Name: adult zebrafish injury models to study the effects of prednisolone in regenerating bone tissue
Uploaded: 2018-10-18T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue at JoVE.com

이 연구는 센터의 재생 치료 드레스덴의 ("Zebrafish 모델 glucocorticoid 유발 뼈 손실의 메커니즘을 해명 하기") 교부 금에 의해 그리고 또한 도이치 가운데 (Transregio 67, 프로젝트의 교부 금에 의해 지원 되었다 387653785) FK를. 우리는 그들의 지도 원조 뼈 다 귀 탄 미 익 광선에 calvariae 및 골절의 trepanation 수행에 대 한 1 월 Kaslin를 Avinash Chekuru 매우 감사. 실험 설계, 수행 되었고 KG와 FK에 의해 분석. FK 원고를 썼다. 우리 또한 카트린 램버트, 니콜 Cudak와 기술 지원 및 토론을 위한 Knopf와 브랜드 연구소의 다른 회원 들에 게 감사 하 고 싶습니다. 우리의 감사는 또한 Henriette Knopf와 원고를 교정에 대 한 조 쉬 커리 마리카 피셔와 훌륭한 물고기에 대 한 Jitka Michling을 갑니다.

여기에 설명 된 모든 방법 Landesdirektion 드레스덴에 의해 승인 (허가 번호: AZ 24 D-9168.11-1/2008-1, AZ 24-9168.11-1/2011-52, AZ 24-9168.11-1/2013-5, AZ 24-9168.11-1/2013-14, AZ DD24.1-5131/354/87).
1입니다. 재료 및 솔루션의 준비
참고: Prednisolone, 다른 스테로이드 제제와 같은 이끌어 낸다 면역 억제. 따라서, 실험 기간 동안 치료 동물에 감염을 방지 하기 위해 예방 조치를가지고 한다. ...

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Zebrafish는 많은 관계에서 골격 연구에 유용한 입증 했다. 선택 된 돌연변이 모방 골 imperfecta 등 관절염23,,2425,26,27, 인간 질병의 측면 그리고 애벌레 뿐만 아니라 저울에 사용 되 고 있습니다. 작은 분자 스크린7,,28<sup class="xr...

