Name: co-immunoprecipitation assay for studying functional interactions between receptors and enzymes
Uploaded: 2018-09-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes at JoVE.com

تم تمويل هذا المشروع "منح المعاهد الوطنية للصحة" 1R01AI125640-01 و "مؤسسة أبحاث أمراض الروماتيزم".

1-تعداء الخلايا
<ol><li>البذور HEK 293T الخلايا إلى اثني عشر لوحات 10 سم (5 × 106 خلايا للوحة الواحدة) في اليوم السابق تعداء (الشكل 1). إجراء عد الخلايا استخدام هيموسيتوميتير. لكل لوحة، استخدام 10 مل دميم وتستكمل مع 10% FBS و 1% البنسلين/ستربتوميسين. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في ش...

<ol>
	<li>Montor, W. R., Salas, A., Melo, F. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+tyrosine+kinases+and+downstream+pathways+as+druggable+targets+for+cancer+treatment:+the+current+arsenal+of+inhibitors.">Receptor tyrosine kinases and downstream pathways as druggable targets for cancer treatment: the current arsenal of inhibitors.</a> Molecular Cancer. 17 (1), (2018).</li><li>Ngoenkam, J., Schamel, W. W., Pongcharoen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selected+signalling+proteins+recruited+to+the+T-cell+receptor-CD3+complex.">Selected signalling proteins recruited to the T-cell receptor-CD3 complex.</a> Immunology. 153 (1), 42-50 (2018).</li><li>Azoulay-Alfaguter, I., Strazza, M., Pedoeem, A., Mor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+coreceptor+programmed+death+1+inhibits+T-cell+adhesion+by+regulating+Rap1.">The coreceptor programmed death 1 inhibits T-cell adhesion by regulating Rap1.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (2), 564-567 (2015).</li><li>Chemnitz, J. M., Parry, R. V., Nichols, K. E., June, C. H., Riley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHP-1+and+SHP-2+associate+with+immunoreceptor+tyrosine-based+switch+motif+of+programmed+death+1+upon+primary+human+T+cell+stimulation,+but+only+receptor+ligation+prevents+T+cell+activation.">SHP-1 and SHP-2 associate with immunoreceptor tyrosine-based switch motif of programmed death 1 upon primary human T cell stimulation, but only receptor ligation prevents T cell activation.</a> The Journal of Immunology. 173 (2), 945-954 (2004).</li><li>Patsoukis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+effects+of+PD-1+on+Akt+and+Ras+pathways+regulate+molecular+components+of+the+cell+cycle+and+inhibit+T+cell+proliferation.">Selective effects of PD-1 on Akt and Ras pathways regulate molecular components of the cell cycle and inhibit T cell proliferation.</a> Science Signaling. 5 (230), 46 (2012).</li><li>Pentcheva-Hoang, T., Chen, L., Pardoll, D. M., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+death-1+concentration+at+the+immunological+synapse+is+determined+by+ligand+affinity+and+availability.">Programmed death-1 concentration at the immunological synapse is determined by ligand affinity and availability.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (45), (2007).</li><li>Yokosuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+death+1+forms+negative+costimulatory+microclusters+that+directly+inhibit+T+cell+receptor+signaling+by+recruiting+phosphatase+SHP2.">Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2.</a> The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1201-1217 (2012).</li><li>Hui, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+costimulatory+receptor+CD28+is+a+primary+target+for+PD-1-mediated+inhibition.">T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition.</a> Science. 355 (6332), 1428-1433 (2017).</li><li>Sheppard, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+inhibits+T-cell+receptor+induced+phosphorylation+of+the+ZAP70/CD3zeta+signalosome+and+downstream+signaling+to+PKCtheta.">PD-1 inhibits T-cell receptor induced phosphorylation of the ZAP70/CD3zeta signalosome and downstream signaling to PKCtheta.</a> FEBS Letters. 574 (1-3), 37-41 (2004).</li><li>Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+immunoreceptor+inhibits+B+cell+receptor-mediated+signaling+by+recruiting+src+homology+2-domain-containing+tyrosine+phosphatase+2+to+phosphotyrosine.">PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (24), 13866-13871 (2001).</li><li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonism+between+binding+site+affinity+and+conformational+dynamics+tunes+alternative+cis-interactions+within+Shp2.">Antagonism between binding site affinity and conformational dynamics tunes alternative cis-interactions within Shp2.</a> Nature Communications. 4, 2037 (2013).</li><li>Peled, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+purification+mass+spectrometry+analysis+of+PD-1+uncovers+SAP+as+a+new+checkpoint+inhibitor.">Affinity purification mass spectrometry analysis of PD-1 uncovers SAP as a new checkpoint inhibitor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), E468-E477 (2018).</li><li>Jang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protein+tyrosine+phosphatase+inhibitor,+pervanadate,+inhibits+angiotensin+II-Induced+beta-arrestin+cleavage.">A protein tyrosine phosphatase inhibitor, pervanadate, inhibits angiotensin II-Induced beta-arrestin cleavage.</a> Molecules and Cells. 28 (1), 25-30 (2009).</li><li>Pluskey, S., Wandless, T. J., Walsh, C. T., Shoelson, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+stimulation+of+SH-PTP2+phosphatase+activity+by+simultaneous+occupancy+of+both+SH2+domains.">Potent stimulation of SH-PTP2 phosphatase activity by simultaneous occupancy of both SH2 domains.</a> The Journal of Biological Chemistry. 270 (7), 2897-2900 (1995).</li><li>McAvoy, T., Nairn, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serine/threonine+protein+phosphatase+assays.">Serine/threonine protein phosphatase assays.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).</li><li>Shlapatska, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD150+association+with+either+the+SH2-containing+inositol+phosphatase+or+the+SH2-containing+protein+tyrosine+phosphatase+is+regulated+by+the+adaptor+protein+SH2D1A.">CD150 association with either the SH2-containing inositol phosphatase or the SH2-containing protein tyrosine phosphatase is regulated by the adaptor protein SH2D1A.</a> The Journal of Immunology. 166 (9), 5480-5487 (2001).</li></ol>

