Name: isolation of cd4+ t-cells and analysis of circulating t-follicular helper (ctfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper cTfh Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry at JoVE.com

O trabalho foi apoiado por uma bolsa da leucemia UK para ETB e MJA.

Amostras de sangue foram obtidas de indivíduos normais (NS) (n = 12) bem como pacientes com linfoma de zona marginal (MZL) (n = 7) e outros tipos de linfoma de células B não-Hodgkin (BNHL) (FL 6 pacientes, 2 pacientes de linfoma linfoplasmacítico e 1 baixo grau B-pilha Linfoma não-Hodgkin não especificados paciente). Os pacientes foram recrutados as clínicas de Hematologia no Leicester Royal enfermaria depois de ter dado consentimento, escrito, com aprovação ética no lugar em todos os estudos. Aprovação étic...

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	<li>Vinuesa, C. G., Linterman, M. A., Yu, D., MacLennan, I. C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicular+Helper+T+Cells.">Follicular Helper T Cells.</a> Annual Review of Immunology. 34 (1), 335-368 (2016).</li><li>Nurieva, R. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl6+Mediates+the+Development+of+T+Follicular+Helper+Cells.">Bcl6 Mediates the Development of T Follicular Helper Cells.</a> Science. 325 (5943), 1001-1005 (2009).</li><li>Breitfeld, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicular+B+Helper+T+Cells+Express+Cxc+Chemokine+Receptor+5,+Localize+to+B+Cell+Follicles,+and+Support+Immunoglobulin+Production.">Follicular B Helper T Cells Express Cxc Chemokine Receptor 5, Localize to B Cell Follicles, and Support Immunoglobulin Production.</a> The Journal of Experimental Medicine. 192 (11), 1545-1552 (2000).</li><li>Linterman, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicular+helper+T+cells+are+required+for+systemic+autoimmunity.">Follicular helper T cells are required for systemic autoimmunity.</a> The Journal of Experimental Medicine. 206 (3), 561-576 (2009).</li><li>Bindea, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+Dynamics+of+Intratumoral+Immune+Cells+Reveal+the+Immune+Landscape+in+Human+Cancer.">Spatiotemporal Dynamics of Intratumoral Immune Cells Reveal the Immune Landscape in Human Cancer.</a> Immunity. 39 (4), 782-795 (2013).</li><li>Gu-Trantien, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4++follicular+helper+T+cell+infiltration+predicts+breast+cancer+survival.">CD4+ follicular helper T cell infiltration predicts breast cancer survival.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 2873-2892 (2013).</li><li>Am&#233;-Thomas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+intratumoral+follicular+helper+T+cells+in+follicular+lymphoma:+role+in+the+survival+of+malignant+B+cells.">Characterization of intratumoral follicular helper T cells in follicular lymphoma: role in the survival of malignant B cells.</a> Leukemia. 26 (5), 1053-1063 (2012).</li><li>Bossaller, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICOS+Deficiency+Is+Associated+with+a+Severe+Reduction+of+CXCR5+CD4+Germinal+Center+Th+Cells.">ICOS Deficiency Is Associated with a Severe Reduction of CXCR5+CD4 Germinal Center Th Cells.</a> The Journal of Immunology. 177 (7), 4927-4932 (2006).</li><li>Morita, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Blood+CXCR5+CD4++T+Cells+Are+Counterparts+of+T+Follicular+Cells+and+Contain+Specific+Subsets+that+Differentially+Support+Antibody+Secretion.">Human Blood CXCR5+CD4+ T Cells Are Counterparts of T Follicular Cells and Contain Specific Subsets that Differentially Support Antibody Secretion.</a> Immunity. 34 (1), 108-121 (2011).</li><li>Locci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+circulating+PD-1+CXCR3-CXCR5++memory+Tfh+cells+are+highly+functional+and+correlate+with+broadly+neutralizing+HIV+antibody+responses.">Human circulating PD-1+CXCR3-CXCR5+ memory Tfh cells are highly functional and correlate with broadly neutralizing HIV antibody responses.</a> Immunity. 39 (4), 758-769 (2013).