26 (15), 2897-2911 (2017).</li><li>Fiedler, I. A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severely+impaired+bone+material+quality+in+Chihuahua+zebrafish+resembles+classical+dominant+human+osteogenesis+imperfecta.">Severely impaired bone material quality in Chihuahua zebrafish resembles classical dominant human osteogenesis imperfecta.</a> Journal of Bone and Mineral Research. , (2018).</li><li>Fisher, S., Jagadeeswaran, P., Halpern, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiographic+analysis+of+zebrafish+skeletal+defects.">Radiographic analysis of zebrafish skeletal defects.</a> Developmental Biology. 264 (1), 64-76 (2003).</li><li>Hayes, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+deformity+in+aged+zebrafish+is+accompanied+by+degenerative+changes+to+their+vertebrae+that+resemble+osteoarthritis.">Spinal deformity in aged zebrafish is accompanied by degenerative changes to their vertebrae that resemble osteoarthritis.</a> PLoS One. 8 (9), e75787 (2013).</li><li>Mitchell, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+osteoarthritis+genetics+in+zebrafish.">New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish.</a> Osteoarthritis Cartilage. 21 (2), 269-278 (2013).</li><li>Fleming, A., Sato, M., Goldsmith, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+in+vivo+screening+for+bone+anabolic+compounds+with+zebrafish.">High-throughput in vivo screening for bone anabolic compounds with zebrafish.</a> Journal of Biomolecular Screening. 10 (8), 823-831 (2005).</li><li>de Vrieze, E., Zethof, J., Schulte-Merker, S., Flik, G., Metz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+osteogenic+compounds+by+an+ex+vivo+sp7:luciferase+zebrafish+scale+assay.">Identification of novel osteogenic compounds by an ex vivo sp7:luciferase zebrafish scale assay.</a> Bone. 74, 106-113 (2015).</li></ol>

ゼブラフィッシュは、多くの点で骨格の研究に役立っています。選択した突然変異体が骨形成不全症、変形性関節症23,24,25,26,27などのひと疾患の側面を模倣し、体重計と同様、幼虫に使用されています。小分子画面7,28,...

ゼブラフィッシュでは、脊椎動物の発生と疾患研究に強力な動物モデルを表します。これは、彼らは、非常によく繁殖小動物とそのゲノムは完全にシーケンス化された操作1に従うことという事実のためです。その他の利点には、生体内イメージング アダルト ゼブラフィッシュ2とゼブラフィッシュ幼虫3で高スループット薬物画面を実行する機能など、さまざまな段階での継続的なライブ イメージングを実行するためのオプションが含まれます。さらに、ゼブラフィッシュはさまざまな臓器や骨などの組織に高い再生能力を持っているし、骨疾患を勉強して4,5を修復する有用なシステムとして提供します。
ステロイド性骨粗鬆症 (GIO) は、グルココルチコイド、たとえば喘息や慢性関節リウマチの自己免疫疾患治療の過程で長期的治療に起因する疾患です。ジオを表しグルココルチコイド治療を受けた患者の約 30% で成長する、主要な健康上の問題6。したがって、非常に詳細に骨免疫抑制の影響を調査することが重要です。近年さまざまなジオの病態を扱うゼブラフィッシュ モデルが開発されています。グルココルチコイドを介した骨の損失は、ゼブラフィッシュの幼虫、たとえば、薬剤スクリーン7で骨量を増やす中和化合物の同定につながったに誘導されてきました。さらに、ステロイド性骨抑制効果に真似されているゼブラフィッシュ スケールの in vitroとin vivoの8,9。これらの試金は非常に説得力のあるアプローチ、特にに関して新規免疫抑制と骨の同化作用の薬の同定。しかし、彼らは部分的にしか内骨格を考慮し、再生のコンテキストで実行されていません。したがって、彼らは大人、再生骨の急速なモード中のグルココルチコイドを介した効果の調査を許さない。
ここでは、大人のゼブラフィッシュ骨再生を受けているグルココルチコイドを介した効果を研究する研究者を有効にするプロトコルを提案します。傷害モデル ゼブラフィッシュ尾びれ、スカルの穿頭およびひれ光線骨折 (図 1 a-1 C) の作成の部分の切断が含まれ、インキュベーション (図 1Eを介してグルココルチコイド露出と組み合わせて).最近フィンと頭蓋骨の骨10を再生成する大人のゼブラフィッシュの 1 つ一般的に規定する副腎皮質ステロイド薬のプレドニゾロンへの露出の結果を記述するこの議定書の部分を使いました。ゼブラフィッシュ、プレドニゾロン内服は減少した骨芽細胞増殖、不完全な骨芽細胞分化や単球/マクロファージ系統10におけるアポトーシスの急速な誘導につながります。このプロトコルでも述べる骨折が骨のシングルフィンの線のセグメント11に導入できる方法として破壊修復中にグルココルチコイドを介した骨発生効果を勉強して、このアプローチが役に立つかもしれません。紹介した方法は、急速に骨の再生の糖質コルチコイド作用機序を基になる更に対処するのに役立ち、ゼブラフィッシュ組織再生のコンテキストで全身薬物管理の他の設定に用いることもできます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Prednisolone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt forceps</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>BD027R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Braun</td>
			<td>5518059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>840004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection needle (0.3x13 mm)</td>
			<td>BD Beckton Dickinson</td>
			<td>30400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro drill</td>
			<td>Cell Point Scientific</td>
			<td>67-1000</td>
			<td>distributed e.g. by Harvard Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel burrs (0.5 &#181;m diameter)</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>19007-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artemia ssp.</td>
			<td>Sanders</td>
			<td>425GR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette (plastic, Pastette)</td>
			<td>Alpha Labs</td>
			<td>LW4111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin red S powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian blue 8 GX</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16 FA</td>
			<td>with QIMAGING RETIGA-SRV camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MVX10</td>
			<td>with Olympus DP71 or DP80 camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adult zebrafish injury models to study the effects of prednisolone in regenerating bone tissue