Zebrafish는 척추 개발 및 질병 연구에 강력한 동물 모델을 나타냅니다. 그들은 매우 잘 번 식 하는 작은 동물 및 그들의 게놈은 완전히 시퀀스이 고 조작1의무가 있다는 사실 때문입니다. 다른 장점은 지속적인된 라이브 이미징 vivo에서 화상 진 찰 성인 zebrafish2, 및 높은 처리량 약 스크린 zebrafish 애벌레3에서 수행할 수 있는 능력을 포함 한 여러 단계에서 수행 하는 옵션을 포함 합니다. 또한, zebrafish 장기와 조직, 뼈 등의 다양 한에서 높은 재생 능력을 보유 하 고 따라서 골격 질환을 연구 하 고 수리4,5유용한 시스템 역할.
Glucocorticoid 골다공증 (GIO) 예 천식이 나 류 마티스 관절염과 같은 자가 면역 질환 치료 과정에서 스테로이드 제제와 장기 치료에서 결과 질병 이다. GIO는 glucocorticoid 치료 환자의 약 30%에서 개발 하 고 주요 건강 문제6;를 나타냅니다. 따라서, 그것은 훌륭한 세부 사항에서 뼈 조직에 면역 억제에 미치는 영향을 조사 하는 것이 중요입니다. 최근 몇 년 동안에서 다양 한 GIO의 병 인을 다루는 zebrafish 모델 개발 되었습니다. Glucocorticoid 중재 뼈 손실 zebrafish 애벌레, 예를 들어 마약 화면7뼈 질량을 증가 하는 counteractive 화합물의 식별에 지도에서 유발 되었습니다. 또한, 뼈 glucocorticoid 유발 억제 효과에 유사 되었습니다가지고 zebrafish 비늘 생체 외에서 그리고 vivo에서8,9. 이 분석 실험은 매우 설득력 있는 접근, 그것에 관해서 특히 소설 면역과 뼈 근육 약물의 식별. 그러나, 그들은 부분적으로 endoskeleton 고려 하 고 재생 컨텍스트에서 수행 되지. 따라서, 그들은 성인, 재생 뼈 형성의 빠른 모드 동안 glucocorticoid 중재 효과의 조사를 허용 하지 않습니다.
여기, 선물이 성인 zebrafish 뼈 재생을 겪고 glucocorticoid 중재 효과 공부 하는 연구자를 사용 하는 프로토콜. 부상 모델은 zebrafish 꼬리 지 느 러 미, 지 느 러 미 레이 골절 (그림 1A-1 C)의 창조 뿐만 아니라, 두개골의 trepanation의 부분 절단을 포함 하 고 glucocorticoid 노출을 통해 인큐베이션 (그림 1E와 결합 ). 최근 성인 zebrafish 지 느 러 미와 두개골 뼈10회생에 prednisolone, 일반적으로 된 코르 티 코 스테로이드 약물 중 하나에 노출의 결과 설명 하기 위해이 프로토콜의 일부를 사용 했습니다. Zebrafish에 prednisolone 관리 감소 osteoblast 확산, 불완전 osteoblast 차별화 및 monocyte/대 식 세포 계보10apoptosis의 급속 한 유도 이끌어 낸다. 이 프로토콜에서 우리 또한 설명 어떻게 골절 한 뼈 핀 레이 세그먼트11, 도입 하실 수 있습니다이 방법은 골절 복구 중 발생 하는 뼈에 glucocorticoid 중재 효과 공부를 할 때 유용할 수 있습니다. 여기에 제시 된 방법을 빠르게 뼈 재생에 glucocorticoid 행동의 메커니즘을 기본 추가 주소에 도움이 될 것입니다 그리고 zebrafish 조직 재생의 맥락에서 체계적 약국의 다른 설정에도 사용할 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Prednisolone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt forceps</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>BD027R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Braun</td>
			<td>5518059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>840004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection needle (0.3x13 mm)</td>
			<td>BD Beckton Dickinson</td>
			<td>30400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro drill</td>
			<td>Cell Point Scientific</td>
			<td>67-1000</td>
			<td>distributed e.g. by Harvard Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel burrs (0.5 &#181;m diameter)</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>19007-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artemia ssp.</td>
			<td>Sanders</td>
			<td>425GR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette (plastic, Pastette)</td>
			<td>Alpha Labs</td>
			<td>LW4111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin red S powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian blue 8 GX</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16 FA</td>
			<td>with QIMAGING RETIGA-SRV camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MVX10</td>
			<td>with Olympus DP71 or DP80 camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adult zebrafish injury models to study the effects of prednisolone in regenerating bone tissue

Zebrafish 절단 후 부속 (핀)를 포함 하 여 다양 한 장기를 다시 생성할 수 있습니다. 이 부상 후 약 2 주 이내 regrows 뼈의 재생을 포함 한다. 또한, zebrafish trepanation는 두개골의 후 뼈를 빠르게 치유 하 고 복구 zebrafish 뼈 탄 미 익 광선에 쉽게 도입 될 수 있는 골절 수 있습니다. 이러한 상해 분석 빠르게 뼈 형성에 관리 약물의 효과 테스트 가능한 실험 패러다임을 나타냅니다. 여기, 우리는 이러한 3 부상 모델의 사용과 뼈 억제 하 고 면역 억제 효과 미치는 조직의 glucocorticoid 치료와 함께 그들의 결합된 사용 설명. 우리 성인 zebrafish에 면역 억제 치료에 대 한 준비, 지 느 러 미 절단, calvarial 뼈와 지 느 러 미 골절의 trepanation 수행 하는 방법을 설명 하 고 스테로이드 제제의 사용에 미치는 두 뼈 형성을 설명 하는 방법에 대 한 워크플로우를 제공 osteoblasts 그리고 뼈 조직에 있는 타고 난 면제의 일부로 monocyte/대 식 세포 계보의 세포.

여기에 제시 된 프로토콜 zebrafish 지 느 러 미와 두개골10,,1116의 재생 과정에서 급속 한 골 형성을 유도 하기 위해 반복적으로 사용 되었습니다. 함께 제시 방법의 prednisolone 관리, 뼈 재생 동안 prednisolone의 효과 대 한 연구를 추구 수 있습니다. 예를 들어 뼈 형성과 재생성에서 강화에 대 한 연구를 수행?...