</li><li>He, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+Precursor+CCR7loPD-1hi+CXCR5++CD4++T+Cells+Indicate+Tfh+Cell+Activity+and+Promote+Antibody+Responses+upon+Antigen+Reexposure.">Circulating Precursor CCR7loPD-1hi CXCR5+ CD4+ T Cells Indicate Tfh Cell Activity and Promote Antibody Responses upon Antigen Reexposure.</a> Immunity. 39 (4), 770-781 (2013).</li><li>Schmitt, N., Bentebibel, S. -. E., Ueno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotype+and+functions+of+memory+Tfh+cells+in+human+blood.">Phenotype and functions of memory Tfh cells in human blood.</a> Trends in Immunology. 35 (9), 436-442 (2014).</li><li>Simpson, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+circulating+T+cells+resembling+follicular+helper+T+cells+is+a+fixed+phenotype+that+identifies+a+subset+of+severe+systemic+lupus+erythematosus.">Expansion of circulating T cells resembling follicular helper T cells is a fixed phenotype that identifies a subset of severe systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis and Rheumatism. 62 (1), 234-244 (2010).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+frequencies+of+activated+B+cells+and+T+follicular+helper+cells+are+correlated+with+disease+activity+in+patients+with+new-onset+rheumatoid+arthritis.">High frequencies of activated B cells and T follicular helper cells are correlated with disease activity in patients with new-onset rheumatoid arthritis.</a> Clinical and Experimental Immunology. 174 (2), 212-220 (2013).</li><li>Ueno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Circulating+T+Follicular+Helper+Cell+Subsets+in+Health+and+Disease.">Human Circulating T Follicular Helper Cell Subsets in Health and Disease.</a> Journal of Clinical Immunology. 36, 34-39 (2016).</li><li>Maecker Holden, T., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+controls,+instrument+setup,+and+the+determination+of+positivity.">Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity.</a> Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).</li><li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+Function+of+CD4++T+Follicular+Helper+(Tfh)+Cells+Associated+with+Hepatocellular+Carcinoma+Progression.">Impaired Function of CD4+ T Follicular Helper (Tfh) Cells Associated with Hepatocellular Carcinoma Progression.</a> PLOS ONE. 10 (2), 0117458 (2015).</li><li>Byford, E. T., Carr, M., Ladikou, E., Ahearne, M. J., Wagner, S. 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T., Francisco, L. M., Carman, C. V., Sharpe, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+receptor+PD-1+controls+follicular+regulatory+T+cells+in+the+lymph+nodes+and+blood.">The receptor PD-1 controls follicular regulatory T cells in the lymph nodes and blood.</a> Nature Immunology. 14 (2), 152-161 (2013).</li><li>Sage, P. T., Alvarez, D., Godec, J., von Andrian, U. H., Sharpe, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+T+follicular+regulatory+and+helper+cells+have+memory-like+properties.">Circulating T follicular regulatory and helper cells have memory-like properties.</a> The Journal of Clinical Investigation. 124 (12), 5191-5204 (2014).</li><li>Sage, P. T., Tan, C. L., Freeman, G. J., Haigis, M., Sharpe, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+TFH+Cell+Function+and+Increased+TFR+Cells+Contribute+to+Defective+Antibody+Production+in+Aging.">Defective TFH Cell Function and Increased TFR Cells Contribute to Defective Antibody Production in Aging.</a> Cell Reports. 12 (2), 163-171 (2015).</li><li>Yu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+CD25+CD127low/-+T+Cells:+A+More+Specific+Treg+Population+in+Human+Peripheral+Blood.">CD4+CD25+CD127low/- T Cells: A More Specific Treg Population in Human Peripheral Blood.</a> Inflammation. 35 (6), 1773-1780 (2012).</li></ol>

Este protocolo representa uma forma simples e eficiente para analisar as células de cTfh de sangue periférico, permitindo a detecção de todos os subconjuntos relevantes identificados na literatura, até agora. Amostras de sangue podem ser facilmente e eficientemente obtidas como parte do padrão Clínicas ambulatoriais e seriais amostras pode ser coletada em paralelo com os dados clínicos. Por sua vez, isso permite que estudos prospectivos avaliando cTfh subconjuntos como biomarcadores para progressão da doença ou...