ゼブラフィッシュは切断後 (フィン) の付属肢を含む様々 な臓器を再生することができます。受傷後約 2 週間以内に復元する骨の再生が含まれます。さらに、ゼブラフィッシュ、スカルの穿頭後急速に骨を癒すし、ゼブラフィッシュ骨ひれ光線に簡単に導入することができます亀裂を修復することができます。これらの傷害アッセイは、急速に骨の形成に及ぼす投与薬をテストする実現可能な実験パラダイムを表現します。ここでは、これら 3 損傷モデルの使用と骨抑制と免疫抑制効果を発揮する全身性ステロイド治療との併用について述べる。アダルト ゼブラフィッシュにおける免疫抑制療法の準備、フィン切断、頭蓋骨の骨やひれ骨折の穿頭を実行する方法を示す、グルココルチコイドの使用で両方の骨の形成が与える影響について説明する方法でワークフローを提供します。骨芽細胞と骨の自然免疫の一部として単球/マクロファージ系統の細胞。

ここで提示されたプロトコルは、ゼブラフィッシュ フィンと頭蓋骨10、11,16の再生過程で急激な骨形成を誘導するために繰り返し使用されています。プレドニゾロン内服の提案手法と組み合わせて、骨再生中のプレドニゾロンの効果に関する研究を追求できます。たとえば、骨の形成と再生成する?...

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Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

骨組織の再生にプレドニゾロンの効果を研究する大人のゼブラフィッシュ傷害モデル

ここでは、3 アダルト ゼブラフィッシュ損傷モデルと免疫抑制薬の治療との併用について述べる。再生組織のイメージングに関するガイダンスをそこに骨石灰化を検出することに提供します。

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...