التفاعلات مستقبلات إنزيم ذات أهمية حاسمة للإشارات داخل الخلايا. ويتم تجنيد العديد من الإنزيمات المستقبلات من خلال نطاقات SH2 ملزمة إلى تيروسينيس فوسفوريلاتيد التي تزين ذيول مستقبلات نفس. بيد أن الإنزيمات هي غالباً مطوية في والتشكلات الخاملة مغلقة ويتطلب التنشيط تغيير conformational11</...

مستقبلات الحفاز ومستقبلات تيروسين مؤنزم هي بروتينات transmembrane فيها أسباب ملزمة ليجند خارج الخلية النشاط الأنزيمي على الجانب داخل الخلية1. تمتلك بعض مستقبلات مستقبلات ووظائف الانزيمية، بينما آخرون توظيف إنزيمات معينة مثل مؤنزم وفوسفاتاسيس إلى ذيولها هيولى. التجنيد لأنزيم الذيل المستقبلات وعمل الحفاز اللاحقة لهذا الإنزيم هي عمليتين منفصلتين لا تخضع دائماً لنطاقات البروتين نفسه2. لسوء الحظ، هناك أية أدوات محددة لتقييم كل من التفاعل والنشاط الأنزيمي في وقت واحد. الإنزيم co-إيمونوبريسيبيتيشن الفنية الموصوفة هنا طريقة مفيدة لتشريح توظيف إنزيم بذيل مستقبلات من تنشيطه. ويستخدم هذا التحليل إيمونوبريسيبيتيشن مستقبلات الموسومة بالخرز المغلفة بالأجسام المضادة. في وقت لاحق، يتم تنفيذ كلا من تحليل النشاط الأنزيمي وتحليل لطخة غربية في الخرز. والهدف العام لهذا الأسلوب للكشف عن المجالات البروتينات التي هي ضرورية للتفاعلات بين المستقبلات والأنزيمات بتحليل لطخة غربية (تقييم) والمجالات التي هي إلزامية للتنشيط الكامل للإنزيمات (تقاس على حبة تحليل النشاط الأنزيمي). أنها هامة لتطوير أدوات لدراسة مهام منفصلة مرتبطة بمستقبلات الإنزيمات بسبب مشاركتهم في الآلية المرضية للأمراض التي تصيب الإنسان. وعلاوة على ذلك، قد تساعد المزيد من فهم آليات العمل هذه البروتينات تصميم التدخلات العلاجية الرواية.
المبرمجة الموت-1 (PD-1) مستقبلات مثبطة على سطح الخلايا التائية ومطلوب من أجل الحد من الاستجابات المفرطة T الخلية. وفي السنوات الأخيرة، قد تورط الأجسام المضادة-PD-1 في علاج الأورام الخبيثة متعددة1،2. ربط PD-1 يقيد العديد من المهام T الخلية، بما في ذلك انتشار والالتصاق وإفراز السيتوكينات متعددة3،،من45. يتم ترجمة PD-1 إلى المشبك المناعية، التفاعل بين خلايا تي وعرض مستضد الخلايا6، حيث أنها كولوكاليزيس مع خلايا تي مستقبلات (تكر)7. وفي وقت لاحق، الفوسفاتيز تيروزين SHP2 [Src التماثل 2 (SH2) المجال الذي يحتوي على تيروزين الفوسفاتيز 2] يتم تجنيده بذيل هيولى PD-1، مما أدى إلى ديفوسفوريليشن من بقايا تيروزين الرئيسية داخل تكر المعقدة وما يرتبط بها الدانية إشارات الجزيئات3،،من45،،من89. ذيل هيولى PD-1 يحتوي على اثنين تيروزين زخارف، إيمونوريسيبتور المستندة إلى تيروزين مثبطة فكرة (عيتيم)، ورمز التبديل على أساس فكرة (ITSM) تيروزين إيمونوريسيبتور10. يتم فوسفوريلاتيد على حد سواء زخارف عند PD-1 ربط9،10. وأظهرت الدراسات الطفرات دور أساسي ل ITSM في التوظيف، مقابل ايتيم، يتمثل دورها في إشارات PD-1 ووظيفة ليست واضحة SHP24.
SHP2 يعتمد أما مغلقة (مطوية)، وتحول دون تكيف أو مفتوح (الموسع)، تكيف النشط11. لا بعد توضيح مساهمة كل مجال ذيل PD-1 لربط SHP2 أو التنشيط. للإجابة على هذا السؤال، قمنا بتطوير مقايسة التي تمكن من اختبار موازية لتوظيف SHP2 بذيل PD-1 وفي النشاط12. استخدمنا co-إيمونوبريسيبيتيشن ومقايسة نشاط الفوسفاتيز في حبة لاختبار كل من التفاعل والنشاط الأنزيمي بالتوازي. باستخدام هذا الفحص، ونحن تبين أن "مقدمو الخدمات" PD-1 كافية لتوظيف SHP2 بذيل PD-1، بينما يلزم ايتيم PD-1 تماما توسيع وتنشيط الإنزيم.
وهناك العديد من المستقبلات التي لديها العديد من المجالات المجاورة في ذيولها هيولى. يمكن كشف التحليل وظيفية co-إيمونوبريسيبيتيشن دور المجالات المحددة التي ضرورية لتعيين البروتين أو التنشيط الانزيمية.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-516F</td>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424-R</td>
			<td>1.5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated FBS</td>
			<td>Denville</td>
			<td>FB5001-H</td>
			<td>Fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin / Streptomycin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP295950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose without L-glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-614F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFect Transfection Reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>301305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SHP2</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;GFP-agarose</td>
			<td>MBL</td>
			<td>D153-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>118144600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Actin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-1616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK-293 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orthovanadate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>216763</td>
			<td>30%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td>EDTA-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC2676</td>
			<td>Modified Laemmli buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% Tris-Glycine Mini Gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>XP04205BOX</td>
			<td>15-well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membranes</td>
			<td>General Electric</td>
			<td>10600004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td>N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1532</td>
			<td>Dithiothreitol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pNPP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>20-106</td>
			<td>p-Nitrophenyl Phosphate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td>Sodium hydroxide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>23225</td>
			<td>Bi Cinchoninic Acid assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

co-immunoprecipitation assay for studying functional interactions between receptors and enzymes