Células T-foliculares de auxiliar (Tfh) são um CD4+ subconjunto de células T que caracterizou-se inicialmente em tecidos linfoides1. Estas células expressam PD-1 e receptores de superfície CXCR5, secretam IL-21 e IL-4 e mostram expressão nuclear do fator de transcrição, BCL-62,3. Como seu nome sugere, eles são encontrados em centros germinativos e são essenciais para anticorpos de afinidade elevada produção1.
Dysregulated Tfh respostas têm sido implicadas na patogênese da doença, mais notavelmente a doença auto-imune, onde eles promovem a expansão de células auto-reativas B4. Eles também desempenham um papel no microambiente do tumor do sólido5,6 e cancros linfoides7. Por outro lado, defeitos genéticos de superfície proteínas essenciais para Tfh função como resultado de costimulator (ICOS) células T inducible em síndromes de imunodeficiência humana8. CD4+ CXCR5+ células no sangue periférico humano são denominadas células helper T-foliculares (cTfh) de circulação e são acreditadas para ser o compartimento de memória das células Tfh em tecidos9. O objetivo do método descrito aqui é a análise de subconjuntos de cTfh seguindo CD4+ isolamento de amostras de sangue periférico de células.
Foram definidos vários subconjuntos de cTfh e a eficiência com que fornecem ajuda células B difere de um subconjunto para mais9,10,11,12. As proporções relativas destes subconjuntos são alteradas em uma série de doenças, mais proeminentemente auto-imune em que lá é quase sempre um aumento relativo no mais funcional PD-1+ / Oi e/ou subconjuntos de cTfh2 ou cTfh17 em comparação com os menos funcional PD-1– e/ou subconjuntos de cTfh112. A extensão dessas mudanças frequentemente associar com parâmetros clínicos, incluindo títulos de atividade e auto-anticorpos doença, indicando um papel potencial de distribuição de subconjunto cTfh como biomarcador prognóstico na doença, que pode refletir a atividade da ESF no tecidos linfoides9,12,13,14. Além disso, recolhendo amostras de sangue dos participantes é rápido, seguro e aceitável e então permite serial de monitoramento para a análise da progressão da doença ou resposta à terapia.
O uso de CD4 isolado+ de células T sobre suspensões de células mononucleares (PBMNC) de sangue periférico tradicional permite maiores experiências de citometria de fluxo da produção, reduzindo o tempo necessário para adquirir um número considerável de células de cTfh para análise. Isto é particularmente útil quando a classificação de células de cTfh rara subconjuntos usando fluxo ativado celular classificação (FACS). Para auxiliar a eficiência, estas suspensões podem ser criopreservadas para habilitar "lotes" de amostras a ser usado no experimento de citometria de fluxo. Em testes, o CD4+ pureza não foi reduzida em criopreservação.
Enquanto laboratórios diferentes usados diferentes marcadores para classificar cTfh células nos estágios iniciais de sua descoberta, o método apresentaram aqui faz uso de um regime unificado de dois grupos de marcadores de superfície celular como proposto por Schmidt et al.12, 15 para permitir a identificação simultânea de cTfh e seus subconjuntos reconhecidos nove em um único fluxo cytometry experimentar.
Como são usados apenas marcadores de superfície celular, as células não necessitam de fixação ou permeabilização e assim podem permanecer vivas para estudos funcionais a jusante. Isto poderia ser facilitado pela célula classificação usando FACS com o mesmo painel de anticorpos. Este painel pode ser expandido para incluir outros marcadores, permitindo as restrições do citômetro de fluxo sendo usado.
A análise das experiências de citometria de fluxo multi cor pode ser um desafio devido à natureza inerentemente subjetiva de gating em lotes do ponto 2-dimensional, especialmente quando populações de células não têm uma distribuição clara bi-modal na fluorescência do marcador, como é o caso para células cTfh e seus subconjuntos. Por esta razão, é imperativo para configurar os controles eficazes para reduzir os artefatos para permitir melhor resolução das populações e para definir a retenção de estratégias com confiança. Como tal, design de painel de anticorpos e a instalação de controles básicos para um fluxo cytometry experimentar, ou seja, usando a compensação e FMO controles estão descritas no passo 3.4.2 e 3.4.3,respectively.
Todas as células cTfh são definidas como CD4+ CXCR5+ CD45RA–. O nível de expressão do marcador característico de ativação Tfh PD-1 então pode ser determinado para identificar os subconjuntos do PD-1-, PD-1+ ou PD-1Oi cTfh células. Em seguida, usando uma combinação dos receptors do chemokine CXCR3 e CCR6, que são diferencialmente expressos pelo tradicional Th1, 2 ou 17 células, cTfh podem ser caracterizado como cTfh1, 2 ou 17-como por um perfil de CXCR3+ CCR6-, CXCR3– CCR6- e CXCR3– CCR6+, respectivamente.
O painel de anticorpos usado por nosso laboratório é exibido na tabela 1. O usuário pode ter para se adaptar a sua seleção de fluoróforo para contabilizar o laser e a configuração do filtro de luz disponível na sua citômetro de fluxo local.