この方法は、特に骨の組織再生に対する薬物の悪影響を研究するための免疫抑制治療介入の分野における重要な質問に答えるのに役立つ。この技術の主な利点は、ゼブラフィッシュの骨再生の過去のモデルと、負傷したゼブラフィッシュを薬物補充魚水に浸漬させることによって全身薬物暴露と組み合わせることです。手順を開始する前に、1つのアルミニウム箔がゼブラフィッシュあたり600ミリリットルビーカーを覆い、実験のために魚の水のガラス瓶の適切な数をカバーし、目的の実験的制御溶液で免疫抑制薬を調製する。切断傷害のために、鈍い鉗子を使用して、100ミリメートルのペトリ皿の逆蓋の側面に麻酔をかけたゼブラフィッシュを慎重に置き、メスを使ってフィンの50%を切断します。その後、適切な実験剤で補われた魚の水の300ミリリットルを含むオートクレーブビーカーに魚を置き、ゼブラフィッシュの脱出を防ぐためにホイルでビーカーをカバーします。フィン骨折の傷害を誘発するには、解剖顕微鏡の下でペトリ皿をコーティングした100ミリメートルアガロースの両側側に麻酔付きゼブラフィッシュを置き、ひびが現れるまで注射針を骨ひれの線セグメントにわずかに押し込みます。これは、大幅に安定性を損なう可能性があるため、フィンにあまりにも多くの骨折を導入することが重要です。その後、適切な実験剤を補充魚水の300ミリリットルを含むオートクレーブビーカーに魚を転送します。カルバリアの頭蓋骨の損傷を生成するには、解剖顕微鏡の下でカルバリアの骨が容易に視覚化されるように、直立した位置に麻酔ゼブラフィッシュを保持します。500マイクロメートルのドリルビットを備えた回転マイクロドリルを前頭骨の中央に配置し、骨にそっと触れてマイクロドリルバリの大きさの穴を作ります。損傷を生じながらドリルを横に動かせず、組織の抵抗力が低下したらすぐに停止することが重要です。さもなければ、脳は損傷を受ける。その後、適切な実験剤を補充した魚の水の300ミリリットルを含むオートクレーブビーカーに魚を置きます。ゼブラフィッシュと魚の水を適切な一時的な容器に移し、新鮮な薬物補充魚の水でビーカーを補充することによって、ビーカーの水を毎日交換してください。その後、そのビーカーにゼブラフィッシュを返すために魚網を使用しています。合計2日間持続する治療のために、ゼブラフィッシュを養わない。より長い実験の間に、ゼブラフィッシュに0.5〜1ミリリットルの孵化したアルテミアSSPを2日ごとに供給する。フィン傷害分析のために、細かいを収穫し、切り株の一端でフィンをつかむために細かい鉗子を使用する。フォースプスの2番目のペアを使用して反対側の切り株の端をつかみ、冷たい4%PFAを含む皿の底にティッシュを10〜20秒間わずかに押し付けます。必要に応じてフィン平坦化を繰り返します。フィンは今カーリングなしで平らに横たわっているはずです。固定後の長期サンプル貯蔵のために、3回の20分間のPBS洗浄と上昇メタノールシリーズで組織を洗浄します。サンプルは、マイナス20°Cで100%メタノールで保存することができます。アリザリンレッド染色の場合、メタノール貯蔵サンプルを降順メタノールシリーズに再水和し、続いてPBSで20分間の洗浄を行い、脱イオン水で5分間洗浄します。最後の洗浄後、サンプル組織にアリザリンレッド溶液を加え、適切な染色期間に対してロッキングを使用して室温でサンプルをインキュベートします。サンプルをクリアするには、減少する1%水酸化グリセロール系列のカリウムで組織を治療します。その後、サンプルを1〜1~1%の水酸化カリウムに80%グリセロール溶液に保存し、80%グリセロールで組織を取り付けてイメージングします。カルセイン染色の場合、100ミリメートルのカルセイン溶液で最大3匹のゼブラフィッシュを、アルミニウム箔で覆われたガラスビーカーに20分間同時にインキュベートします。インキュベーションの終わりに、ゼブラフィッシュを魚の水の容器に移し、魚を短時間泳いでから魚の水の新しい容器に移します。2番目のビーカーで20分後にフィン再生のライブ画像を取得し、アガロースコーティングされたペトリ皿の上に麻酔ゼブラフィッシュを置き、ステレオ顕微鏡でフィンを画像化します。再生頭蓋骨の画像を取得するには、ゼブラフィッシュをスポンジに直立させ、蛍光顕微鏡で頭蓋骨を画像化します。プレドニゾロンによる治療, 他のグルココルチコイドと同様, 固定尾端のフィン組織のアリザリンレッド染色によって検出された骨形成を含むフィン再生の全体的な阻害につながります.同様に、薬物は、カルバリア頭蓋骨傷害閉鎖に対する遅延効果を有する。免疫抑制により、抗mCherryおよび抗GFP抗体染色およびトランスジェニックMPEG-1 mCherryを使用して、プレドニゾロン処理動物のゼブラフィッシュ頭蓋骨組織サンプル上のオスリックスNGFPゼブラフィッシュと交差することによって証明されるように、凍結組織切片上の免疫組織化学によって減少したマクロファージ数を検出することもできる。これらの手順を試みている間、非常に再現性の高い方法で傷害エッセイを行うことによって、骨再生速度の変動を最小限に抑えることが重要である。また、微生物感染を避けるために、オートクレーブされた魚の水を含むオートクレーブビーカーの単一の家ゼブラフィッシュにとっても重要です。このプロトコルは、グルココルチコイド作用の基礎となるメカニズムにさらに対処するのに役立ちます。例えば、グルココルチコイド誘発骨粗鬆症の文脈では、他の薬剤および他のゼブラフィッシュ骨の使用にも適応され得る。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

ゲンタマイシン誘発性損傷によって大人ゼブラフィッシュにおける腎再生

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

ゼブラフィッシュ胚における機械的血管損傷

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

ゼブラフィッシュ再生の分子機構を研究するためにテトンシステムの利用

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

条件を使用して、マウス腸の再生成にパネート細胞の役割を分析するためのプロトコル<em&gt;のCre-LOX</em&gt;マウスモデル

The epithelial surface of the mammalian intestine is a dynamic tissue that renews every 3 - 7 days. Understanding this renewal process identified a ...

Combining Intravital Fluorescent Microscopy (IVFM) with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Combining Intravital Fluorescent Microscopy IVFM with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

骨髄ニッチに造血細胞の生着のダイナミクスを研究する遺伝的モデルと生体内蛍光顕微鏡 (IVFM) を組み合わせること

Increasing evidence indicates that normal hematopoiesis is regulated by distinct microenvironmental cues in the BM, which include specialized cellular ...

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

ゼブラフィッシュジョーバイオメカニクスを調査するために有限要素モデルの構築

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

細胞非自律影響を研究するためのキメラゼブラフィッシュ胚における個々の網膜前駆細胞におけるトランスジェニック遺伝子発現のin vivoイメージング

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish

ゼブラフィッシュにおける急性アルコール性肝障害の組織学的解析

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

マウス二次口蓋融合のライブイメージング

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

郭清ときのこ体の免疫蛍光染色と大人のショウジョウバエ脳光受容器ニューロン

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...