Name: adult zebrafish injury models to study the effects of prednisolone in regenerating bone tissue
Uploaded: 2018-10-18T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue at JoVE.com

Denne studien ble støttet av en bevilgning i den Center for regenerativ terapier Dresden ("sebrafisk som modell å rakne mekanismer for glukokortikoid-indusert bentap"), og i tillegg av en bevilgning av Deutsche Forschungsgemeinschaft (Transregio 67, prosjekt 387653785) til FK. Vi er svært takknemlig til Jan Kaslin og Avinash Chekuru for deres veiledning og hjelp på å utføre trepanation av calvariae og frakturer i benete fin stråler. Eksperimenter ble designet, utført og analyseres av KG og FK. FK skrev manuskriptet. Vi vil også gjerne takke Katrin Lambert, Nicole Cudak, og andre medlemmer av Knopf og merke laboratorier for kundestøtte og diskusjon. Vår takk går også til Marika Fischer og Jitka Michling for god fisk pleie og Henriette Knopf og Josh Currie for korrekturlesing av manuskriptet.

Alle metodene som er beskrevet her ble godkjent av Landesdirektion-Dresden (tillater tall: AZ 24D-9168.11-1/2008-1, AZ 24-9168.11-1/2011-52, AZ 24-9168.11-1/2013-5, AZ 24-9168.11-1/2013-14, AZ DD24.1-5131/354/87).
1. forberedelse av materialer og løsninger
Merk: Prednisolon, som andre glukokortikoider, fører til immunsuppresjon. Dermed må forholdsregler tas å hindre infeksjon i behandlede dyr under eksperimentet. Denne slutten, autoklav glass ware og "fisk vann" (...