As considerações a seguir influenciam a escolha de fluorophores. Sempre que possível, use fluorophores brilhante. Em particular, use o mais brilhante fluorophores disponível sobre as divisões mais marcadores (menos altamente expressas). Marcadores de redutor incluem PD-1, CXCR3 e CCR6 e em menor medida, CXCR5. Fizemos especificamente empreg o novo BB, BV e BUV fluorophores que proporcionam excelente brilho e assim permitir mais fácil resolução de populações distintas das células.
A seleção de fluoróforo espalharam os espectros de emissão tanto quanto possíveis minimizar a sobreposição espectral e, portanto, o nível de compensação pedida. Uma ferramenta online gratuita que pode ser usada para auxiliar a criação de um painel de citometria de fluxo pode ser encontrada aqui: http://www.bdbioscienes.com/us/s/spectrumviewer. Para economizar espaço no espectro de emissão, utilizamos um "canal de despejo" usando um corante de viabilidade com um comprimento de onda de emissão que se sobrepõe com os da APC-H7 (conjugados para CD45RA) para habilitar a detecção (e exclusão) de ambos mortos e/ou CD45RA+ usando um único detector.
Aqui, um protocolo é apresentado para o isolamento de sangue periférico CD4+ T-células e sua subsequente análise por citometria de fluxo para determinar as proporções dos diferentes e recentemente descrito subconjuntos de circulação.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1037px;" width="1037">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail</td>
			<td style="width:179px;">STEMCELL TECHNOLOGIES</td>
			<td style="width:119px;">15062</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td style="width:179px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17144003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">BUV395 Mouse Anti-Human CD183&#160;Clone 1C6/CXCR3</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon</td>
			<td>565223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">BV711 Mouse Anti-Human CD196 (CCR6)&#160;Clone 11A9</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon</td>
			<td>563923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">BV421 Rat Anti-Human CXCR5 (CD185)&#160;Clone&#160;RF8B2</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon</td>
			<td>562747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">BB515 Mouse Anti-Human CD4&#160;Clone &#160;RPA-T4</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon</td>
			<td>564419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">PE Mouse Anti-Human CD279&#160;Clone MIH4</td>
			<td style="width:179px;">BD Pharmingen</td>
			<td>557946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone&#160; HI100</td>
			<td style="width:179px;">BD Pharmingen</td>
			<td>560674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;">LIVE/DEAD Fixable Far Red Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation</td>
			<td style="width:179px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">L34973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">Brilliant Stain Buffer</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon</td>
			<td>563794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">Anti-Mouse Ig, &#954;/Negative Control Compensation Particles Set</td>
			<td style="width:179px;">BD CompBead</td>
			<td>552843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">FACS Aria II Flow Cytometer</td>
			<td style="width:179px;">BD Biosciences</td>
			<td>644832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">FACSDiva 6.1.3</td>
			<td style="width:179px;">BD Biosciences</td>
			<td>643629</td>
			<td>Flow Cytometer Acquisition Software</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">FlowJo 10.2</td>
			<td style="width:179px;">Treestar Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flow Cytometry Data Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;">Anti-CXCR3 antibody</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon&#160;</td>
			<td style="width:119px;">565223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;">Anti-CCR6 antibody</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon&#160;</td>
			<td style="width:119px;">563923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;">Anti-CXCR5 antibody</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon&#160;</td>
			<td style="width:119px;">562747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;">Anti-CD4 antibody</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon&#160;</td>
			<td style="width:119px;">564419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;">Anti-PD-1 antibody</td>
			<td style="width:179px;">BD Pharmingen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">557946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;">Anti-CD45RA antibody</td>
			<td style="width:179px;">BD Pharmingen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">560674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;">Viability Marker</td>
			<td style="width:179px;">ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">L34973</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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isolation of cd4+ t-cells and analysis of circulating t-follicular helper (ctfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry

