Name: co-immunoprecipitation assay for studying functional interactions between receptors and enzymes
Uploaded: 2018-09-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes at JoVE.com

Dette projekt blev finansieret af NIH tilskud 1R01AI125640-01 og reumatologi Research Foundation.

1. Transfektion af celler
<ol><li>Seed HEK 293T celler i tolv 10 cm plader (5 x 106 celler pr. plade) dagen før Transfektion (figur 1). Udføre celle optælling ved hjælp af en hemocytometer. For hver plade, der anvendes 10 mL af DMEM suppleret med 10% FBS og 1% penicillin/streptomycin. Inkuber celler ved 37 ° C i 5% CO2.</li>
	<li>Når cellerne er 80-90% sammenflydende, transfect 5 HEK 293T plader ved hjælp af et lipid-baserede Transfektion reagens med en af de f...

<ol>
	<li>Montor, W. R., Salas, A., Melo, F. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+tyrosine+kinases+and+downstream+pathways+as+druggable+targets+for+cancer+treatment:+the+current+arsenal+of+inhibitors.">Receptor tyrosine kinases and downstream pathways as druggable targets for cancer treatment: the current arsenal of inhibitors.</a> Molecular Cancer. 17 (1), (2018).</li><li>Ngoenkam, J., Schamel, W. W., Pongcharoen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selected+signalling+proteins+recruited+to+the+T-cell+receptor-CD3+complex.">Selected signalling proteins recruited to the T-cell receptor-CD3 complex.</a> Immunology. 153 (1), 42-50 (2018).</li><li>Azoulay-Alfaguter, I., Strazza, M., Pedoeem, A., Mor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+coreceptor+programmed+death+1+inhibits+T-cell+adhesion+by+regulating+Rap1.">The coreceptor programmed death 1 inhibits T-cell adhesion by regulating Rap1.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (2), 564-567 (2015).</li><li>Chemnitz, J. M., Parry, R. V., Nichols, K. E., June, C. H., Riley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHP-1+and+SHP-2+associate+with+immunoreceptor+tyrosine-based+switch+motif+of+programmed+death+1+upon+primary+human+T+cell+stimulation,+but+only+receptor+ligation+prevents+T+cell+activation.">SHP-1 and SHP-2 associate with immunoreceptor tyrosine-based switch motif of programmed death 1 upon primary human T cell stimulation, but only receptor ligation prevents T cell activation.</a> The Journal of Immunology. 173 (2), 945-954 (2004).</li><li>Patsoukis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+effects+of+PD-1+on+Akt+and+Ras+pathways+regulate+molecular+components+of+the+cell+cycle+and+inhibit+T+cell+proliferation.">Selective effects of PD-1 on Akt and Ras pathways regulate molecular components of the cell cycle and inhibit T cell proliferation.</a> Science Signaling. 5 (230), 46 (2012).</li><li>Pentcheva-Hoang, T., Chen, L., Pardoll, D. M., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+death-1+concentration+at+the+immunological+synapse+is+determined+by+ligand+affinity+and+availability.">Programmed death-1 concentration at the immunological synapse is determined by ligand affinity and availability.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (45), (2007).</li><li>Yokosuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+death+1+forms+negative+costimulatory+microclusters+that+directly+inhibit+T+cell+receptor+signaling+by+recruiting+phosphatase+SHP2.">Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2.</a> The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1201-1217 (2012).</li><li>Hui, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+costimulatory+receptor+CD28+is+a+primary+target+for+PD-1-mediated+inhibition.">T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition.</a> Science. 355 (6332), 1428-1433 (2017).</li><li>Sheppard, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+inhibits+T-cell+receptor+induced+phosphorylation+of+the+ZAP70/CD3zeta+signalosome+and+downstream+signaling+to+PKCtheta.">PD-1 inhibits T-cell receptor induced phosphorylation of the ZAP70/CD3zeta signalosome and downstream signaling to PKCtheta.</a> FEBS Letters. 574 (1-3), 37-41 (2004).</li><li>Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+immunoreceptor+inhibits+B+cell+receptor-mediated+signaling+by+recruiting+src+homology+2-domain-containing+tyrosine+phosphatase+2+to+phosphotyrosine.">PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (24), 13866-13871 (2001).</li><li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonism+between+binding+site+affinity+and+conformational+dynamics+tunes+alternative+cis-interactions+within+Shp2.">Antagonism between binding site affinity and conformational dynamics tunes alternative cis-interactions within Shp2.</a> Nature Communications. 4, 2037 (2013).</li><li>Peled, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+purification+mass+spectrometry+analysis+of+PD-1+uncovers+SAP+as+a+new+checkpoint+inhibitor.">Affinity purification mass spectrometry analysis of PD-1 uncovers SAP as a new checkpoint inhibitor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), E468-E477 (2018).</li><li>Jang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protein+tyrosine+phosphatase+inhibitor,+pervanadate,+inhibits+angiotensin+II-Induced+beta-arrestin+cleavage.">A protein tyrosine phosphatase inhibitor, pervanadate, inhibits angiotensin II-Induced beta-arrestin cleavage.</a> Molecules and Cells. 28 (1), 25-30 (2009).</li><li>Pluskey, S., Wandless, T. J., Walsh, C. T., Shoelson, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+stimulation+of+SH-PTP2+phosphatase+activity+by+simultaneous+occupancy+of+both+SH2+domains.">Potent stimulation of SH-PTP2 phosphatase activity by simultaneous occupancy of both SH2 domains.</a> The Journal of Biological Chemistry. 270 (7), 2897-2900 (1995).</li><li>McAvoy, T., Nairn, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serine/threonine+protein+phosphatase+assays.">Serine/threonine protein phosphatase assays.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).</li><li>Shlapatska, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD150+association+with+either+the+SH2-containing+inositol+phosphatase+or+the+SH2-containing+protein+tyrosine+phosphatase+is+regulated+by+the+adaptor+protein+SH2D1A.">CD150 association with either the SH2-containing inositol phosphatase or the SH2-containing protein tyrosine phosphatase is regulated by the adaptor protein SH2D1A.</a> The Journal of Immunology. 166 (9), 5480-5487 (2001).</li></ol>

