Name: adult zebrafish injury models to study the effects of prednisolone in regenerating bone tissue
Uploaded: 2018-10-18T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue at JoVE.com

Это исследование было поддержано Грант центр восстановительной терапии Дрезден («данио рерио как модель разгадать механизмов глюкокортикоидных индуцированной костной потери») и дополнительно грант Deutsche Forschungsgemeinschaft (Transregio 67, проект 387653785) к ФК. Мы очень благодарны Ян Kaslin и Авинаш Chekuru за их руководство и помощь на проведение трепанации calvariae и переломов в костлявые плавник лучи. Эксперименты были разработаны, выполняются и проанализированы кг и FK. FK написал рукопись. Мы также хотели бы поблагодарить Katrin Ламберт, Николь Cudak и другие члены Кнопф и бренд лабораторий для оказания технической помощи и обсуждения. Мы благодарим также Marika Фишер и Иткой Michling для ухода за отличные рыбные и Henriette Knopf и Джош карри для корректуры рукопись.

Все методы, описанные здесь были утверждены Landesdirektion Дрезден (разрешить чисел: AZ 24D-9168.11-1/2008-1, AZ 24-9168.11-1/2011-52, AZ 24-9168.11-1/2013-5, AZ 24-9168.11-1/2013-14, AZ DD24.1-5131/354/87).
1. Подготовка материалов и решений
Примечание: Преднизолон, как другие глюкокортикоидов, приводит к иммуносупре...

