Name: isolation of cd4+ t-cells and analysis of circulating t-follicular helper (ctfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper cTfh Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry at JoVE.com

El trabajo fue apoyado por una subvención de leucemia UK a ETB y a MJA.

Se obtuvieron muestras de sangre de sujetos normales (NS) (n = 12) así como pacientes con linfoma de zona marginal (MZL) (n = 7) y otros tipos de linfoma no Hodgkin de células B (BNHL) (FL 6 pacientes, 2 pacientes de linfoma lymphoplasmacytic y 1 bajo grado de células B no especificado linfoma del no Hodgkin paciente). Se reclutaron pacientes de las clínicas de Hematología en el Royal Infirmary de Leicester después de haber informado, consentimiento por escrito, con la aprobación ética en lugar de todos los estud...

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	<li>Vinuesa, C. G., Linterman, M. A., Yu, D., MacLennan, I. C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicular+Helper+T+Cells.">Follicular Helper T Cells.</a> Annual Review of Immunology. 34 (1), 335-368 (2016).</li><li>Nurieva, R. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl6+Mediates+the+Development+of+T+Follicular+Helper+Cells.">Bcl6 Mediates the Development of T Follicular Helper Cells.</a> Science. 325 (5943), 1001-1005 (2009).</li><li>Breitfeld, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicular+B+Helper+T+Cells+Express+Cxc+Chemokine+Receptor+5,+Localize+to+B+Cell+Follicles,+and+Support+Immunoglobulin+Production.">Follicular B Helper T Cells Express Cxc Chemokine Receptor 5, Localize to B Cell Follicles, and Support Immunoglobulin Production.</a> The Journal of Experimental Medicine. 192 (11), 1545-1552 (2000).</li><li>Linterman, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicular+helper+T+cells+are+required+for+systemic+autoimmunity.">Follicular helper T cells are required for systemic autoimmunity.</a> The Journal of Experimental Medicine. 206 (3), 561-576 (2009).</li><li>Bindea, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+Dynamics+of+Intratumoral+Immune+Cells+Reveal+the+Immune+Landscape+in+Human+Cancer.">Spatiotemporal Dynamics of Intratumoral Immune Cells Reveal the Immune Landscape in Human Cancer.</a> Immunity. 39 (4), 782-795 (2013).</li><li>Gu-Trantien, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4++follicular+helper+T+cell+infiltration+predicts+breast+cancer+survival.">CD4+ follicular helper T cell infiltration predicts breast cancer survival.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 2873-2892 (2013).</li><li>Am&#233;-Thomas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+intratumoral+follicular+helper+T+cells+in+follicular+lymphoma:+role+in+the+survival+of+malignant+B+cells.">Characterization of intratumoral follicular helper T cells in follicular lymphoma: role in the survival of malignant B cells.</a> Leukemia. 26 (5), 1053-1063 (2012).</li><li>Bossaller, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICOS+Deficiency+Is+Associated+with+a+Severe+Reduction+of+CXCR5+CD4+Germinal+Center+Th+Cells.">ICOS Deficiency Is Associated with a Severe Reduction of CXCR5+CD4 Germinal Center Th Cells.</a> The Journal of Immunology. 177 (7), 4927-4932 (2006).</li><li>Morita, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Blood+CXCR5+CD4++T+Cells+Are+Counterparts+of+T+Follicular+Cells+and+Contain+Specific+Subsets+that+Differentially+Support+Antibody+Secretion.">Human Blood CXCR5+CD4+ T Cells Are Counterparts of T Follicular Cells and Contain Specific Subsets that Differentially Support Antibody Secretion.</a> Immunity. 34 (1), 108-121 (2011).</li><li>Locci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+circulating+PD-1+CXCR3-CXCR5++memory+Tfh+cells+are+highly+functional+and+correlate+with+broadly+neutralizing+HIV+antibody+responses.">Human circulating PD-1+CXCR3-CXCR5+ memory Tfh cells are highly functional and correlate with broadly neutralizing HIV antibody responses.</a> Immunity. 39 (4), 758-769 (2013).