Name: adult zebrafish injury models to study the effects of prednisolone in regenerating bone tissue
Uploaded: 2018-10-18T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue at JoVE.com

Här studien har finansierats genom ett bidrag av regenerativ terapier Dresdens centrum (”zebrafiskar som en modell att riva upp mekanismerna av glukokortikoidinducerad benförlust”) och dessutom genom ett bidrag på den Deutsche Forschungsgemeinschafts (Transregio 67, projekt 387653785) till FK. Vi är mycket tacksamma att Jan Kaslin och Avinash Chekuru för deras vägledning och hjälp på utför trepanation av calvariae och frakturer i beniga fin strålar. Experiment designades, utförs och analyseras av KG och FK. FK skrev manuskriptet. Vi vill också tacka Katrin Lambert, Nicole Cudak och andra medlemmar av de Knopf och varumärke labs för tekniskt bistånd och diskussion. Vårt tack går också till Marika Fischer och Jitka Michling för utmärkt fisk vård och Henriette Knopf och Josh Currie för korrekturläsning manuskriptet.

Alla metoderna som beskrivs här godkändes av den Landesdirektion Dresden (tillåta nummer: AZ 24D-9168.11-1/2008-1, AZ 24-9168.11-1/2011-52, AZ 24-9168.11-1/2013-5, AZ 24-9168.11-1/2013-14, AZ DD24.1-5131/354/87).
1. beredning av material och lösningar
Obs: Prednisolon, liksom andra glukokortikoider, leder till immunsuppression. Således, försiktighetsåtgärder vidtas för att förhindra infektion i behandlade djur under experimentet. Till detta avsluta, autoklav...