هي الإنزيمات المرتبطة بمستقبلات الوسطاء الرئيسية لتنشيط الهاتف الخلوي. هذه الإنزيمات وينظم، على الأقل في جزء منه، التفاعلات المادية مع ذيول هيولى مستقبلات. التفاعلات وكثيراً ما تحدث من خلال مجالات محددة من البروتين ويؤدي إلى تنشيط الإنزيمات. هناك عدة طرق لدراسة التفاعلات بين البروتينات. بينما co-إيمونوبريسيبيتيشن يستخدم عادة لدراسة المجالات التي تكون مطلوبة لتفاعلات البروتين البروتين، هناك لا فحوصات تلك الوثيقة مساهمة مجالات محددة لنشاط الإنزيمات المعينين في نفس الوقت. تبعاً لذلك، يجمع بين الأسلوب الموصوفة هنا co-إيمونوبريسيبيتيشن ومقايسة نشاط الأنزيمي في حبة للتقييم المتزامن للتفاعلات بين البروتينات والتنشيط الانزيمية المرتبطة بها. والهدف من هذا البروتوكول هو تحديد المجالات التي تعتبر بالغة الأهمية للتفاعلات الفيزيائية بين بروتين والانزيم والمجالات التي إلزامية للتنشيط الكامل للانزيم. وتتضح أهمية هذا الفحص، كبعض مستقبلات نطاقات البروتين تسهم الملزمة للانزيم بذيل هيولى المستقبلات، مع مجالات أخرى ضرورية لتنظيم وظيفة إنزيم نفس.

بينما يتم إنشاء المساهمة من ITSM PD-1 لربط SHP2، ودور ايتيم PD-1 أقل وضوحاً. بسبب SHP2 بين المجالات SH2 الذي يمكن ربطه باثنين فوسفوتيروسينيس متسلسلة على PD-1 (تيروزين واحدة في ITSM)، والآخر في "عيتيم"، افترضنا أن المراسي "مقدمو الخدمات" PD-1 SHP2 PD-1، بينما يسهل ايتيم PD-1 النشاط SHP2 بتحقيق الاستق...

Watch this Scientific Journal Video about Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes at JoVE.com

Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes

الإنزيم Co-إيمونوبريسيبيتيشن لدراسة التفاعلات الوظيفية بين المستقبلات والأنزيمات

نقدم هنا، على بروتوكول لشركة إيمونوبريسيبيتيشن ومقايسة نشاط الأنزيمي في حبة للدراسة في نفس الوقت مساهمة مجالات محددة من البروتين مستقبلات غشاء البلازما لأنزيم التوظيف ونشاط إنزيم.