Receptor-enzym interaktioner er afgørende for intracellulær signalering. Mange enzymer er rekrutteret til receptorer gennem SH2 domæner bindende at fosforyleres tyrosines, at dekorere haler af de samme receptorer. Dog enzymer er ofte foldet ind i lukkede inaktive konformationer, og aktivering kræver en konformationel ændring11 , som kan være medieret af andre domæner af samme receptor. Analysen beskrives her foranstaltninger interaktioner mellem receptorer og enzymer samt aktiviteten induce...

Katalytisk receptorer og receptor tyrosin kinaser er transmembrane proteiner, hvor bindingen af en ekstracellulære ligand forårsager enzymatisk aktivitet på den intracellulære side1. Nogle receptorer besidder både receptor og enzymatiske funktioner, mens andre rekruttere specifikke enzymer kinaser og fosfataser til deres cytoplasmatisk hale. Rekruttering af et enzym til den receptor hale og den efterfølgende katalytiske virkning af dette enzym er to separate processer, der ikke altid er underlagt de samme protein domæner2. Desværre er der ingen særlige værktøjer til at vurdere både interaktion og enzymatisk aktivitet samtidigt. Funktionelle co-immunoprecipitation analysen beskrevet her er en nyttig metode til at dissekere ansættelse af et enzym til halen af en receptor fra sin aktivering. Denne analyse udnytter immunoprecipitation af mærket receptorer af antistof-perler. Efterfølgende udføres både en enzymatisk aktivitet assay og western blot analyse på perler. Det overordnede mål med denne metode er at afdække hvilke protein domæner er nødvendige for interaktioner mellem receptorer og enzymer (vurderet af western blot analyse) og hvilke domæner er obligatorisk for komplet aktivering af enzymer (målt på perle enzymatisk aktivitet assay). Det er væsentligt at udvikle værktøjer til at studere de separate funktioner af receptor-associerede enzymer som følge af deres deltagelse i patogenesen af sygdomme hos mennesker. Desuden kan yderligere forståelse virkningsmekanisme af disse proteiner hjælpe design af nye terapeutiske indgreb.
Programmerede død-1 (PD-1) er en hæmmende receptor på overfladen af T-celler og er nødvendigt for at begrænse overdreven T celle svar. I de seneste år, har anti-PD-1 antistoffer været impliceret i behandling af flere maligniteter1,2. PD-1 ligatur tilbageholder mange T-cellefunktioner, herunder spredning, vedhæftning og sekretion af flere cytokiner3,4,5. PD-1 er lokaliseret til de immunologiske synapse, grænsefladen mellem T-celler og antigen-præsenterer celler6, hvor det colocalizes med T-celle-receptor (TCR)7. Efterfølgende, tyrosin phosphatase SHP2 [Src homologi 2 (SH2) domæne, der indeholder tyrosin phosphatase 2] er rekrutteret til den cytoplasmatisk hale af PD-1, fører til dephosphorylation af centrale tyrosin restkoncentrationer i TCR kompleks og dens tilknyttede proksimale signalering molekyler3,4,5,8,9. Den cytoplasmatisk hale af PD-1 indeholder to tyrosin motiver, en immunoreceptor tyrosin-baserede hæmmende motiv (ITIM) og en immunoreceptor tyrosin baseret switch motiv (ITSM)10. Begge motiver er fosforyleret på PD-1 ligatur9,10. Mutagenese undersøgelser har afsløret en primær rolle for ITSM i SHP2 rekruttering, i modsætning til ITIM, hvis rolle i PD-1 signaling og funktion ikke er klar4.
SHP2 vedtager enten en lukket (foldet), hæmmet kropsbygning eller en åben (extended), aktive kropsbygning11. Bidraget fra hver hale domæne af PD-1 til SHP2 bindende eller aktivisering er endnu ikke klarlagt. For at besvare dette spørgsmål, udviklede vi en analyse, der gør det muligt for paralleltest af ansættelse af SHP2 til halen af PD-1 og dens aktivitet12. Vi ansat co-immunoprecipitation og en på perle fosfatase aktivitet assay at teste både interaktion og enzymatisk aktivitet parallelt. Ved hjælp af denne analyse, viser vi, at ITSM PD-1 er tilstrækkelige til at rekruttere SHP2 til halen af PD-1, mens ITIM PD-1 er nødvendigt at udvide og aktivere enzymet.