<ol>
	<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book. A Guide for The Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). 385, (2000).</li><li>Xu, C., Volkery, S., Siekmann, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intubation-based+anesthesia+for+long-term+time-lapse+imaging+of+adult+zebrafish.">Intubation-based anesthesia for long-term time-lapse imaging of adult zebrafish.</a> Nature Protocols. 10 (12), 2064-2073 (2015).</li><li>Kaufman, C. K., White, R. M., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetic+screening+in+the+zebrafish+embryo.">Chemical genetic screening in the zebrafish embryo.</a> Nature Protocols. 4 (10), 1422-1432 (2009).</li><li>Paul, S., Crump, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+on+skeletal+cell+plasticity+from+studying+jawbone+regeneration+in+zebrafish.">Lessons on skeletal cell plasticity from studying jawbone regeneration in zebrafish.</a> Bonekey Reports. 5, 853 (2016).</li><li>Witten, P. E., Harris, M. P., Huysseune, A., Winkler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+teleost+fish+provide+new+insights+into+human+skeletal+diseases.">Small teleost fish provide new insights into human skeletal diseases.</a> Methods in Cell Biology. 138, 321-346 (2017).</li><li>den Uyl, D., Bultink, I. E., Lems, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+glucocorticoid-induced+osteoporosis.">Advances in glucocorticoid-induced osteoporosis.</a> Current Rheumatology Reports. 13 (3), 233-240 (2011).</li><li>Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+high+content,+in+vivo+model+of+glucocorticoid-induced+osteoporosis.">A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis.</a> Biotechnology Journal. 1 (6), 651-655 (2006).</li><li>de Vrieze, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prednisolone+induces+osteoporosis-like+phenotype+in+regenerating+zebrafish+scales.">Prednisolone induces osteoporosis-like phenotype in regenerating zebrafish scales.</a> Osteoporosis International. 25 (2), 567-578 (2014).</li><li>Pasqualetti, S., Congiu, T., Banfi, G., Mariotti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alendronate+rescued+osteoporotic+phenotype+in+a+model+of+glucocorticoid-induced+osteoporosis+in+adult+zebrafish+scale.">Alendronate rescued osteoporotic phenotype in a model of glucocorticoid-induced osteoporosis in adult zebrafish scale.</a> International Journal Of Experimental Pathology. 96 (1), 11-20 (2015).</li><li>Geurtzen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+Suppressive+and+Bone+Inhibitory+Effects+of+Prednisolone+in+Growing+and+Regenerating+Zebrafish+Tissues.">Immune Suppressive and Bone Inhibitory Effects of Prednisolone in Growing and Regenerating Zebrafish Tissues.</a> Journal of Bone and Mineral Research. , (2017).</li><li>Geurtzen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+osteoblasts+dedifferentiate+in+response+to+traumatic+bone+injury+in+the+zebrafish+fin+and+skull.">Mature osteoblasts dedifferentiate in response to traumatic bone injury in the zebrafish fin and skull.</a> Development. 141 (11), 2225-2234 (2014).</li><li>Matthews, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthesia+and+euthanasia+in+zebrafish.">Anesthesia and euthanasia in zebrafish.</a> Institute of Laboratory Animal Resources Journal. 53 (2), 192-204 (2012).</li><li>Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf+signaling+instructs+position-dependent+growth+rate+during+zebrafish+fin+regeneration.">Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration.</a> Development. 132, 5173-5183 (2005).</li><li>Hirasawa, T., Kuratani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+vertebrate+skeleton:+morphology,+embryology,+and+development.">Evolution of the vertebrate skeleton: morphology, embryology, and development.</a> Zoological Letters. 1, 2 (2015).</li><li>Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+of+neuroepithelial-like+and+radial+glia-like+progenitor+cells+in+cerebellar+regeneration.">Distinct roles of neuroepithelial-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration.</a> Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).</li><li>Knopf, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerates+via+Dedifferentiation+of+Osteoblasts+in+the+Zebrafish+Fin.">Regenerates via Dedifferentiation of Osteoblasts in the Zebrafish Fin.</a> Developmental Cell. 20 (5), 713-724 (2011).</li><li>van Eeden, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+affecting+somite+formation+and+patterning+in+the+zebrafish,+Danio+rerio.">Mutations affecting somite formation and patterning in the zebrafish, Danio rerio.</a> Development. 123, 153-164 (1996).</li><li>Walker, M. B., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-color+acid-free+cartilage+and+bone+stain+for+zebrafish+larvae.">A two-color acid-free cartilage and bone stain for zebrafish larvae.</a> Biotechnic &amp; Histochemistry. 82 (1), 23-28 (2007).</li><li>Kyritsis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+inflammation+initiates+the+regenerative+response+in+the+adult+zebrafish+brain.">Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain.</a> Science. 338 (6112), 1353-1356 (2012).</li><li>Oppedal, D., Goldsmith, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+screen+to+identify+novel+inhibitors+of+fin+regeneration+in+zebrafish.">A chemical screen to identify novel inhibitors of fin regeneration in zebrafish.</a> Zebrafish. 7 (1), 53-60 (2010).</li><li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish.">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).</li><li>Spoorendonk, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+and+Cyp26b1+are+critical+regulators+of+osteogenesis+in+the+axial+skeleton.">Retinoic acid and Cyp26b1 are critical regulators of osteogenesis in the axial skeleton.</a> Development. 135 (22), 3765-3774 (2008).</li><li>Gioia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chaperone+activity+of+4PBA+ameliorates+the+skeletal+phenotype+of+Chihuahua,+a+zebrafish+model+for+dominant+osteogenesis+imperfecta.">The chaperone activity of 4PBA ameliorates the skeletal phenotype of Chihuahua, a zebrafish model for dominant osteogenesis imperfecta.</a> Human Molecular Genetics. 26 (15), 2897-2911 (2017).</li><li>Fiedler, I. A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severely+impaired+bone+material+quality+in+Chihuahua+zebrafish+resembles+classical+dominant+human+osteogenesis+imperfecta.">Severely impaired bone material quality in Chihuahua zebrafish resembles classical dominant human osteogenesis imperfecta.</a> Journal of Bone and Mineral Research. , (2018).</li><li>Fisher, S., Jagadeeswaran, P., Halpern, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiographic+analysis+of+zebrafish+skeletal+defects.">Radiographic analysis of zebrafish skeletal defects.</a> Developmental Biology. 264 (1), 64-76 (2003).</li><li>Hayes, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+deformity+in+aged+zebrafish+is+accompanied+by+degenerative+changes+to+their+vertebrae+that+resemble+osteoarthritis.">Spinal deformity in aged zebrafish is accompanied by degenerative changes to their vertebrae that resemble osteoarthritis.</a> PLoS One. 8 (9), e75787 (2013).</li><li>Mitchell, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+osteoarthritis+genetics+in+zebrafish.">New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish.</a> Osteoarthritis Cartilage. 21 (2), 269-278 (2013).</li><li>Fleming, A., Sato, M., Goldsmith, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+in+vivo+screening+for+bone+anabolic+compounds+with+zebrafish.">High-throughput in vivo screening for bone anabolic compounds with zebrafish.</a> Journal of Biomolecular Screening. 10 (8), 823-831 (2005).</li><li>de Vrieze, E., Zethof, J., Schulte-Merker, S., Flik, G., Metz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+osteogenic+compounds+by+an+ex+vivo+sp7:luciferase+zebrafish+scale+assay.">Identification of novel osteogenic compounds by an ex vivo sp7:luciferase zebrafish scale assay.</a> Bone. 74, 106-113 (2015).</li></ol>

Данио рерио оказались полезными в скелетных исследований во многих отношениях. Выбранный мутантов имитировать аспекты заболеваний человека, таких как несовершенный Остеогенез или остеоартрита23,24,25,26,<sup class="xre...