<ol>
	<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book. A Guide for The Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). 385, (2000).</li><li>Xu, C., Volkery, S., Siekmann, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intubation-based+anesthesia+for+long-term+time-lapse+imaging+of+adult+zebrafish.">Intubation-based anesthesia for long-term time-lapse imaging of adult zebrafish.</a> Nature Protocols. 10 (12), 2064-2073 (2015).</li><li>Kaufman, C. K., White, R. M., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetic+screening+in+the+zebrafish+embryo.">Chemical genetic screening in the zebrafish embryo.</a> Nature Protocols. 4 (10), 1422-1432 (2009).</li><li>Paul, S., Crump, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+on+skeletal+cell+plasticity+from+studying+jawbone+regeneration+in+zebrafish.">Lessons on skeletal cell plasticity from studying jawbone regeneration in zebrafish.</a> Bonekey Reports. 5, 853 (2016).</li><li>Witten, P. E., Harris, M. P., Huysseune, A., Winkler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+teleost+fish+provide+new+insights+into+human+skeletal+diseases.">Small teleost fish provide new insights into human skeletal diseases.</a> Methods in Cell Biology. 138, 321-346 (2017).</li><li>den Uyl, D., Bultink, I. E., Lems, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+glucocorticoid-induced+osteoporosis.">Advances in glucocorticoid-induced osteoporosis.</a> Current Rheumatology Reports. 13 (3), 233-240 (2011).</li><li>Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+high+content,+in+vivo+model+of+glucocorticoid-induced+osteoporosis.">A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis.</a> Biotechnology Journal. 1 (6), 651-655 (2006).</li><li>de Vrieze, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prednisolone+induces+osteoporosis-like+phenotype+in+regenerating+zebrafish+scales.">Prednisolone induces osteoporosis-like phenotype in regenerating zebrafish scales.</a> Osteoporosis International. 25 (2), 567-578 (2014).</li><li>Pasqualetti, S., Congiu, T., Banfi, G., Mariotti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alendronate+rescued+osteoporotic+phenotype+in+a+model+of+glucocorticoid-induced+osteoporosis+in+adult+zebrafish+scale.">Alendronate rescued osteoporotic phenotype in a model of glucocorticoid-induced osteoporosis in adult zebrafish scale.</a> International Journal Of Experimental Pathology. 96 (1), 11-20 (2015).</li><li>Geurtzen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+Suppressive+and+Bone+Inhibitory+Effects+of+Prednisolone+in+Growing+and+Regenerating+Zebrafish+Tissues.">Immune Suppressive and Bone Inhibitory Effects of Prednisolone in Growing and Regenerating Zebrafish Tissues.</a> Journal of Bone and Mineral Research. , (2017).</li><li>Geurtzen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+osteoblasts+dedifferentiate+in+response+to+traumatic+bone+injury+in+the+zebrafish+fin+and+skull.">Mature osteoblasts dedifferentiate in response to traumatic bone injury in the zebrafish fin and skull.</a> Development. 141 (11), 2225-2234 (2014).</li><li>Matthews, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthesia+and+euthanasia+in+zebrafish.">Anesthesia and euthanasia in zebrafish.</a> Institute of Laboratory Animal Resources Journal. 53 (2), 192-204 (2012).</li><li>Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf+signaling+instructs+position-dependent+growth+rate+during+zebrafish+fin+regeneration.">Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration.</a> Development. 132, 5173-5183 (2005).</li><li>Hirasawa, T., Kuratani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+vertebrate+skeleton:+morphology,+embryology,+and+development.">Evolution of the vertebrate skeleton: morphology, embryology, and development.</a> Zoological Letters. 1, 2 (2015).</li><li>Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+of+neuroepithelial-like+and+radial+glia-like+progenitor+cells+in+cerebellar+regeneration.">Distinct roles of neuroepithelial-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration.</a> Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).</li><li>Knopf, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerates+via+Dedifferentiation+of+Osteoblasts+in+the+Zebrafish+Fin.">Regenerates via Dedifferentiation of Osteoblasts in the Zebrafish Fin.</a> Developmental Cell. 20 (5), 713-724 (2011).</li><li>van Eeden, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+affecting+somite+formation+and+patterning+in+the+zebrafish,+Danio+rerio.">Mutations affecting somite formation and patterning in the zebrafish, Danio rerio.</a> Development. 123, 153-164 (1996).</li><li>Walker, M. B., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-color+acid-free+cartilage+and+bone+stain+for+zebrafish+larvae.">A two-color acid-free cartilage and bone stain for zebrafish larvae.</a> Biotechnic &amp; Histochemistry. 82 (1), 23-28 (2007).</li><li>Kyritsis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+inflammation+initiates+the+regenerative+response+in+the+adult+zebrafish+brain.">Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain.</a> Science. 338 (6112), 1353-1356 (2012).</li><li>Oppedal, D., Goldsmith, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+screen+to+identify+novel+inhibitors+of+fin+regeneration+in+zebrafish.">A chemical screen to identify novel inhibitors of fin regeneration in zebrafish.</a> Zebrafish. 7 (1), 53-60 (2010).</li><li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish.">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).</li><li>Spoorendonk, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+and+Cyp26b1+are+critical+regulators+of+osteogenesis+in+the+axial+skeleton.">Retinoic acid and Cyp26b1 are critical regulators of osteogenesis in the axial skeleton.</a> Development. 135 (22), 3765-3774 (2008).</li><li>Gioia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chaperone+activity+of+4PBA+ameliorates+the+skeletal+phenotype+of+Chihuahua,+a+zebrafish+model+for+dominant+osteogenesis+imperfecta.">The chaperone activity of 4PBA ameliorates the skeletal phenotype of Chihuahua, a zebrafish model for dominant osteogenesis imperfecta.</a> Human Molecular Genetics. 26 (15), 2897-2911 (2017).</li><li>Fiedler, I. A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severely+impaired+bone+material+quality+in+Chihuahua+zebrafish+resembles+classical+dominant+human+osteogenesis+imperfecta.">Severely impaired bone material quality in Chihuahua zebrafish resembles classical dominant human osteogenesis imperfecta.</a> Journal of Bone and Mineral Research. , (2018).</li><li>Fisher, S., Jagadeeswaran, P., Halpern, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiographic+analysis+of+zebrafish+skeletal+defects.">Radiographic analysis of zebrafish skeletal defects.</a> Developmental Biology. 264 (1), 64-76 (2003).</li><li>Hayes, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+deformity+in+aged+zebrafish+is+accompanied+by+degenerative+changes+to+their+vertebrae+that+resemble+osteoarthritis.">Spinal deformity in aged zebrafish is accompanied by degenerative changes to their vertebrae that resemble osteoarthritis.</a> PLoS One. 8 (9), e75787 (2013).</li><li>Mitchell, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+osteoarthritis+genetics+in+zebrafish.">New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish.</a> Osteoarthritis Cartilage. 21 (2), 269-278 (2013).</li><li>Fleming, A., Sato, M., Goldsmith, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+in+vivo+screening+for+bone+anabolic+compounds+with+zebrafish.">High-throughput in vivo screening for bone anabolic compounds with zebrafish.</a> Journal of Biomolecular Screening. 10 (8), 823-831 (2005).</li><li>de Vrieze, E., Zethof, J., Schulte-Merker, S., Flik, G., Metz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+osteogenic+compounds+by+an+ex+vivo+sp7:luciferase+zebrafish+scale+assay.">Identification of novel osteogenic compounds by an ex vivo sp7:luciferase zebrafish scale assay.</a> Bone. 74, 106-113 (2015).</li></ol>

Sebrafisk har vist seg nyttig i skjelettlidelser forskning i mange forhold. Valgte mutanter etterligner aspekter av menneskelig sykdom som osteogenesis imperfecta eller slitasjegikt23,24,25,26,27, og Larvene samt skalaer brukes til å identifisere bein anabole forbindelser små molekyl skjermer7,28<sup...