Der er mange receptorer, der har flere tilstødende domæner i deres cytoplasmatisk hale. Funktionelle co-immunoprecipitation analysen kan afdække bestemte domæner, der er nødvendige for enten protein ansættelse eller enzymatisk aktivering rolle.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-516F</td>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424-R</td>
			<td>1.5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated FBS</td>
			<td>Denville</td>
			<td>FB5001-H</td>
			<td>Fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin / Streptomycin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP295950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose without L-glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-614F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFect Transfection Reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>301305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SHP2</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;GFP-agarose</td>
			<td>MBL</td>
			<td>D153-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>118144600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Actin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-1616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK-293 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orthovanadate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>216763</td>
			<td>30%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td>EDTA-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC2676</td>
			<td>Modified Laemmli buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% Tris-Glycine Mini Gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>XP04205BOX</td>
			<td>15-well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membranes</td>
			<td>General Electric</td>
			<td>10600004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td>N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1532</td>
			<td>Dithiothreitol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pNPP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>20-106</td>
			<td>p-Nitrophenyl Phosphate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td>Sodium hydroxide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>23225</td>
			<td>Bi Cinchoninic Acid assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

co-immunoprecipitation assay for studying functional interactions between receptors and enzymes

Receptor-associerede enzymer er de store mediatorer af cellulære aktivering. Disse enzymer reguleres, i det mindste i en del, af fysiske interaktion med cytoplasmatisk hale af receptorer. Interaktioner ofte opstår gennem specifikke protein domæner og resultere i aktivering af enzymer. Der er flere metoder til at studere samspillet mellem proteiner. Mens co-immunoprecipitation er almindeligt anvendt til at studere domæner, der er nødvendige for protein-protein interaktioner, er der ingen assays dokumentet bidrag af bestemte domæner til aktiviteten af de rekrutterede enzymer på samme tid. Derfor, metoden beskrevet her kombinerer co-immunoprecipitation og en på perle enzymatisk aktivitet assay for samtidige vurdering af samspillet mellem proteiner og tilknyttede enzymatisk aktivering. Målet med denne protokol er at identificere de domæner, der er kritiske for fysiske samspil mellem et protein og enzym og de domæner, der er obligatorisk for komplet aktivering af enzymet. Betydningen af denne analyse er vist, som visse receptor protein domæner bidrage til binding af enzym til cytoplasmatisk hale af receptoren, mens andre domæner er nødvendigt at regulere funktionen af det samme enzym.

Mens bidrag af ITSM PD-1 til SHP2 bindende er etableret, er rolle af ITIM PD-1 mindre klar. Fordi SHP2 har to SH2 domæner, der kan bindes til to sekventielle phosphotyrosines på PD-1 (ét tyrosin i ITSM) og en anden i ITIM, vi antager, at ITSM PD-1 forankrer SHP2 til PD-1, mens ITIM PD-1 letter SHP2 aktivitet ved at stabilisere sin Åbn konformationelle stat11,14. For at teste dette, udviklede vi en kombineret co-immunoprecipita...