</li><li>He, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+Precursor+CCR7loPD-1hi+CXCR5++CD4++T+Cells+Indicate+Tfh+Cell+Activity+and+Promote+Antibody+Responses+upon+Antigen+Reexposure.">Circulating Precursor CCR7loPD-1hi CXCR5+ CD4+ T Cells Indicate Tfh Cell Activity and Promote Antibody Responses upon Antigen Reexposure.</a> Immunity. 39 (4), 770-781 (2013).</li><li>Schmitt, N., Bentebibel, S. -. E., Ueno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotype+and+functions+of+memory+Tfh+cells+in+human+blood.">Phenotype and functions of memory Tfh cells in human blood.</a> Trends in Immunology. 35 (9), 436-442 (2014).</li><li>Simpson, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+circulating+T+cells+resembling+follicular+helper+T+cells+is+a+fixed+phenotype+that+identifies+a+subset+of+severe+systemic+lupus+erythematosus.">Expansion of circulating T cells resembling follicular helper T cells is a fixed phenotype that identifies a subset of severe systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis and Rheumatism. 62 (1), 234-244 (2010).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+frequencies+of+activated+B+cells+and+T+follicular+helper+cells+are+correlated+with+disease+activity+in+patients+with+new-onset+rheumatoid+arthritis.">High frequencies of activated B cells and T follicular helper cells are correlated with disease activity in patients with new-onset rheumatoid arthritis.</a> Clinical and Experimental Immunology. 174 (2), 212-220 (2013).</li><li>Ueno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Circulating+T+Follicular+Helper+Cell+Subsets+in+Health+and+Disease.">Human Circulating T Follicular Helper Cell Subsets in Health and Disease.</a> Journal of Clinical Immunology. 36, 34-39 (2016).</li><li>Maecker Holden, T., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+controls,+instrument+setup,+and+the+determination+of+positivity.">Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity.</a> Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).</li><li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+Function+of+CD4++T+Follicular+Helper+(Tfh)+Cells+Associated+with+Hepatocellular+Carcinoma+Progression.">Impaired Function of CD4+ T Follicular Helper (Tfh) Cells Associated with Hepatocellular Carcinoma Progression.</a> PLOS ONE. 10 (2), 0117458 (2015).</li><li>Byford, E. T., Carr, M., Ladikou, E., Ahearne, M. J., Wagner, S. 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T., Francisco, L. M., Carman, C. V., Sharpe, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+receptor+PD-1+controls+follicular+regulatory+T+cells+in+the+lymph+nodes+and+blood.">The receptor PD-1 controls follicular regulatory T cells in the lymph nodes and blood.</a> Nature Immunology. 14 (2), 152-161 (2013).</li><li>Sage, P. T., Alvarez, D., Godec, J., von Andrian, U. H., Sharpe, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+T+follicular+regulatory+and+helper+cells+have+memory-like+properties.">Circulating T follicular regulatory and helper cells have memory-like properties.</a> The Journal of Clinical Investigation. 124 (12), 5191-5204 (2014).</li><li>Sage, P. T., Tan, C. L., Freeman, G. J., Haigis, M., Sharpe, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+TFH+Cell+Function+and+Increased+TFR+Cells+Contribute+to+Defective+Antibody+Production+in+Aging.">Defective TFH Cell Function and Increased TFR Cells Contribute to Defective Antibody Production in Aging.</a> Cell Reports. 12 (2), 163-171 (2015).</li><li>Yu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+CD25+CD127low/-+T+Cells:+A+More+Specific+Treg+Population+in+Human+Peripheral+Blood.">CD4+CD25+CD127low/- T Cells: A More Specific Treg Population in Human Peripheral Blood.</a> Inflammation. 35 (6), 1773-1780 (2012).</li></ol>

Este protocolo representa una manera simple y eficaz para analizar las células de cTfh de sangre periférica, lo que permite la detección de todos los subconjuntos relevantes identificados en la literatura hasta el momento. Muestras de sangre pueden fácilmente y eficientemente obtenerse como parte de estándar pacientes clínicas y muestras seriales se puede recoger en paralelo con los datos clínicos. A su vez, esto permite estudios prospectivos evaluando la cTfh subconjuntos como biomarcadores de progresión de la e...