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال إشارة الخلية مثل أهمية مجالات البروتين المختلفة في تفاعل إنزيم المستقبلات والتنشيط الأنزيمي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بإجراء اختبار متزامن لتفاعلات إنزيم المستقبلات والعواقب الوظيفية لهذا التفاعل على نشاط الإنزيم. لكل لوحة، استخدم 10 ملليلتر من DMEM تكملها 10٪ FBS و 1٪ البنسلين و ستريبتوميسين.في اليوم السابق لتحول الدم، بذور الكلى الجنينية البشرية 293-T الخلايا في 12 10 لوحات 10 سم باستخدام مقياس الهيموسيتلتامتر لحساب الخلايا. احتضان في 37 درجة مئوية في 5٪ C02. مرة واحدة في الخلايا هي 80 إلى 90٪ التقاء، واستخدام عامل تحويل الدهون على أساس نقل خمسة من لوحات.تنفيذ transfection اتباع تعليمات الشركة المصنعة لخلايا الالتزام في لوحات 10 سم. ثم نقل مجموعة ثانية متطابقة من خمس لوحات جنبا إلى جنب مع لوحة إضافية واحدة بمثابة عنصر تحكم غير نقلة لقياس كمية البروتين أعرب قبل المناعة. احتضان اللوحات المصابة في حاضنة لثقافة الأنسجة عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 ساعة.استخدام المجهر الفلورسنت لفحص الخلايا للتعبير GFP والتأكد من حدوث نقل بنجاح. مزيج 15 ميكرولترات من 100 ملليمولار الصوديوم orthovanadate مع 50 ميكرولترات من بيروكسيد الهيدروجين 30٪ لإعداد خليط pervanadate الطازجة. لفسفوريبليات الإصدارات الموسومة من PD-1، إزالة الوسائط من الخلايا المصابة PD-1-GFP.إضافة 10 ملليلتر من DMEM عادي و 10 ميكرولترات من pervanadate إلى كل لوحة. احتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك، قم بغسل الخلايا ثلاث مرات في برنامج PBS البارد بالجليد باستخدام خمسة ملليلترات من PBS لكل غسل.أثناء إجراء المناعة، ينبغي أن يتم تنفيذ جميع الخطوات إما على الجليد أو في أربع درجات مئوية. تكملة العازلة تحلل مع مثبطات البروتياز عن طريق حل قرص واحد من مثبطات في 10 ملليلتر من العازلة. إضافة أيضا ملليمتر واحد من orthovanadate الصوديوم إلى المخزن المؤقت الذي سيتم استخدامه على لوحات PD-1-GFP-trans-fected.إضافة 500 ميكرولترات من الجليد الباردة العازلة إلى الخلايا، مع التأكد من إضافة العازلة التحلل التي تحتوي على orthovanadate الصوديوم فقط إلى لوحات تحتوي على خلايا PD-1-GFP العابرة. استخدم مكشطة الخلايا لإزالة الخلايا وجمعها من اللوحات على الفور. نقل lysates في أنابيب باردة 1.5 ملليلتر وتدويرها في 0.005 مرة الجاذبية وعند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.لجمع ما بعد nuclei supernatant من lysates ، تدور عليهم في 10، 000 مرة الجاذبية وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. نقل اغطار في أنابيب جديدة والتخلص من بيليه. تخزين االصحون للحصول على المجموعة الثانية من ستة لوحات على الجليد لتحليل WCL في وقت لاحق.للبدء في إعداد الخرز المضادة لـ GFP ، اصافح الزجاجة التي تحتوي على الخرز قبل الفتح لمنع الاستقرار. إزالة 40 ميكرولترات من الخرز المضادة لGFP من الطين لكل حالة. جهاز طرد مركزي في 500 مرة الجاذبية و 4 درجات مئوية لمدة ثلاث دقائق.إزالة supernatant لغسل الخرز، مع التأكد من تقليل الاتصال بين ماصة والخرز لمنع الخسارة. Resuspend الخرز في 80 ميكرولتررس من تحلل العازلة لكل عينة. إضافة الخرز غسلها مباشرة إلى الخلية lysate من الخلايا التي تعبر عن PD-1-GFP من المجموعة الأولى من أربع لوحات.