Данио рерио представляют собой мощный животных модель для изучения развития позвоночных и болезни. Это связано с тем, что они являются мелких животных, которые размножаются очень хорошо и что их геном полностью виртуализированного и поддаются манипуляции1. Другие преимущества включают возможность выполнения продолжение живых изображений на разных этапах, в том числе в vivo изображений взрослых рыбок данио2, и способности выполнять высокую пропускную способность препарата экраны в zebrafish личинки3. Кроме того данио рерио обладают высокой регенеративной способностью в различных органах и тканях, включая кости и таким образом служат полезной системы для изучения костных болезней и ремонт4,5.
Глюкокортикоидный индуцированного остеопороза (ГИО) является заболевание, которое приводит к от долгосрочного обращения с глюкокортикоидов, например в ходе лечения аутоиммунных заболеваний таких как астма или ревматоидного артрита. GIO в около 30% глюкокортикоидных лечение больных развивается и представляет основных медицинских выпуск6; Таким образом важно исследовать влияние иммуносупрессии на костной ткани в деталях. В последние годы были разработаны различные модели данио рерио, занимающихся патогенеза GIO. Глюкокортикоидный опосредованной костной потери побудило в данио рерио личинки, к примеру, которые привели к выявлению противодействующего соединений увеличения костной массы в наркотиков экран7. Кроме того, тормозящее действие глюкокортикоидов индуцированной кости были передразнил в zebrafish весы как in vitro и in vivo8,9. Эти анализы очень убедительны подходы, особенно когда дело доходит до выявления роман иммуносупрессивных и кости анаболических препаратов. Однако они лишь частично учитывать эндоскелет и не были выполнены в регенеративных контексте. Таким образом они не позволяют расследования глюкокортикоидных опосредованной эффекты во время быстрого режимов формирования взрослых, регенерации костей.
Здесь мы представляем протокол позволяет исследователям изучать глюкокортикоидных опосредованного воздействия на кости взрослых рыбок данио, прохождения регенерации. Травмы модели включают частичная ампутация данио рерио хвостового плавника, трепанация черепа, а также создание плавник Рэй переломов (рис. 1а-1 C) и в сочетании с глюкокортикоидных воздействия через инкубации (Рисунок 1E ). Недавно мы использовали часть настоящего протокола для описания последствий воздействия преднизолона, один из обычно предписываются кортикостероидных препаратов, на взрослых рыбок данио, регенерации костей черепа и плавник10. В данио рерио преднизолон администрация приводит к снижению остеобластов распространения, неполной остеобластов дифференциация и быстрой индукции апоптоза в моноцитов/макрофагов линии10. В этом протоколе мы также описывают как переломы могут быть введены в единый костлявые плавник Рэй сегментов11, как этот подход может оказаться полезным при изучении глюкокортикоидных опосредованного воздействия на кости происходя во время ремонта трещин. Представленные здесь методы поможет дальнейшего решения лежащих в основе механизмов действия глюкокортикоидов в быстро регенерации костной ткани и может также использоваться в других настройках системного лекарствами в контексте данио рерио регенерации тканей.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Prednisolone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt forceps</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>BD027R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Braun</td>
			<td>5518059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>840004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection needle (0.3x13 mm)</td>
			<td>BD Beckton Dickinson</td>
			<td>30400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro drill</td>
			<td>Cell Point Scientific</td>
			<td>67-1000</td>
			<td>distributed e.g. by Harvard Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel burrs (0.5 &#181;m diameter)</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>19007-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artemia ssp.</td>
			<td>Sanders</td>
			<td>425GR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette (plastic, Pastette)</td>
			<td>Alpha Labs</td>
			<td>LW4111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin red S powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian blue 8 GX</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16 FA</td>
			<td>with QIMAGING RETIGA-SRV camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MVX10</td>
			<td>with Olympus DP71 or DP80 camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adult zebrafish injury models to study the effects of prednisolone in regenerating bone tissue