<ol>
	<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book. A Guide for The Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). 385, (2000).</li><li>Xu, C., Volkery, S., Siekmann, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intubation-based+anesthesia+for+long-term+time-lapse+imaging+of+adult+zebrafish.">Intubation-based anesthesia for long-term time-lapse imaging of adult zebrafish.</a> Nature Protocols. 10 (12), 2064-2073 (2015).</li><li>Kaufman, C. K., White, R. M., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+genetic+screening+in+the+zebrafish+embryo.">Chemical genetic screening in the zebrafish embryo.</a> Nature Protocols. 4 (10), 1422-1432 (2009).</li><li>Paul, S., Crump, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+on+skeletal+cell+plasticity+from+studying+jawbone+regeneration+in+zebrafish.">Lessons on skeletal cell plasticity from studying jawbone regeneration in zebrafish.</a> Bonekey Reports. 5, 853 (2016).</li><li>Witten, P. E., Harris, M. P., Huysseune, A., Winkler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+teleost+fish+provide+new+insights+into+human+skeletal+diseases.">Small teleost fish provide new insights into human skeletal diseases.</a> Methods in Cell Biology. 138, 321-346 (2017).</li><li>den Uyl, D., Bultink, I. E., Lems, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+glucocorticoid-induced+osteoporosis.">Advances in glucocorticoid-induced osteoporosis.</a> Current Rheumatology Reports. 13 (3), 233-240 (2011).</li><li>Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+high+content,+in+vivo+model+of+glucocorticoid-induced+osteoporosis.">A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis.</a> Biotechnology Journal. 1 (6), 651-655 (2006).</li><li>de Vrieze, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prednisolone+induces+osteoporosis-like+phenotype+in+regenerating+zebrafish+scales.">Prednisolone induces osteoporosis-like phenotype in regenerating zebrafish scales.</a> Osteoporosis International. 25 (2), 567-578 (2014).</li><li>Pasqualetti, S., Congiu, T., Banfi, G., Mariotti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alendronate+rescued+osteoporotic+phenotype+in+a+model+of+glucocorticoid-induced+osteoporosis+in+adult+zebrafish+scale.">Alendronate rescued osteoporotic phenotype in a model of glucocorticoid-induced osteoporosis in adult zebrafish scale.</a> International Journal Of Experimental Pathology. 96 (1), 11-20 (2015).</li><li>Geurtzen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+Suppressive+and+Bone+Inhibitory+Effects+of+Prednisolone+in+Growing+and+Regenerating+Zebrafish+Tissues.">Immune Suppressive and Bone Inhibitory Effects of Prednisolone in Growing and Regenerating Zebrafish Tissues.</a> Journal of Bone and Mineral Research. , (2017).</li><li>Geurtzen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+osteoblasts+dedifferentiate+in+response+to+traumatic+bone+injury+in+the+zebrafish+fin+and+skull.">Mature osteoblasts dedifferentiate in response to traumatic bone injury in the zebrafish fin and skull.</a> Development. 141 (11), 2225-2234 (2014).</li><li>Matthews, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthesia+and+euthanasia+in+zebrafish.">Anesthesia and euthanasia in zebrafish.</a> Institute of Laboratory Animal Resources Journal. 53 (2), 192-204 (2012).</li><li>Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf+signaling+instructs+position-dependent+growth+rate+during+zebrafish+fin+regeneration.">Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration.</a> Development. 132, 5173-5183 (2005).</li><li>Hirasawa, T., Kuratani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+vertebrate+skeleton:+morphology,+embryology,+and+development.">Evolution of the vertebrate skeleton: morphology, embryology, and development.</a> Zoological Letters. 1, 2 (2015).</li><li>Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+of+neuroepithelial-like+and+radial+glia-like+progenitor+cells+in+cerebellar+regeneration.">Distinct roles of neuroepithelial-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration.</a> Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).</li><li>Knopf, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerates+via+Dedifferentiation+of+Osteoblasts+in+the+Zebrafish+Fin.">Regenerates via Dedifferentiation of Osteoblasts in the Zebrafish Fin.</a> Developmental Cell. 20 (5), 713-724 (2011).</li><li>van Eeden, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+affecting+somite+formation+and+patterning+in+the+zebrafish,+Danio+rerio.">Mutations affecting somite formation and patterning in the zebrafish, Danio rerio.</a> Development. 123, 153-164 (1996).</li><li>Walker, M. B., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-color+acid-free+cartilage+and+bone+stain+for+zebrafish+larvae.">A two-color acid-free cartilage and bone stain for zebrafish larvae.</a> Biotechnic &amp; Histochemistry. 82 (1), 23-28 (2007).</li><li>Kyritsis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+inflammation+initiates+the+regenerative+response+in+the+adult+zebrafish+brain.">Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain.</a> Science. 338 (6112), 1353-1356 (2012).</li><li>Oppedal, D., Goldsmith, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+screen+to+identify+novel+inhibitors+of+fin+regeneration+in+zebrafish.">A chemical screen to identify novel inhibitors of fin regeneration in zebrafish.</a> Zebrafish. 7 (1), 53-60 (2010).</li><li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish.">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).</li><li>Spoorendonk, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+and+Cyp26b1+are+critical+regulators+of+osteogenesis+in+the+axial+skeleton.">Retinoic acid and Cyp26b1 are critical regulators of osteogenesis in the axial skeleton.</a> Development. 135 (22), 3765-3774 (2008).</li><li>Gioia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chaperone+activity+of+4PBA+ameliorates+the+skeletal+phenotype+of+Chihuahua,+a+zebrafish+model+for+dominant+osteogenesis+imperfecta.">The chaperone activity of 4PBA ameliorates the skeletal phenotype of Chihuahua, a zebrafish model for dominant osteogenesis imperfecta.</a> Human Molecular Genetics. 26 (15), 2897-2911 (2017).</li><li>Fiedler, I. A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severely+impaired+bone+material+quality+in+Chihuahua+zebrafish+resembles+classical+dominant+human+osteogenesis+imperfecta.">Severely impaired bone material quality in Chihuahua zebrafish resembles classical dominant human osteogenesis imperfecta.</a> Journal of Bone and Mineral Research. , (2018).</li><li>Fisher, S., Jagadeeswaran, P., Halpern, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiographic+analysis+of+zebrafish+skeletal+defects.">Radiographic analysis of zebrafish skeletal defects.</a> Developmental Biology. 264 (1), 64-76 (2003).</li><li>Hayes, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+deformity+in+aged+zebrafish+is+accompanied+by+degenerative+changes+to+their+vertebrae+that+resemble+osteoarthritis.">Spinal deformity in aged zebrafish is accompanied by degenerative changes to their vertebrae that resemble osteoarthritis.</a> PLoS One. 8 (9), e75787 (2013).</li><li>Mitchell, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+osteoarthritis+genetics+in+zebrafish.">New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish.</a> Osteoarthritis Cartilage. 21 (2), 269-278 (2013).</li><li>Fleming, A., Sato, M., Goldsmith, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+in+vivo+screening+for+bone+anabolic+compounds+with+zebrafish.">High-throughput in vivo screening for bone anabolic compounds with zebrafish.</a> Journal of Biomolecular Screening. 10 (8), 823-831 (2005).</li><li>de Vrieze, E., Zethof, J., Schulte-Merker, S., Flik, G., Metz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+osteogenic+compounds+by+an+ex+vivo+sp7:luciferase+zebrafish+scale+assay.">Identification of novel osteogenic compounds by an ex vivo sp7:luciferase zebrafish scale assay.</a> Bone. 74, 106-113 (2015).</li></ol>

Zebrafisk har visat sig användbara i skelettet forskning i många avseenden. Valda mutanter härma aspekter av mänskliga sjukdomar såsom osteogenesis imperfecta eller artros23,24,25,26,27, och larver samt skalor som används för att identifiera ben anabola föreningar i liten molekyl skärmar7,28<s...