تدوير في 0.005 مرة الجاذبية لمدة 30 دقيقة في أربع درجات مئوية إلى المناعةcipitate البروتينات الموسومة GFP. غسل الخرز ثلاث مرات باستخدام ملليلتر واحد من عازلة التحلل الباردة التي لا تحتوي على orthovanadate لكل غسل. ثم الطرد المركزي في 2، 500 مرة الجاذبية لمدة 10 ثوان.تقسيم lysate من SHP2 النشطة من المجموعة الأولى من لوحات إلى ثلاثة أجزاء متساوية وإضافة جزء إلى كل من الأنابيب الثلاثة التي تحتوي على الخرز PD-1-GFP غسلها. إضافة 3/1 من حجم lysate من الخلايا غير المُصابة إلى الأنبوب الثاني من نوع البرية، خرز PD-1-GFP. تجاهل 2/3 المتبقية.احتضان الخرز لمدة أربع ساعات في أربع درجات مئوية مع تناوب لطيف في 0.005 مرات الجاذبية. بعد ذلك ، يغسل الخرز مرتين باستخدام ملليلتر واحد من عازلة التحلل الباردة لكل غسل. إضافة 80 ميكرولترات من عازلة التحلل إلى كل عينة، وضمان أن الحجم الإجمالي في كل أنبوب هو 100 ميكرولترات.باستخدام طرف ماصة قطع، ماصة بلطف صعودا وهبوطا لخلط. ثم نقل 50 ميكروليتر من كل أنبوب إلى اثنين، الطازجة، أنابيب 1.5 ملليلتر. غسل الخرز مرة واحدة مع فسفاتز غسل العازلة.ثم إزالة ناظر تماما. إضافة 100 ميكرولترات من العازلة المقايسة إلى الخرز واحتضان في 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة تحت التحريض لطيف. عندما يتحول العازلة الصفراء، إنهاء التفاعل بإضافة 50 ميكرولترات من محلول واحد من الصوديوم هيدروكسيد.جهاز طرد مركزي في 2،500 مرة الجاذبية لمدة 10 ثوان. بعد هذا، نقل المابير إلى بئرين من نصف منطقة في لوحة 96 جيدا. قراءة ماصة في 405 نانومتر والتعبير عن النتائج ككثافة بصرية نسبية على التحكم من النوع البرية نسخة من PD-1-GFP.تدور أولا أسفل الخرز في 2، 000 مرة الجاذبية وأربع درجات مئوية لمدة 30 ثانية وإزالة افرا. إضافة 20 ميكرولترات من مرتين Laemmli العازلة ويغلي في 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. باستخدام مجموعة BCA، وقياس تركيز البروتين من عناصر التحكم في المدخلات.نقل 30 ميكرولترات من العينة الأكثر المخفف إلى أنبوب جديد. استخدام المخزن المؤقت للتخفيف من بقية عناصر تحكم الإدخال إلى نفس تركيز العينة الأكثر المخفف. ثم نقل 30 ميكرولترات من كل من عناصر التحكم في المدخلات المخففة إلى أنبوب جديد.إضافة وحدات التخزين متساوية من مرتين Laemmli العازلة إلى lysates ويغلي لهم 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. بعد هذا، تدور أسفل الخرز في 2،000 مرة الجاذبية وأربع درجات مئوية لمدة 30 ثانية قبل تنفيذ تحليل لطخة الغربية كما هو مبين في بروتوكول النص. في هذه الدراسة، تم تطوير تحليل مشترك للمناعة المشتركة والنشاط الأنزيمي للتقييم المتوازي لتفاعلات إنزيمات المستقبلات والتنشيط.ومن غير المستغرب أن SHP2 فشل في الارتباط PD-1 عندما تم تحور ITSM. ومن اللافت للنظر أن النسخة المتحولة من ITIM منعت SHP2 من الربط فقط إلى حد محدود. ومع ذلك، فإن مؤشر SHP2-phosphatase النشاط يكشف أن ITIM و ITSM لا غنى عنها على قدم المساواة للنشاط الأنزيمي.وهذا يكشف عن نموذج تفعيل من خطوتين حيث يتم طي SHP2 في التشكل autoinhied تحت ظروف الراحة. عند تفعيل PD-1، يتم تجنيد SHP2 إلى ITSM الفوسفورية. ومع ذلك، يجب أيضا أن يكون فسفور ITIM أن تتكشف SHP2 في التشكل النشط.بعد تطورها، يمكن لهذه التقنية أن تمهد الطريق للباحثين في مجال إشارات الخلايا لاستكشاف وظيفة مجالات البروتين في تفاعلات مستقبلات الإنزيم.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