Данио рерио способны регенерировать различных органов, включая придатков (плавники) после ампутации. Это включает в себя регенерации кости, которая отрастает в течение примерно двух недель после травмы. Кроме того возможность исцелить костей быстро после трепанации черепа и ремонта трещин, которые могут быть легко введены в костлявые плавник лучи данио рерио данио рерио. Эти анализы травмы представляют собой возможные экспериментальные парадигмы для проверки влияния управляемых наркотиков на быстро формирования кости. Здесь мы описываем, использование этих моделей 3 травмы и их совместное использование с лечения системных глюкокортикоидов, который оказывает тормозящее и иммуносупрессивные эффекты кости. Мы предоставляем рабочего процесса о том, как подготовиться к иммуносупрессивным лечения взрослых рыбок данио, показывают, как выполнять плавник ампутации, трепанация черепа костей и переломы плавник и описывают, как применение глюкокортикоидов влияет на обе кости формирования остеобласты и клетки линии моноцитов/макрофагов частью врожденного иммунитета в костной ткани.

Протокол, представленные здесь неоднократно использовались для формирования быстрого костей в ходе регенерации данио рерио ребра и череп10,11,16. В сочетании с представленным методом преднизолона администрации может о...

Watch this Scientific Journal Video about Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue at JoVE.com

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Взрослый данио рерио травмы модели для изучения последствий преднизолона в регенерации костной ткани

Здесь мы описываем 3 взрослых рыбок данио травмы модели и их совместное использование с лечение иммуносупрессивным препаратом. Мы предоставляем руководство по визуализации регенерации тканей и на нем обнаружения минерализации костей.