Sebrafisk representerer en kraftig dyremodell virveldyrenes utvikling og sykdom. Dette er på grunn av at de er små dyr som rase svært godt og at deres genom er fullt sekvensert og mottakelig for manipulasjon-1. Andre fordeler inkluderer muligheten til å utføre fortsatt live bildebehandling på ulike stadier, inkludert i vivo avbilding av voksen sebrafisk2og utføre høy gjennomstrømning narkotika skjermer i sebrafisk Larvene3. I tillegg sebrafisk har regenerativ bæreevne på en rekke organer og vev inkludert bein, og dermed tjene som en nyttig måte å studere skjelettlidelser sykdom og reparere4,5.
Glukokortikoid-indusert osteoporose (GIO) er en sykdom som resultat av langsiktig behandling med glukokortikoider, for eksempel i løpet av autoimmune sykdommer behandling som astma eller revmatoid artritt. GIO utvikler ca 30% av glukokortikoid-behandlede pasienter og representerer en store helsemessige problemet6; Derfor er det viktig å undersøke virkningen av immunsuppresjon på benvev i stor detalj. De siste årene en rekke sebrafisk modeller håndtere patogenesen av GIO er utviklet. Glukokortikoid-mediert bentap har blitt indusert i sebrafisk larver, for eksempel som førte til identifisering av counteractive forbindelser økt benmasse i en narkotika-skjermen7. Videre glukokortikoid-indusert bein hemmende effekten har blitt etterlignet i sebrafisk skaleres både i vitro og vivo8,9. Disse analyser er veldig overbevisende tilnærminger, spesielt når det gjelder identifisering av romanen suppressive og bein anabole stoffer. Men de bare delvis hensyn endoskeleton og utført ikke i en regenererende sammenheng. Derfor tillater de ikke etterforskningen av glukokortikoid-mediert effekter under rask moduser av voksen, regenererende bein formasjon.
Her presenterer vi en protokoll slik at forskere til å studere glukokortikoid-mediert effekter på voksen sebrafisk bein under gjenfødelse. Skade modeller inkluderer delvis amputasjon av sebrafisk halefinnen, trepanation av skallen og etableringen av fin ray sprekker (figur 1A-1 C), og kombineres med glukokortikoid eksponering via inkubering (figur 1E ). Vi har nylig brukt en del av denne protokollen til å beskrive konsekvensene av eksponering for prednisolon, en av foreskrevne kortikosteroid narkotika, voksen sebrafisk regenererende fin og skallen Ben10. I sebrafisk fører prednisolon administrasjon til redusert osteoblast spredning, ufullstendig osteoblast differensiering og raske induksjon av apoptose i monocytt/macrophage avstamning10. I denne protokollen, også beskriver vi hvordan brudd kan bli introdusert i enkelt benete fin ray segmenter11, som denne tilnærmingen kan være nyttig når studere glukokortikoid-mediert effekter på bein som oppstår under brudd reparasjon. Metodene presenteres her vil bidra til ytterligere adresse underliggende virkningsmekanismer glukokortikoid i raskt regenererende bein og kan også brukes i andre innstillinger for systemisk narkotika administrasjon i konteksten av sebrafisk vev gjenfødelse.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Prednisolone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt forceps</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>BD027R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Braun</td>
			<td>5518059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>840004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection needle (0.3x13 mm)</td>
			<td>BD Beckton Dickinson</td>
			<td>30400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro drill</td>
			<td>Cell Point Scientific</td>
			<td>67-1000</td>
			<td>distributed e.g. by Harvard Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel burrs (0.5 &#181;m diameter)</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>19007-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artemia ssp.</td>
			<td>Sanders</td>
			<td>425GR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette (plastic, Pastette)</td>
			<td>Alpha Labs</td>
			<td>LW4111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin red S powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian blue 8 GX</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16 FA</td>
			<td>with QIMAGING RETIGA-SRV camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MVX10</td>
			<td>with Olympus DP71 or DP80 camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adult zebrafish injury models to study the effects of prednisolone in regenerating bone tissue