والفحص ضوء بارد الكالسيوم عن التحليل الوظيفي من البعوض ( الزاعجة المصرية) والقراد ( مروحية الرأس المتثني) G - يقترن بروتين المستقبلات

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes.  The ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

رصد هجرة الخلايا الجذعية باستخدام<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H التصوير بالرنين المغناطيسي

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

دراسة تفاعلات<em&gt; المكورات العنقودية الذهبية</em&gt; مع العدلات بواسطة التدفق الخلوي والوقت الفاصل بين المجهري

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

رواية<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج لدراسة التفاعلات بين الدم الكامل الإنسان والبطانة Endothelium

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

كشف الجليكوجين في خلايا الدم المحيطي وحيدات النوى مع الدوري حمض شيف تلطيخ

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

شارك في مناعي من البروتين ماوس MX1 مع الأنفلونزا من الفيروسات البروتين النووي

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

والرزن التصاق الديناميكي للتحليل الوظيفي من العلاجات المضادة الالتصاق في مرض التهاب الأمعاء

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

الاستخدام التكميلي للتقنيات المجهرية والقراءة الفلورية في دراسة تفاعلات Cryptococcus-Amoeba

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

مونولاييرس كولونويد البشرية لدراسة التفاعلات بين العوامل الممرضة، كومينسالس، وظهاره الأمعاء المضيف

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...

Analysis of Interactions between Endobiotics and Human Gut Microbiota Using In Vitro Bath Fermentation Systems

تحليل التفاعلات بين بطانة الرحم وميكروبيوتا الأمعاء البشرية باستخدام أنظمة تخمير الحمام في المختبر

Human intestinal microorganisms have recently become an important target of research in promoting human health and preventing diseases. Consequently, ...