Watch this Scientific Journal Video about Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes at JoVE.com

Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes

Co-immunoprecipitation analyse til at studere funktionel interaktioner mellem receptorer og enzymer

Vi præsenterer her, en protokol for co-immunoprecipitation og en på perle enzymatisk aktivitet assay samtidig undersøge specifikke protein domæner af plasmamembran receptorer for både enzym rekruttering og enzymaktivitet bidrag.

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål i cellesignaleringsområdet, såsom betydningen af forskellige proteindomæner i receptorenzyminteraktion og enzymatisk aktivering. Den største fordel ved denne teknik er, at det giver mulighed for samtidig testning af receptorenzym interaktioner og de funktionelle konsekvenser af denne interaktion på enzymaktiviteten. For hver plade anvendes 10 milliliter DMEM suppleret med 10% FBS og 1% penicillin og streptomycin.Dagen før transfektion, frø menneskelige embryonale nyre 293-T-celler i 12 10-centimeter plader ved hjælp af et hæmocytometer til at tælle cellerne. Inkubere ved 37 grader Celsius i 5%C02. Når cellerne er 80 til 90% sammenløb, skal du bruge et lipidbaseret transfektionsmiddel til at transfect fem af pladerne.Udføres transfektionen efter producentens anvisninger for klæbende celler i 10 centimeter plader. Derefter transfect et identisk andet sæt af fem plader sammen med en ekstra plade tjener som en ikke-transmitteret kontrol til måling af udtrykt protein mængde før immunoprecipation. Inkuber de transficerede plader i en vævskulturinkubator ved 37 grader Celsius i 5% CO2 i 48 timer.Brug et fluorescerende mikroskop til at undersøge cellerne for GFP-udtryk og sikre, at transinfektionen er opstået. Bland 15 mikroliter af 100-millimolar natriumortovanadat med 50 mikroliter på 30% hydrogenperoxid for at forberede en frisk pervanadat blanding. Hvis du vil fosforlate de mærkede versioner af PD-1, skal du fjerne mediet fra de transfrætede CELLER pd-1-GFP.Der tilsættes 10 milliliter almindeligt DMEM og 10 mikroliter pervanadat til hver plade. Inkuberes i mørke ved stuetemperatur i 15 minutter. Herefter vaskes cellerne tre gange i iskold PBS med fem milliliter PBS pr. vask.Under immunoprecipation, bør alle trin udføres enten på is eller ved fire grader Celsius. Suppler lysisbufferen med proteasehæmmere ved at opløse en tablet af inhibitorerne i 10 milliliter buffer. Også tilføje en millimolar natrium orthovanadate til buffer, der vil blive brugt på PD-1-GFP transficerede plader.Der tilsættes 500 mikroliter iskold lysisbuffer til cellerne, og sørg for at tilføje lysisbufferen, der indeholder natriumortovanadatet, til kun de plader, der indeholder PD-1-GFP-transficerede celler. Brug en celleskraber til straks at fjerne og indsamle cellerne fra pladerne. Lysaterne overføres til 1,5 milliliter kolde rør og drej dem ved 0,005 gange tyngdekraften og ved fire grader Celsius i 30 minutter.For at indsamle post-kerner supernatant fra lysates, spin dem ned på 10, 000 gange tyngdekraften og fire grader Celsius i 10 minutter. Overfør supernatanterne i nye rør og kassér pellet. Opbevar supernatanterne i andet sæt af seks plader på is til senere WCL-analyse.For at begynde at forberede anti-GFP perler, forsigtigt ryste flasken indeholder perlerne før åbning for at forhindre afregning. Fjern 40 mikroliter af anti-GFP perler fra gyllen pr hver tilstand. Centrifuge ved 500 gange tyngdekraften og fire grader Celsius i tre minutter.Fjern supernatanten for at vaske perlerne, og sørg for at minimere kontakten mellem pipetten og perlerne for at forhindre tab. Resuspend perlerne i 80 mikroliter lysis buffer pr prøve. Tilsæt de vaskede perler direkte til cellen lysate fra PD-1-GFP-udtryk celler i det første sæt af fire plader.Roter ved 0,005 gange tyngdekraften i 30 minutter ved fire grader Celsius til immunoprecipitat de GFP-mærkede proteiner. Vask perlerne tre gange med en milliliter kold lysis buffer, der ikke indeholder orthovanadate for hver vask. Derefter centrifuge på 2, 500 gange tyngdekraften i 10 sekunder.Opdel lysatet af den aktive SHP2 fra det første sæt plader i tre lige store portioner og tilsæt en del til hver af de tre rør, der indeholder de vaskede PD-1-GFP-holdige perler. Der tilsættes 1/3 af lysatevolumenet fra de ikke-transmittede celler til det andet rør af vildtypen PD-1-GFP perler. Kassér den