Sebrafisk kan generere ulike organer, inkludert vedheng (svømmeføtter) etter amputasjon. Dette innebærer fornyelse av bein, som regrows omtrent to uker etter skader. Videre sebrafisk kan helbrede bein raskt etter trepanation av skallen, og reparere sprekker som lett kan bli introdusert i sebrafisk benete fin stråler. Disse skade analyser representerer mulig eksperimentelle paradigmer å teste effekten av administrert medikamenter på raskt danner bein. Her beskriver vi bruk av disse 3 skader modeller og deres kombinert bruk med systemisk glukokortikoid behandling, som utøver bein hemmende og suppressive effekter. Vi gir en arbeidsflyt på hvordan å forberede suppressive behandling i voksen sebrafisk, illustrerer utføre fin amputasjon, trepanation calvarial bein og fin frakturer, og beskriver hvordan bruk av glukokortikoider påvirker begge Ben danner osteoblasts og cellene i monocytt/macrophage linjen som en del av medfødt immunitet i benvev.

Protokollen presenteres her er brukt gjentatte ganger å skape rask bein i regenerering av sebrafisk fin og skull10,11,16. I kombinasjon med metoden presentert av prednisolon administrasjon, kan studier på prednisolons effekter under bein regenerasjon gjennomføres. For eksempel kan studier på bein dannelse og mineralisering i regenerere utføres. Prednisolon, fører som andre glukokortikoider<...

Watch this Scientific Journal Video about Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue at JoVE.com

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Voksen sebrafisk skade modeller for å studere virkningene av prednisolon i å regenerere benvev

Her beskriver vi 3 voksne sebrafisk skader modeller og kombinert bruk med suppressive behandling. Vi gir veiledning på bildebehandling av regenererende vev og oppdage bein mineralisering der.