Aberrante atividade das células foliculares-T auxiliar (Tfh) é detectável em doenças auto-imunes e sua presença está associada com desfechos clínicos, quando se analisa o microambiente linfonodal em linfoma de células B não-Hodgkin. Subconjuntos de células T-foliculares auxiliar (cTfh), o compartimento de memória circulantes de células Tfh no sangue, que circula também são perturbados na doença e, portanto, representam potenciais novos biomarcadores preditivos. Teste baseado em sangue periférico é vantajoso porque é relativamente não-invasivo e permite monitoramento serial simples. Este artigo descreve um método para isolar CD4 + T-células do sangue humano e posterior análise por citometria de fluxo para enumerar as células cTfh e as proporções de seus vários subconjuntos (cTfhPD-1-/ + / Oi, cTfh1, 2, 17 e cTfh1/17). O nível destes subconjuntos foi então comparado entre indivíduos normais e pacientes com linfoma. Descobrimos que o método era robusto o suficiente para obter resultados fiáveis de material paciente rotineiramente coletada. A técnica que descrevemos para a análise pode ser facilmente adaptada para celular classificação e aplicações a jusante como RT-PCR.

CD4 alta+ pureza foi conseguida usando o CD4+ protocolo de isolamento, que era de confiança em todas as amostras de sangue testadas por nós (quer dizer: 96,6%, SD: 2.38, n = 31) (Figura 3).
Identificação de cTfh (CD4+ CXCR5+ células) em um assunto normal representativo é apresentado(Figura 4). A proporç...

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Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper cTfh Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

Aqui, um protocolo para o isolamento e caracterização de CD4+ células T subconjuntos do sangue periférico humano é descrito. Purificado CD4+ T-células são analisadas por citometria de fluxo para determinar proporções de subconjuntos de célula auxiliar T-folicular.

Isolamento de CD4+ T-células e análise de circulação folicular-T Helper (cTfh) célula subconjuntos de citometria de fluxo de 6 cores usando o sangue periférico

Aberrant T-follicular helper (Tfh) cell activity is detectable in autoimmune conditions and their presence is associated with clinical outcomes when the ...

Este método pode ajudar a demonstrar as diferenças entre subconjuntos de células auxiliares T-foliculares circulantes em estados saudáveis e doentes. As principais vantagens desta técnica são que é rápido, que as amostras podem ser processadas em lote, e que as células permanecem vivas para análise funcional a jusante. Esta técnica facilita a avaliação dos subconjuntos auxiliares T-foliculares circulantes como biomarcadores para a progressão da doença, pois se correlacionam com marcadores de gravidade clínica. Ajudando na demonstração deste procedimento será a Dra.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper (cTfh) Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Isolamento de células T CD4 + a partir dos nós linfáticos rato Usando Miltenyi Purificação MACS

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

Biologia

Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers

Visualizando CD4 + antígeno específico Células T usando MHC Classe II tetrâmeros

Major histocompatibility complex (MHC) class II tetramers allow the direct visualization of antigen specific CD4+ T cells by flow cytometry.  This method ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Isolamento e cultura de células endoteliais pulmonares de camundongos Neonatal

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

Purificação de Citometria de Fluxo de células de camundongo meiótica

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Optimizado coloração e Proliferação Métodos de Modelagem para Monitoramento Divisão Celular usando Corantes Rastreamento celulares

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Isolamento de Blood-derivado do navio Multipotentes Precursores do músculo-esquelético humano

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Técnicas de Análise de vesículas extracelulares utilizando citometria de fluxo

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood

Geração e cultura de sangue Conseqüência células endoteliais do sangue periférico humano

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular ...

Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

Isolamento e caracterização de microvesículas a partir de sangue periférico

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Análise de suspensões celulares isoladas de tecidos sólidos por citometria de fluxo espectral

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...