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Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

성인 Zebrafish 부상 모델 뼈 조직 재생에 Prednisolone의 효과 연구

여기, 우리 3 성인 zebrafish 부상 모델 및 면역 억제 약물 치료와 결합 된 그들의 사용을 설명합니다. 우리는 거기에 뼈 강화 작용을 감지 및 조직 재생의 이미징에 지침을 제공 합니다.

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...

이 방법은 조직 재생, 특히 뼈에 약물의 부작용을 연구하기위한 면역 억제 치료 개입 분야에서 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 제브라피쉬 뼈 재생의 과거 모델과 약물 보충 생선물에 부상당한 제브라피시의 침수로 전신 약물 노출을 결합한다는 것입니다. 절차를 시작하기 전에, 오토클레이브 1 알루미늄 호일은 제브라피시 당 600 밀리리터 비커와 실험을 위한 적절한 수의 물고기 물 병과 실험용 실험 제어 솔루션에서 면역 억제 약물을 준비합니다.절단 부상의 경우, 무딘 집게를 사용하여 100mm 페트리 접시의 역쪽 뚜껑에 마취 된 얼룩말 피시를 조심스럽게 배치하고 메스를 사용하여 지느러미의 50 %를 절제하십시오. 그런 다음 적절한 실험제로 보충된 300밀리리터의 생선물을 함유한 오토클레이브 비커에 물고기를 넣고 비커를 호일로 덮어 얼룩말피 탈출을 방지합니다. 지느러미 골절 부상을 유도하기 위해, 해부 현미경 아래에 페트리 접시를 코팅 100밀리미터 아가로즈에 마취 된 얼룩말 피시를 배치하고 균열이 나타날 때까지 뼈 지느러미 선 세그먼트에 살두구 바늘을 약간 밀어 넣습니다.이 크게 안정성을 손상 시킬 수 있기 때문에 지느러미에 너무 많은 골절을 소개 하는 것이 중요 하다. 그런 다음 적절한 실험제로 보충된 300밀리리터의 어수질이 들어 있는 오토클레이브 비커로 물고기를 옮킨다. 칼변종 두개골 부상을 생성하려면 마취된 Zebrafish를 똑바로 세워서 해부 현미경으로 쉽게 볼 수 있습니다.정면 뼈의 중앙에 500 마이크로미터 드릴 비트가 장착된 회전 마이크로 드릴을 놓고 뼈를 부드럽게 터치하여 마이크로 드릴 버 크기의 구멍을 생성합니다. 부상을 생성하는 동안 측면으로 드릴을 이동하지 않고 조직의 저항이 떨어지면 즉시 중지하는 것이 중요합니다. 그렇지 않으면 뇌가 손상됩니다.그런 다음 적절한 실험제로 보충된 300밀리리터의 어수물이 들어 있는 오토클레이브 비커에 물고기를 넣습니다. 얼룩말물고기와 생선물을 적절한 임시 용기로 옮기고 비커를 신선한 약으로 보충한 생선물로 리필하여 매일 비커의 물을 바꿉니다. 그런 다음 생선 그물을 사용하여 제브라피시를 비커로 되돌려 보입니다.총 2일까지 지속되는 트리트먼트의 경우 Zebrafish를 먹이지 마십시오. 더 긴 실험 동안, 부화 아르테미아 SSP의 0.5 ~ 1 밀리리터로 얼룩말 피시를 먹이는 것은 매일 마다. 지느러미 부상 분석을 위해, 미세 한 집게를 사용하여 그루터기의 한 가장자리에 지느러미를 잡습니다.두 번째 포셉을 사용하여 반대 그루터기 가장자리를 잡고 10~20초 동안 차가운 4%PFA가 포함된 접시 바닥에 티슈를 약간 누릅니다. 필요에 따라 핀 평평하게 반복합니다. 지느러미는 이제 컬링없이 평평하게 놓여야합니다.고정 후 장기 시료 보관을 위해, 3 개의 20 분 PBS 세척 및 상승 메탄올 시리즈로 조직을 세척하십시오. 그런 다음 샘플은 영하 20도에서 100 % 메탄올에 저장할 수 있습니다. Alizarin Red 염색의 경우, 내림차순 메탄올 계열에 저장된 메탄올 저장 샘플을 수분한 다음 PBS에서 20분 세척하고 15분 동안 분해된 물로 세척합니다.마지막 세척 후, 샘플 조직에 Alizarin 레드 솔루션을 추가하고 적절한 염색 기간 동안 흔들로 실온에서 샘플을 배양합니다. 샘플을 지우려면, 감소 1 % 칼륨 수산화 글리세롤 시리즈로 조직을 치료. 그런 다음 샘플을 1 대 1 0.1 % 글리세롤 용액에 1 ~ 1 %의 글리세롤 용액에 저장하고 상상을위한 80 % 글리세롤로 조직을 장착하십시오.칼신 염색의 경우 알루미늄 호일로 덮인 유리 비커로 20분 동안 칼신 용액 100mm에서 최대 3마리의 Zebrafish를 동시에 배양합니다. 잠복이 끝나면 Zebrafish를 물고기 물 용기로 옮기고 물고기가 잠깐 수영을 한 후 새로운 물고기 물 용기로 옮기십시오. 두 번째 비커에서 20분 후 지느러미 재생의 라이브 이미지를 획득한 후, 마취된 얼룩말피쉬를 아가로즈 코팅 페트리 접시에 놓고 스테레오 현미경으로 지느러미를 이미지화합니다.재생 두개골 뼈의 이미지를 수집하려면, 스폰지에 똑바로 얼룩말 물고기를 배치하고 형광 현미경 검사법에 의해 두개골을 이미지. Prednisolone로 치료, 다른 글루코코르티코이드와 유사, 고정 된 caudal 지느러미 조직의 알리자린 레드 염색에 의해 검출된 바와 같이 뼈 형성을 포함 하 여 지느러미 재생의 전반적인 억제에 이르게. 마찬가지로, 약물은 calvarial 두개골 부상 폐쇄에 지연 효과.면역 억제로 인해, 감소된 대식세포 숫자는 또한 항mCherry 및 항GFP 항체 염색 및 형질전환 MPEG-1 mCherry를 사용하여 입증된 바와 같이 냉동 조직 단면도에 면역조직화학에 의해 검출될 수 있고, 제브라피시 두개골 조직 샘플에 Osterix NGFP 제브라피시와 교차하여 처리된 동물에서. 이러한 절차를 시도하는 동안 매우 재현 가능한 방식으로 부상 에세이를 수행하여 뼈 재생 속도의 가변성을 최소화하는 것이 중요합니다. 또한 미생물 감염을 피하기 위해 오토클레이브 생선물을 함유한 오토클레이브 비커의 제브라피쉬(Zebrafish)를 단독으로 보관하는 것도 중요합니다.이 프로토콜은 글루코코르티코이드 작용의 기본 메커니즘을 더 해결하는 데 도움이 될 것입니다. 예를 들어, 글루코코르티코이드 유도 골다공증의 맥락에서 다른 약물 및 기타 Zebrafish 뼈의 사용에 맞게 조정될 수도 있다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