resterende 2/3.Inkuber perlerne i fire timer ved fire grader Celsius med blid rotation ved 0,005 gange tyngdekraften. Herefter vaskes perlerne to gange med en milliliter kold lysisbuffer for hver vask. Der tilsættes 80 mikroliter lysisbuffer til hver prøve, hvilket sikrer, at det samlede volumen i hvert rør er 100 mikroliter.Ved hjælp af en cut pipette spids, pipette forsigtigt op og ned for at blande. Overfør derefter 50 mikroliter fra hvert rør i to friske, 1,5 milliliterrør. Vask perlerne én gang med fosfatase vask buffer.Fjern derefter supernatanten helt. Tilsæt 100 mikroliter af analyse buffer til perlerne og inkubere ved 30 grader Celsius i 30 minutter under blid omrøring. Når bufferen bliver gul, skal reaktionen afsluttes ved at tilsætte 50 mikroliter af en molæreopløsning af natriumhydroxid.Centrifuge ved 2,500 gange tyngdekraften i 10 sekunder. Derefter overføres supernatanten til to brønde af halvt område i en 96-brønd plade. Læs absorberene ved 405 nanometer og udtrykke resultaterne som relativ optisk tæthed over kontrol wild-type version af PD-1-GFP.Først spin ned perlerne på 2, 000 gange tyngdekraften og fire grader Celsius i 30 sekunder og fjern supernatant. Tilsæt 20 mikroliter af to gange Laemmli buffer og kog ved 95 grader Celsius i fem minutter. Ved hjælp af et BCA-sæt måles proteinkoncentrationen i inputkontrollerne.Overfør 30 mikroliter af den mest fortyndede prøve til et nyt rør. Brug lysisbuffer til at fortynde resten af inputkontrollerne til samme koncentration som den mest fortyndede prøve. Overfør derefter 30 mikroliter af hver af de fortyndede inputkontroller til et nyt rør.Tilføj lige store mængder af to gange Laemmli buffer til lysates og kog dem 95 grader Celsius i fem minutter. Derefter drejer du perlerne ned ved 2,000 gange tyngdekraften og fire grader Celsius i 30 sekunder, før de udfører Western Blot-analyse som beskrevet i tekstprotokollen. I denne undersøgelse udvikles en kombineret co-immunoprecipitation og enzymatisk aktivitetsanalyse til parallel vurdering af receptorenzyminteraktioner og aktivering.Ikke overraskende, SHP2 undladt at binde sig til PD-1, når ITSM blev muteret. Bemærkelsesværdigt, den mutante version af ITIM hæmmet SHP2 bindende kun i begrænset omfang. Ikke desto mindre viser SHP2-fosfataseaktivitetsanalysen, at ITIM og ITSM er lige så uundværlige for enzymatisk aktivitet.Dette afslører en to-trins aktivering model, hvor SHP2 er foldet ind i en autoinhibited kropsbygning under hvileforhold. Ved aktivering af PD-1 rekrutteres SHP2 til den fosforylerede ITSM. ITIM skal imidlertid også fosforyleres for at udfolde SHP2 til sin aktive kropsbygning.Efter dens udvikling, denne teknik kan bane vejen for forskere inden for celle signalering at udforske funktionen af protein domæner i receptor-enzym interaktioner.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes.  The ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

Studere Interaktioner af<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Med Neutrophils ved flowcytometri og Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel<em&gt; In vitro</em&gt; Model for at studere samspillet mellem humant fuldblod og Endothelium

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Afsløring glykogen i perifere mononukleære blodceller med Periodic Acid Schiff Farvning

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Co-immunoudfældning af musen Mx1 Protein med influenza A-virus nukleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Dynamisk friktionskoefficient Assay for den funktionelle analyse af anti-friktion behandlinger i inflammatorisk tarmsygdom

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

Supplerende anvendelse af mikroskopiske teknikker og fluorescens aflæsning i studiet af Cryptococcus-Amoeba interaktioner

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Menneskelige Colonoid encellelag at studere samspillet mellem patogener, latente og vært intestinale epitel

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...

Analysis of Interactions between Endobiotics and Human Gut Microbiota Using In Vitro Bath Fermentation Systems

Analyse af interaktioner mellem Endobiotika og humant tarm mikrobiota ved hjælp af in vitro-bade fermenterings systemer

Human intestinal microorganisms have recently become an important target of research in promoting human health and preventing diseases. Consequently, ...