Zebrafiskar representerar en kraftfull djurmodell att studera ryggradsdjur utveckling och sjukdom. Detta är på grund av att de är små djur som häckar mycket väl och att deras arvsmassa är fullt sekvenserade och mottagliga för manipulation1. Andra fördelar inkluderar alternativet att utföra fortsatt levande imaging i olika skeden, inklusive in-vivo imaging vuxen zebrafiskar2och förmågan att utföra hög genomströmning drog skärmar i zebrafiskar larver3. Dessutom Sebrafisken besitter en hög regenerativ kapacitet i olika organ och vävnader inklusive ben, och därmed fungera som ett användbart system att studera skelett sjukdom och reparera4,5.
Glukokortikoidinducerad osteoporos (GIO) är en sjukdom som är resultatet av långvarig behandling med glukokortikoider, till exempel i samband med autoimmun sjukdomsbehandling såsom astma eller reumatoid artrit. GIO utvecklar i cirka 30% av patienter behandlade med glukokortikoid och representerar ett stort hälsoproblem fråga6. Det är därför viktigt att undersöka effekterna av immunsuppression på benvävnad i detalj. Under de senaste åren har en mängd zebrafiskar modeller behandlar patogenesen av GIO utvecklats. Glukokortikoid-medierad benförlust har inducerats i zebrafiskar larver, exempelvis som ledde till identifiering av motverkande föreningar ökar benmassan hos en drog skärm7. Dessutom glukokortikoidinducerad ben hämmande effekter har varit härmade i zebrafiskar skalor både in vitro- och in-vivo8,9. Dessa analyser är mycket övertygande metoder, särskilt när det gäller identifiering av romanen immunhämmande och ben anabola läkemedel. Dock de endast delvis ta hänsyn till endoskeleton och har inte utförts i en regenerativ sammanhang. Således, de tillåter inte utredningen av glukokortikoid-medierade effekter under snabba lägen för vuxen, regenerativ benbildning.
Här presenterar vi ett protokoll som gör det möjligt för forskare att studera glukokortikoid-medierad effekter på vuxen zebrafiskar ben som genomgår regenerering. Skada modeller inkluderar partiell amputation av den zebrafiskar stjärtfenan, trepanation av skallen, samt skapandet av fin stråle frakturer (figur 1A-1 C), och kombineras med glukokortikoid exponering via inkubation (figur 1E ). Vi har nyligen använt en del av detta protokoll för att beskriva konsekvenserna av exponering för prednisolon, en av de förskrivna Kortikosteroid läkemedel, på vuxna zebrafiskar regenererande fin och skalle ben10. I zebrafiskar leder prednisolon administration till minskad osteoblast spridning, ofullständig osteoblast differentiering och snabb induktion av apoptos i monocyt/makrofag härstamning10. I detta protokoll, också beskriver vi hur frakturer kan införas i enda beniga fin stråle segment11, eftersom denna strategi kan vara användbar när man studerar glukokortikoid-medierad effekter på ben occuring under frakturreparation. De metoder som presenteras här kommer att bidra till ytterligare adress underliggande glukokortikoid verkningsmekanismer i snabbt regenererande ben och kan även användas i andra inställningar för systemisk drug administration i samband med zebrafiskar vävnadsregeneration.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Prednisolone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt forceps</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>BD027R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Braun</td>
			<td>5518059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>840004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection needle (0.3x13 mm)</td>
			<td>BD Beckton Dickinson</td>
			<td>30400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro drill</td>
			<td>Cell Point Scientific</td>
			<td>67-1000</td>
			<td>distributed e.g. by Harvard Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel burrs (0.5 &#181;m diameter)</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>19007-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artemia ssp.</td>
			<td>Sanders</td>
			<td>425GR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette (plastic, Pastette)</td>
			<td>Alpha Labs</td>
			<td>LW4111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin red S powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian blue 8 GX</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16 FA</td>
			<td>with QIMAGING RETIGA-SRV camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MVX10</td>
			<td>with Olympus DP71 or DP80 camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adult zebrafish injury models to study the effects of prednisolone in regenerating bone tissue