Linfocitos T folicular (Tfh) son un CD4+ subconjunto de células T que fue inicialmente caracterizada en tejidos linfoides1. Estas células expresan PD-1 y receptores de superficie de CXCR5, secretan IL-21 e IL-4 y expresión nuclear del factor de transcripción, BCL-62,3. Como su nombre lo indica, se encuentran en centros germinales y son esenciales para la producción de anticuerpos de alta afinidad1.
Respuestas de Dysregulated Tfh se han implicado en la patogénesis de la enfermedad, especialmente enfermedades autoinmunes, donde promueven la expansión de las células autorreactivas B4. También desempeñan un papel en el microambiente del tumor sólido5,6 y7de cánceres linfoides. Por el contrario, defectos genéticos de proteínas de la superficie esenciales para ESF funcionan como resultado de costimulator (ICOS) de células T inducible en síndromes de inmunodeficiencia humana8. CD4+ CXCR5+ células en sangre periférica se denominan circulantes linfocitos T folicular (cTfh) y se cree que el compartimiento de memoria de Tfh células en los tejidos9. El propósito del método descrito aquí es el análisis de subconjuntos de cTfh siguiendo CD4+ aislamiento de muestras de sangre periférica de la célula.
Se han definido varios subconjuntos de cTfh y la eficiencia con la que proporcionan ayuda de la célula de B difiere de un subconjunto a otro9,10,11,12. Las proporciones relativas de estos subconjuntos se alteran en un número de enfermedades, la mayoría prominente trastorno autoinmunitario en el que hay es casi siempre un aumento relativo en el PD-1 más funcional+ Hola o cTfh2 o cTfh17 los subconjuntos en comparación con los menos PD-1 funcional– o cTfh1 subconjuntos12. La magnitud de estos cambios con frecuencia asociado con parámetros clínicos incluyendo títulos de actividad y autoanticuerpo enfermedad, indicando un papel potencial de la distribución de cTfh subconjunto como un biomarcador pronóstico en la enfermedad, que puede reflejar la actividad de ESF en tejidos linfoides9,12,13,14. Además, tomando muestras de sangre de los participantes es rápida, segura y aceptable y así permite serie de monitoreo para el análisis de progresión de la enfermedad o respuesta a la terapia.
El uso de aislado CD4+ las células T sobre suspensiones de células mononucleares (MPC) de sangre periférica tradicional permite experimentos de citometría de flujo de rendimiento más altos, reduciendo el tiempo necesario para adquirir un número considerable de cTfh células para análisis. Esto es particularmente útil cuando clasificación células de cTfh rara subconjuntos utilizando flujo activada (FACS) de clasificación de la célula. Para ayudar a la eficacia, estas suspensiones pueden ser criopreservadas para habilitar la "dosificación" de muestras a utilizar en el experimento de citometría de flujo. En la prueba, el CD4+ pureza no se redujo por criopreservación.
Mientras que diferentes laboratorios utilizados diferentes marcadores para categorizar cTfh células en las primeras etapas de su descubrimiento, el método presentaron aquí hace uso de un esquema Unificado de dos grupos de marcadores de superficie celular propuesto por Schmidt et al.12, 15 para permitir la identificación simultánea de cTfh y sus subconjuntos reconocidos nueve en una citometría de flujo único experimento.
Como son sólo marcadores de superficie celular, las células no requieren fijación o permeabilización y así pueden permanecer vivas para posteriores estudios funcionales. Esto podría facilitarse mediante clasificación utilizando FACS con el mismo panel de anticuerpos de la célula. Este panel podría ampliarse para incluir otros marcadores, teniendo en cuenta las restricciones del citómetro de flujo se utiliza.
El análisis de experimentos de citometría de flujo de varios colores puede ser difícil debido a la naturaleza inherentemente subjetiva de gating en punto 2 dimensiones de parcelas, sobre todo cuando poblaciones celulares no tienen una distribución bimodal clara en fluorescencia del marcador, como es el caso de las células de la cTfh y sus subconjuntos. Por esta razón, es imprescindible establecer controles efectivos para reducir los artefactos para permitir una mejor resolución de las poblaciones y establecer estrategias que bloquean con confianza. Como tal, diseño del panel de anticuerpos y la puesta en marcha de controles básicos para un flujo cytometry experimentan, es decir, mediante indemnización y FMO controles se detallan en el paso 3.4.2 y 3.4.3,respectively.
Todas las células de la cTfh se definen como CD4+ CXCR5+ CD45RA–. El nivel de expresión del marcador característico de activación de Tfh PD-1 se puede determinar entonces identificar los subconjuntos de PD-1-,+ de PD-1 o PD-1Hola cTfh células. Luego, usando una combinación de los receptores del chemokine CXCR3 y CCR6, que se expresan diferencialmente por Th1 tradicionales 2 o 17 células, cTfh se puede caracterizar como cTfh1, 2 o 17-como por un perfil de CXCR3+ CCR6-, CXCR3– CCR6- y CXCR3– CCR6+, respectivamente.
El panel de anticuerpos utilizado en nuestro laboratorio se muestra en la tabla 1. El usuario tenga que adaptar su selección fluoróforo para tener en cuenta el láser y la configuración de filtros de luz disponible en su citómetro de flujo local.