겐타 마이신 유도 부상으로 성인 Zebrafish의에서 신장 재생

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

연구

발생학

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Zebrafish의 태아에서 기계 선박 부상

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

코스닥 시스템의 사용은 분자 메커니즘 Zebrafish의 재생의 연구를

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

조건을 사용하여 쥐 소장에서 재생성 Paneth 세포의 역할을 분석하기위한 프로토콜<em&gt; Cre 호텔-LOX</em&gt; 마우스 모델

The epithelial surface of the mammalian intestine is a dynamic tissue that renews every 3 - 7 days. Understanding this renewal process identified a ...

Combining Intravital Fluorescent Microscopy (IVFM) with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Combining Intravital Fluorescent Microscopy IVFM with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Intravital 형광 현미경 검사 법 (IVFM)를 결합 하 여 유전자 모델 골 틈새에 조 혈 모 세포의 Engraftment 역학을 공부 하

Increasing evidence indicates that normal hematopoiesis is regulated by distinct microenvironmental cues in the BM, which include specialized cellular ...

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

Zebrafish의 턱 역학을 조사하기 위해 유한 요소 모델을 구축

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

키메라 Zebrafish의 태아의 개별 망막 전구 세포의 형질 전환 유전자 발현의 생체 내 이미징에서 세포 비 자립적 영향을 연구하기 위해

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish

Zebrafish에서의 급성 알코올성 간 손상의 조직 학적 분석

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Mouse Secondary Palate Fusion의 라이브 이미징

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

해 부 및 Immunofluorescent 얼룩의 버섯 몸과 성인 초파리 melanogaster 두뇌 신경 세포 포토 리셉터

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...