Zebrafiskar kan regenerera olika organ, inklusive bihang (fenor) efter amputation. Detta innebär förnyelse av ben, som regrows inom ungefär två veckor efter skada. Zebrafisk är dessutom kunna läka ben snabbt efter trepanation av skallen och reparera frakturer som enkelt kan införas i zebrafiskar beniga fin strålar. Dessa skador analyser representerar genomförbart experimentella paradigm att testa effekten av administrerade läkemedel för att snabbt bilda ben. Här, beskriver vi användningen av dessa 3 skada modeller och deras kombinerad användning med systemisk glukokortikoid behandling, vilket utövar ben hämmande och immunsuppressiva effekter. Vi ger ett arbetsflöde om hur du förbereder för immunsuppressiv behandling i vuxen zebrafiskar, illustrerar hur du utför fin amputation, trepanation av calvarial ben, och fin frakturer, och beskriva hur användningen av glukokortikoider påverkar båda ben bildar osteoblaster och celler av monocyt/makrofag härstamning som en del av den medfödda immuniteten i benvävnad.

Det protokoll som presenteras här har använts flera gånger att inducera snabba benbildning i samband med förnyelse av zebrafisk fin och skalle10,11,16. I kombination med den presenterade metoden av prednisolon administration, kan studier på prednisolons effekter under ben regenerering bedrivas. Exempelvis kan studier av benbildning och mineralisering i regenerera utföras. Prednisolon, leder...

Watch this Scientific Journal Video about Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue at JoVE.com

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Adult zebrafiskar skada modeller för att studera effekterna av prednisolon i regenererande benvävnad

Här beskriver vi 3 vuxna zebrafiskar skada modeller och deras kombinerade användning med immunosuppressiva läkemedelsbehandling. Vi ge vägledning om avbildning av regenererande vävnader och på att upptäcka ben mineralisering däri.