Las siguientes consideraciones influyen en la elección de fluoróforos. Uso de fluoróforos brillante posible. En particular, utilice los fluoróforos más brillantes disponibles en los marcadores más tenue (menos altamente expresados). Marcadores de dimmer incluyen PD-1, CXCR3 y CCR6 y en menor medida, CXCR5. Específicamente hizo uso de la nueva BB, BV y BUV fluoróforos que brindan excelente luminosidad y permitan así una más fácil resolución de poblaciones distintas de las células.
Extender la selección fluoróforo a través de los espectros de emisión tanto como sea posibles reducir al mínimo solapamiento espectral y así el nivel de compensación requerido. Una herramienta gratis, en línea que puede utilizar para ayudar a diseñar un panel de citometría de flujo se puede encontrar aquí: http://www.bdbioscienes.com/us/s/spectrumviewer. Para ahorrar espacio en el espectro de emisión, se empleó un "canal de descarga" usando un tinte de viabilidad con una longitud de onda de emisión que se superpone con la de APC-H7 (CD45RA conjugado) para permitir la detección y exclusión de ambos muertos o CD45RA+ con un solo detector.
Aquí, se presenta un protocolo para el aislamiento de la sangre periférica CD4+ las células T y su posterior análisis mediante citometría de flujo para determinar las proporciones de la diferentes y recientemente descrito circulación subconjuntos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1037px;" width="1037">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail</td>
			<td style="width:179px;">STEMCELL TECHNOLOGIES</td>
			<td style="width:119px;">15062</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td style="width:179px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17144003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">BUV395 Mouse Anti-Human CD183&#160;Clone 1C6/CXCR3</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon</td>
			<td>565223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">BV711 Mouse Anti-Human CD196 (CCR6)&#160;Clone 11A9</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon</td>
			<td>563923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">BV421 Rat Anti-Human CXCR5 (CD185)&#160;Clone&#160;RF8B2</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon</td>
			<td>562747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">BB515 Mouse Anti-Human CD4&#160;Clone &#160;RPA-T4</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon</td>
			<td>564419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">PE Mouse Anti-Human CD279&#160;Clone MIH4</td>
			<td style="width:179px;">BD Pharmingen</td>
			<td>557946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone&#160; HI100</td>
			<td style="width:179px;">BD Pharmingen</td>
			<td>560674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;">LIVE/DEAD Fixable Far Red Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation</td>
			<td style="width:179px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">L34973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">Brilliant Stain Buffer</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon</td>
			<td>563794</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">Anti-Mouse Ig, &#954;/Negative Control Compensation Particles Set</td>
			<td style="width:179px;">BD CompBead</td>
			<td>552843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">FACS Aria II Flow Cytometer</td>
			<td style="width:179px;">BD Biosciences</td>
			<td>644832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">FACSDiva 6.1.3</td>
			<td style="width:179px;">BD Biosciences</td>
			<td>643629</td>
			<td>Flow Cytometer Acquisition Software</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:485px;">FlowJo 10.2</td>
			<td style="width:179px;">Treestar Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Flow Cytometry Data Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;">Anti-CXCR3 antibody</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon&#160;</td>
			<td style="width:119px;">565223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;">Anti-CCR6 antibody</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon&#160;</td>
			<td style="width:119px;">563923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;">Anti-CXCR5 antibody</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon&#160;</td>
			<td style="width:119px;">562747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;">Anti-CD4 antibody</td>
			<td style="width:179px;">BD Horizon&#160;</td>
			<td style="width:119px;">564419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;">Anti-PD-1 antibody</td>
			<td style="width:179px;">BD Pharmingen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">557946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;">Anti-CD45RA antibody</td>
			<td style="width:179px;">BD Pharmingen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">560674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:485px;">Viability Marker</td>
			<td style="width:179px;">ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">L34973</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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isolation of cd4+ t-cells and analysis of circulating t-follicular helper (ctfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry