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål innen immunsuppressiv terapeutisk intervensjon for å studere de negative effektene av legemidler på vevregenerering, spesielt i bein. Den største fordelen med denne teknikken er at den kombinerer tidligere modeller av Sebrafisk bein regenerering med systemisk narkotika eksponering ved nedsenking av den skadede Sebrafisk i stoffet supplert fiskevann. Før prosedyren begynte prosedyren, autoklav en aluminiumsfolie dekket 600 milliliter beger per Sebrafisk og et passende antall glassflasker med fiskevann for eksperimentet og forberede immunsuppressive stoffet i eksperimentelle kontrollløsninger av interesse.For en amputasjonsskade, bruk stumpe tang til å nøye plassere en bedøvet Sebrafisk på sidesiden på det innverserte lokket på en 100 millimeter petriskål og bruk en skalpell til å sette 50% av finnen på nytt. Legg deretter fisken i et autoklavet beger som inneholder 300 milliliter fiskevann supplert med passende eksperimentelt middel og dekk begeret med folie for å hindre sebrafiskflukt. For å indusere en fin bruddskade, legg en bedøvet sebrafisk på sidesiden i en 100 millimeter agarosebelagt Petriskål under et dissekerende mikroskop og skyv en injeksjonsnål litt inn i et benete finstrålesegment til en sprekk vises.Det er viktig å innføre ikke for mange brudd i finnen fordi dette kan svekke stabiliteten. Deretter overføre fisken til et autoklavet beger som inneholder 300 milliliter fiskevann supplert med riktig eksperimentelt middel. For å generere en calvarial hodeskalleskade, hold en bedøvet sebrafisk i oppreist stilling slik at kalkbeinene lett visualiseres under et disseksjonsmikroskop.Plasser en roterende mikrobor utstyrt med en 500 mikrometerborebit over midten av frontbenet og berør forsiktig beinet for å produsere et hull på størrelse med mikroboregraden. Det er viktig å ikke flytte boret sidealt mens du produserer skaden og å stoppe umiddelbart når motstanden av vevet faller. Ellers vil hjernen bli skadet.Plasser deretter fisken i et autoklavet beger som inneholder 300 milliliter fiskevann supplert med riktig eksperimentelt middel. Bytt vannet i begeret daglig ved å overføre sebrafisken og fiskevannet til en passende midlertidig beholder og fylle begeret med ferskt stoff supplert fiskevann. Bruk deretter et fiskenett til å returnere sebrafisken til begeret.For behandlinger som varer opptil to dager totalt, ikke mate Sebrafisk. Under lengre eksperimenter, mate Sebrafisk med 0,5 til en milliliter klekket Artemia SSP annenhver dag. For finskadeanalyse høster du boten og bruker fine tang for å gripe finnen på den ene kanten av stubben.Bruk et annet par tang for å ta tak i den motsatte stubbekanten og trykk litt vevet på bunnen av parabolen som inneholder kald 4% PFA i 10 til 20 sekunder. Gjenta finflating etter behov. Finnen skal nå ligge flat uten curling.For langsiktig prøvelagring etter fiksering, vask vevet med tre 20 minutters PBS vasker og en stigende metanol-serie. Prøvene kan deretter lagres i 100% metanol ved minus 20 grader Celsius. For Alizarin Red farging, rehydrere metanol lagret prøver i en synkende metanol serie etterfulgt av to 20 minutters vasker i PBS og en fem minutters vask i deionisert vann.Etter siste vask, legg Alizarin Red løsning til prøvevevet og inkuber prøven ved romtemperatur med gynge for riktig fargeperiode. For å fjerne prøvene, behandle vevet med den avtagende 1% kaliumhydroksidglyserolserien. Oppbevar deretter prøvene i en til en 0,1% kaliumhydroksid til 80% glyseroloppløsning og monter vevet med 80% glyserol for å forestille seg.For Calcein farging, inkuber opptil tre Sebrafisk samtidig i 100 millimeter Calcein løsning i 20 minutter i et glassbeger dekket med aluminiumsfolie. På slutten av inkubasjonen, overfør Sebrafisken til en beholder med fiskevann og la fisken svømme kort før du overfører dem til en ny beholder med fiskevann. Etter 20 minutter i det andre begeret for å skaffe levende bilder av fin regenererer, plasser en bedøvet Sebrafisk på en agarose belagt Petri parabolen og bilde finnen ved stereo mikroskopi.For å skaffe bilder av de regenererende skallebeinene, legg Sebrafisken oppreist i en svamp og bilde skallen ved fluorescensmikroskopi. Behandling med Prednisolon, lik andre glukokortikoider, fører til en generell hemming av fin regenerering inkludert bendannelse som påvist av Alizarin Red farging av fast caudal fin vev. På samme måte har stoffet forsinkende effekt på calvarial skallen skade nedleggelse.På grunn av immunsuppresjon kan reduserte makrofagstall også oppdages ved immunohistokjemi på frosne vevsseksjoner som det fremgår av å bruke anti-mCherry og anti-GFP antistofffarging og transgen MPEG-1 mCherry krysset med Osterix NGFP Zebrafish på Zebrafish skallevevsprøver fra Prednisolone behandlet dyr. Mens du prøver disse prosedyrene er det viktig å minimere variasjonen i beinregenereringshastigheten ved å utføre skadeessayene på en svært reproduserbar måte. Det er også avgjørende for enkelthus Zebrafish i autoklaverte beger som inneholder autoklavet fiskevann for å unngå mikrobiell infeksjon.Denne protokollen vil bidra til å ytterligere løse de underliggende mekanismene for glukokortikoid handling. For eksempel, i sammenheng med glukokortikoid indusert osteoporose og kan også tilpasses for bruk av andre legemidler og andre Sebrafisk bein.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

Nyre Regeneration i Adult Sebrafisk av Gentamicin Induced Injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Mekanisk Vessel Injury i sebrafisk embryo

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

Bruk av Teton system for å studere molekylære mekanismer av Sebrafisk Regeneration

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

Protokoller for Analysere rolle Paneth Cells i Regenerering muse tarmen ved hjelp Conditional<em&gt; Cre-lox</em&gt; Musemodeller

The epithelial surface of the mammalian intestine is a dynamic tissue that renews every 3 - 7 days. Understanding this renewal process identified a ...

Combining Intravital Fluorescent Microscopy (IVFM) with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Combining Intravital Fluorescent Microscopy IVFM with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Kombinerer Intravital fluorescerende mikroskopi (IVFM) med genetisk modeller å studere Engraftment dynamikken i blodkreft cellene benmarg nisjer

Increasing evidence indicates that normal hematopoiesis is regulated by distinct microenvironmental cues in the BM, which include specialized cellular ...

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

Bygge Finite Element Modeller for å etterforske sebrafisk Jaw Biomekanikk

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In vivo avbildning av transgene genuttrykk i Individuell Netthinnestamfedre i kimære Sebrafisk embryoer å studere Cell Nonautonomous Influences

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish

Histologiske analyser av akutt alkoholskader i sebrafisk

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Disseksjon og Immunofluorescent flekker av sopp kropp og Photoreceptor Neurons i voksen Drosophila melanogaster hjernen

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...