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor inom området för immunsuppressiva terapeutiska intervention för att studera de negativa effekterna av läkemedel på vävnadsregenerering, i synnerhet, i ben. Den största fördelen med denna teknik är att den kombinerar tidigare modeller av Zebrafish ben regenerering med systemisk läkemedelsexponering genom nedsänkning av den skadade Zebrafish i drog kompletterat fiskvatten. Innan du börjar med förfarandet, autoklav en aluminiumfolie omfattas 600 milliliter bägare per Zebrafish och ett lämpligt antal glasflaskor med fisk vatten för experimentet och förbereda immunsuppressiva drogen i experimentella kontroll lösningar av intresse.För en amfutation skada, använd trubbiga tövövingar för att noggrant placera en sövd Zebrafish på dess laterala sida på inversed locket på en 100 millimeter Petri skålen och använda en skalpell för att resect 50%av fenan. Placera sedan fisken i en autoklaverad bägare som innehåller 300 milliliter fiskvatten kompletterat med lämpligt försöksmedel och täck bägaren med folie för att förhindra att Zebrafish flyr. För att framkalla en skada av fenfrakturer, placera en sövd Zebrafisk på dess laterala sida i en 100 millimeters agarosbelagd petriskål under ett dissekerande mikroskop och tryck in en injektionsnål något i ett benigt finstrålesegment tills en spricka visas.Det är viktigt att införa inte alltför många frakturer i fenan eftersom detta kan kraftigt försämra stabiliteten. Överför sedan fisken till en autoklaverad bägare som innehåller 300 milliliter fiskvatten kompletterat med lämpligt experimentellt medel. För att generera en calvarial skallskada, håll en sövd Zebrafisk i upprätt läge så att kalvarialbenen lätt visualiseras under ett dissekeringsmikroskop.Placera en roterande mikroborr som är utrustad med ett borrskär med 500 mikrometer över mitten av frontalbenet och rör försiktigt benet för att producera ett hål som är lika stort som mikroborrburren. Det är avgörande att inte flytta borren i laterled medan producera skadan och att stoppa omedelbart när motståndet i vävnaden droppar. Annars kommer hjärnan att skadas.Placera sedan fisken i en autoklaverad bägare som innehåller 300 milliliter fiskvatten kompletterat med lämpligt experimentellt medel. Byt vatten i bägarna dagligen genom att överföra Zebrafisken och fiskvattnet till en lämplig tillfällig behållare och fyll på bägaren med färskt läkemedel kompletterat fiskvatten. Använd sedan ett fisknät för att återföra Zebrafisken till dess bägare.För behandlingar som varar upp till två dagar totalt, mata inte Zebrafisken. Under längre experiment, mata Zebrafish med 0,5 till en milliliter kläckt Artemia SSP varannan dag. För fin skada analys, skörda böter och använda fina tents för att greppa fenan vid ena kanten av stubben.Använd ett andra par tärningar för att ta tag i den motsatta stubbkanten och tryck lätt på vävnaden på botten av skålen som innehåller kalla 4%PFA i 10 till 20 sekunder. Upprepa fena plattning vid behov. Fenan ska nu lägga sig platt utan curling.För långsiktig provlagring efter fixering, tvätta vävnaden med tre 20 minuters PBS tvättar och en stigande metanol serie. Proven kan sedan lagras i 100%metanol vid minus 20 grader Celsius. För Alizarin Röd färgning, rehydrera metanol lagras prover i en fallande metanol serie följt av två 20 minuters tvättar i PBS och en fem minuters tvätt i avjoniserat vatten.Efter den sista tvätten, tillsätt Alizarin Röd lösning till provvävnaden och inkubera provet vid rumstemperatur med gungning för lämplig infärgningsperiod. För att rensa proverna, behandla vävnaden med den minskande 1%kaliumhydroxid glycerol serien. Sedan lagra proverna i en en till en 0,1%kaliumhydroxid till 80%glycerol lösning och montera vävnaderna med 80%glycerol för att föreställa sig.För Calcein-färgning, inkubera upp till tre Zebrafiskar samtidigt i 100 millimeter Calceinlösning i 20 minuter i en glasbägare täckt med aluminiumfolie. I slutet av inkubationen överför du Zebrafisken till en behållare med fiskvatten och låter fiskarna simma en kort stund innan de överförs till en ny behållare med fiskvatten. Efter 20 minuter i den andra bägaren att förvärva levande bilder av fin regenererar, placera en sövd Zebrafish på en agarosbelagd Petriskål och bild fenan av stereomikroskopi.För att förvärva bilder av de regenererande skallbenen placerar du Zebrafish upprätt i en svamp och avbildar skallen genom fluorescensmikroskopi. Behandling med Prednisolon, liknande andra glukokortikoider, leder till en övergripande hämning av fenregenerering inklusive benbildning som detekteras av Alizarin Röd färgning av fast caudal fenvävnad. På samma sätt har läkemedlet fördröja effekt på calvarial skalle skada stängning.På grund av immunsuppression kan minskade makrofagtal också detekteras av immunohistokemi på frysta vävnadssektioner som framgår genom att använda anti-mCherry och anti-GFP-antikroppsfärgning och transgen MPEG-1 mCherry korsat med Osterix NGFP Zebrafisk på Zebrafisk skalle vävnadsprover från Prednisolon behandlade djur. Samtidigt försöker dessa förfaranden är det viktigt att minimera variabiliteten i ben regenerering hastighet genom att utföra skadan uppsatser i en mycket reproducerbara sätt. Det är också avgörande för enstaka hus Zebrafish i autoklaverade bägare som innehåller autoklaverat fiskvatten för att undvika mikrobiell infektion.Detta protokoll kommer att bidra till att ytterligare ta itu med de underliggande mekanismerna för glukokortikoida åtgärder. Till exempel, i samband med glukokortikoida inducerad benskörhet och kan också anpassas för användning av andra droger och andra Zebrafish ben.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

Njure Regeneration i vuxen Zebrafish av Gentamicin inducerad skada

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Mekanisk Vessel Skada i zebrafiskembryon

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

Användning av Teton system att studera molekylära mekanismer Zebrafish Regeneration

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

Protokoll för att analysera rollen av Paneth celler i Återskapa Murin tarm använder villkorad<em&gt; Cre-lox</em&gt; Musmodeller

The epithelial surface of the mammalian intestine is a dynamic tissue that renews every 3 - 7 days. Understanding this renewal process identified a ...

Combining Intravital Fluorescent Microscopy (IVFM) with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Combining Intravital Fluorescent Microscopy IVFM with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Att kombinera Intravital fluorescerande mikroskopi (IVFM) med genetiska modeller att studera Engraftment Dynamics av hematopoetiska celler till benmärgen nischer

Increasing evidence indicates that normal hematopoiesis is regulated by distinct microenvironmental cues in the BM, which include specialized cellular ...

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

Att bygga Finita Element Modeller för att undersöka Zebrafish Jaw biomekanik

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In vivo avbildning av Transgena genuttryck i Individuell Retinal stamceller i chimär Zebrafish embryon att studera Cell Nonautonomous Influenser

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish

Histologiska analyser av akut alkoholhaltig leverskada i sebrafisk

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissektion och Immunofluorescerande färgning av svamp kropp och ljusmätare nervceller i vuxen Drosophila melanogaster hjärnor

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...