Actividad folicular T aberrante de las células helper (Tfh) es detectable en condiciones autoinmunes y su presencia se asocia con resultados clínicos cuando se analiza el microambiente del nodo de linfa en el linfoma no Hodgkin de células B. Subconjuntos de linfocitos T-folicular (cTfh), el compartimiento de memoria circulantes de Tfh células en la sangre en circulación son también perturbados en la enfermedad y por lo tanto representan potenciales nuevos biomarcadores predictivos. Pruebas basadas en sangre periférica es ventajoso porque es relativamente no invasivo y permite el control serial simple. Este artículo describe un método para aislar CD4+ las células T de sangre humana y posterior análisis mediante citometría de flujo para enumerar las células cTfh y las proporciones de sus diferentes subconjuntos (cTfhPD-1-/ + / hi, cTfh1, 2, 17 y cTfh1/17). El nivel de estos subconjuntos se comparó entonces entre sujetos normales y pacientes con linfoma. Encontramos que el método era suficientemente robusto como para obtener resultados confiables de material paciente habitualmente recogido. La técnica que describimos para el análisis es adaptable fácilmente a célula clasificación y aplicaciones posteriores como RT-PCR.

Alta CD4+ pureza fue alcanzada usando el CD4+ protocolo de aislamiento, que era confiable a través de todas las muestras de sangre probados por nosotros (significa: 96,6%, SD: 2.38, n = 31) (figura 3).
Identificación de cTfh (CD4+ CXCR5+ células) en un sujeto normal representativo se presenta (figura 4A). L...

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Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper cTfh Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

Aquí, un protocolo para el aislamiento y la caracterización de CD4+ T-cell se describe subconjuntos de sangre periférica humana. Purificada de CD4+ las células T son analizadas por citometría de flujo para determinar proporciones de subconjuntos de células helper T-folicular.

Aislamiento de CD4+ las células de T y análisis de circulación folicular T Helper (cTfh) subconjuntos de la célula del uso de sangre periférica citometría de flujo de 6 colores

Aberrant T-follicular helper (Tfh) cell activity is detectable in autoimmune conditions and their presence is associated with clinical outcomes when the ...

Este método puede ayudar a demostrar las diferencias entre los subconjuntos de células auxiliares T-foliculares circulantes en estados sanos y enfermos. Las principales ventajas de esta técnica son que es rápida, que las muestras se pueden procesar por lotes y que las celdas permanecen activas para el análisis funcional posterior. Esta técnica facilita la evaluación de subconjuntos auxiliares T-foliculares circulantes como biomarcadores para la progresión de la enfermedad, ya que se correlacionan con marcadores de gravedad clínica. Ayudar con la demostración de este procedimiento será la Dra. Lucia Pi

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper (cTfh) Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Aislamiento de células T CD4 + de los ganglios linfáticos del ratón utilizando Miltenyi Purificación MACS

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

Investigación

Biología

Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers

Visualización de antígeno específico de células T CD4 + con MHC de clase II tetrámeros

Major histocompatibility complex (MHC) class II tetramers allow the direct visualization of antigen specific CD4+ T cells by flow cytometry.  This method ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Aislamiento y cultivo de células endoteliales pulmonares de ratones recién nacidos

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

Citometría de flujo de purificación de las células de ratón meiótica

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Optimizado manchas y Proliferación métodos de modelización para la vigilancia del uso de tintes División Celular Celulares de seguimiento

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Aislamiento de Vaso sanguíneo derivado Multipotentes Precursores de músculo esquelético humano

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Técnicas para el Análisis de extracelular vesículas Usando citometría de flujo

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood

Generación y Cultura de Sangre Consecuencia endoteliales Las células de la sangre periférica humana

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular ...

Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

Aislamiento y caracterización de microvesículas de la sangre periférica

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Análisis de suspensiones celulares aisladas de tejidos sólidos por Spectral Citometría de Flujo

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...