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области иммуносупрессивного терапевтического вмешательства для изучения неблагоприятного воздействия препаратов на регенерацию тканей, в частности, в костях. Основным преимуществом этой техники является то, что она сочетает в себе прошлые модели регенерации костей зебры с системным воздействием наркотиков путем погружения раненых зебрафиш в лекарственно-дополненной рыбной воде. Перед началом процедуры автоклав одной алюминиевой фольги покрыл 600 миллилитров стакана на зебрафиш и соответствующее количество стеклянных бутылок рыбной воды для эксперимента и подготовить иммуносупрессивный препарат в экспериментальных контрольных решениях, представляющих интерес.Для ампутации травмы, используйте тупые типсы, чтобы тщательно поместить обезболивающее Зебрафиш на боковую сторону на обратной крышке 100-миллиметровой чашки Петри и использовать скальпель, чтобы повторно 50% плавника. Затем поместите рыбу в автоклавный стакан, содержащий 300 миллилитров рыбной воды, дополненной соответствующим экспериментальным агентом, и накройте стакан фольгой, чтобы предотвратить побег зебры. Чтобы вызвать травму перелома плавника, поместите обезболивающее Зебрафиш на боковую сторону в 100-миллиметровую агарозу с покрытием чашки Петри под рассеченным микроскопом и слегка нажмите инъекционной иглой в сегмент костного плавника, пока трещина не появится.Важно ввести не слишком много переломов в плавник, потому что это может значительно ухудшить стабильность. Затем перенесите рыбу в автоклавный стакан, содержащий 300 миллилитров рыбной воды, дополненный соответствующим экспериментальным агентом. Для получения травмы голгофального черепа держите обезболивающее Зебрафиш в вертикальном положении, чтобы голгофальные кости легко визуализировались под микроскопом вскрытия.Поместите вращающееся микросверло, оснащенное 500-метровым дрелью, немного по центру лобной кости и аккуратно коснитесь кости, чтобы произвести отверстие размером с микробуровую заусенца. Очень важно, чтобы не перемещать сверло боковой при производстве травмы и немедленно остановить, как только сопротивление ткани падает. В противном случае, мозг будет поврежден.Затем поместите рыбу в автоклавный стакан, содержащий 300 миллилитров рыбной воды, дополненный соответствующим экспериментальным агентом. Изменение воды в стаканах ежедневно путем передачи Зебрафиш и рыбной воды в соответствующий временный контейнер и заправки стакан со свежим препаратом дополненной рыбной водой. Затем используйте рыбную сетку, чтобы вернуть зебру рыбу в стакан.Для лечения продолжительностью до двух дней в общей сложности, не кормить зебрафиш. Во время более длительных экспериментов, кормить зебрафиш с 0,5 до одного миллилитра вылупившихся Артемия SSP каждый второй день. Для анализа травмы плавника, урожай штрафа и использовать штраф типсов, чтобы схватить плавник на одном краю пень.Используйте вторую пару типсов, чтобы захватить противоположный край пень и слегка нажмите ткани на дно блюда, которое содержит холодные 4%PFA в течение 10 до 20 секунд. Повторите уплощение плавника по мере необходимости. Теперь плавник должен лежать ровно без завивки.Для длительного хранения образца после фиксации, мыть ткани с тремя 20 минут PBS моет и восходящей серии метанола. Образцы могут храниться в 100% метанол при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Для Ализарин Красное окрашивание, регидратировать метанол хранится образцов в нисходящей серии метанола следуют две 20 минут моет в PBS и одна пятиминутная стирка в деионизированной воде.После последней стирки добавьте в образец ткани Алисарин Красный раствор и инкубировать образец при комнатной температуре с качания для соответствующего периода окрашивания. Чтобы очистить образцы, лечить ткани с уменьшением 1%калия гидроксида глицерол серии. Затем храните образцы в один к одному 0,1%калия гидроксида до 80%глицерола раствора и смонтировать ткани с 80%глицерол для воображая.Для окрашивания кальцеина инкубировать до трех зебрафиш одновременно в 100 миллиметрах раствора calcein в течение 20 минут в стеклянном стакане, покрытом алюминиевой фольгой. В конце инкубации перенесите зебрафиш в контейнер с рыбной водой и дайте рыбе ненадолго поплавать, прежде чем перевести их в новый контейнер с рыбной водой. Через 20 минут во втором стакане, чтобы приобрести живые изображения плавника регенерирует, место анестезировал Зебрафиш на агарозы покрытием Петри блюдо и изображение плавника стерео микроскопии.Чтобы получить изображения регенерирующих костей черепа, поместите зебрафиш в вертикальном положении в губку и изображение черепа с помощью микроскопии флуоресценции. Лечение преднизолоном, как и другие глюкокортикоиды, приводит к общему ингибированию регенерации плавников, включая формирование костей, как обнаружено Alizarin Red окрашивание фиксированной ткани хвостового плавника. Аналогичным образом, препарат имеет задержку влияние на калгофа травмы черепа закрытия.Из-за иммуносупрессии, снижение макрофага номера также могут быть обнаружены иммуногистохимии на замороженных участках тканей, о чем свидетельствует с помощью анти-mCherry и анти-GFP антитела окрашивания и трансгенных MPEG-1 mCherry скрещены с Osterix NGFP Зебрафиш на зебрафиш черепа ткани образцов из Prednisolone обработанных животных. При попытке этих процедур важно свести к минимуму изменчивость скорости регенерации костей путем проведения травмы эссе в весьма воспроизводимым образом. Кроме того, имеет решающее значение для одного дома Зебрафиш в автоклавных стаканов, содержащих автоклавной рыбной воды, чтобы избежать микробной инфекции.Этот протокол поможет в дальнейшем рассмотреть основные механизмы глюкокортикоида действий. Например, в контексте глюкокортикоида индуцированный остеопороз, а также может быть адаптирован для использования других препаратов и других костей зебры.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

Почки Регенерация у взрослых данио рерио по гентамицина поражении

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Механическая судно Травмы у эмбрионов данио рерио

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

Использование Титон системы для изучения молекулярных механизмов регенерации данио рерио

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

Протоколы для анализа роли Paneth клеток для регенерации мышиной кишечника с помощью условных<em&gt; Cre-LOX</em&gt; Mouse Модели

The epithelial surface of the mammalian intestine is a dynamic tissue that renews every 3 - 7 days. Understanding this renewal process identified a ...

Combining Intravital Fluorescent Microscopy (IVFM) with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Combining Intravital Fluorescent Microscopy IVFM with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Сочетая прижизненной флуоресцентной микроскопии (IVFM) с генетической модели для изучения динамики приживления кроветворных клеток костного мозга ниши

Increasing evidence indicates that normal hematopoiesis is regulated by distinct microenvironmental cues in the BM, which include specialized cellular ...

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

Построение конечно-элементных моделей по расследованию данио рерио Щековые биомеханики

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

В визуализации in vivo трансгенной экспрессии генов в Персональной Ретинального прародителей в химерных эмбрионов данио рерио по изучению мобильных неавтономных Влияния

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish

Гистологический анализ острой алкогольной травмы печени у данио

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Живая визуализация мышей

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Рассечение и Immunofluorescent окрашивание гриб тело и фоторецепторных нейронов в мозге взрослого Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...