Name: co-immunoprecipitation assay for studying functional interactions between receptors and enzymes
Uploaded: 2018-09-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes at JoVE.com

Dit project werd gefinancierd door de NIH Grants 1R01AI125640-01 en Reumatologie Research Foundation.

1. de transfectie van cellen
<ol><li>Beënt HEK 293T cellen in twaalf 10 cm platen (5 x 106 cellen per plaat), de dag vóór de transfectie (Figuur 1). De cel tellen met behulp van een hemocytometer uitvoeren Gebruik voor elke plaat, 10 mL van DMEM aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline/streptomycine. Incubeer de cellen bij 37 ° C in 5% CO2.</li>
	<li>Zodra de cellen 80-90% heuvels zijn, transfect 5 HEK 293T platen met behulp van een lipide gebaseerde transfectierea...

<ol>
	<li>Montor, W. R., Salas, A., Melo, F. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+tyrosine+kinases+and+downstream+pathways+as+druggable+targets+for+cancer+treatment:+the+current+arsenal+of+inhibitors.">Receptor tyrosine kinases and downstream pathways as druggable targets for cancer treatment: the current arsenal of inhibitors.</a> Molecular Cancer. 17 (1), (2018).</li><li>Ngoenkam, J., Schamel, W. W., Pongcharoen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selected+signalling+proteins+recruited+to+the+T-cell+receptor-CD3+complex.">Selected signalling proteins recruited to the T-cell receptor-CD3 complex.</a> Immunology. 153 (1), 42-50 (2018).</li><li>Azoulay-Alfaguter, I., Strazza, M., Pedoeem, A., Mor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+coreceptor+programmed+death+1+inhibits+T-cell+adhesion+by+regulating+Rap1.">The coreceptor programmed death 1 inhibits T-cell adhesion by regulating Rap1.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (2), 564-567 (2015).</li><li>Chemnitz, J. M., Parry, R. V., Nichols, K. E., June, C. H., Riley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHP-1+and+SHP-2+associate+with+immunoreceptor+tyrosine-based+switch+motif+of+programmed+death+1+upon+primary+human+T+cell+stimulation,+but+only+receptor+ligation+prevents+T+cell+activation.">SHP-1 and SHP-2 associate with immunoreceptor tyrosine-based switch motif of programmed death 1 upon primary human T cell stimulation, but only receptor ligation prevents T cell activation.</a> The Journal of Immunology. 173 (2), 945-954 (2004).</li><li>Patsoukis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+effects+of+PD-1+on+Akt+and+Ras+pathways+regulate+molecular+components+of+the+cell+cycle+and+inhibit+T+cell+proliferation.">Selective effects of PD-1 on Akt and Ras pathways regulate molecular components of the cell cycle and inhibit T cell proliferation.</a> Science Signaling. 5 (230), 46 (2012).</li><li>Pentcheva-Hoang, T., Chen, L., Pardoll, D. M., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+death-1+concentration+at+the+immunological+synapse+is+determined+by+ligand+affinity+and+availability.">Programmed death-1 concentration at the immunological synapse is determined by ligand affinity and availability.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (45), (2007).</li><li>Yokosuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+death+1+forms+negative+costimulatory+microclusters+that+directly+inhibit+T+cell+receptor+signaling+by+recruiting+phosphatase+SHP2.">Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2.</a> The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1201-1217 (2012).</li><li>Hui, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+costimulatory+receptor+CD28+is+a+primary+target+for+PD-1-mediated+inhibition.">T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition.</a> Science. 355 (6332), 1428-1433 (2017).</li><li>Sheppard, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+inhibits+T-cell+receptor+induced+phosphorylation+of+the+ZAP70/CD3zeta+signalosome+and+downstream+signaling+to+PKCtheta.">PD-1 inhibits T-cell receptor induced phosphorylation of the ZAP70/CD3zeta signalosome and downstream signaling to PKCtheta.</a> FEBS Letters. 574 (1-3), 37-41 (2004).</li><li>Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+immunoreceptor+inhibits+B+cell+receptor-mediated+signaling+by+recruiting+src+homology+2-domain-containing+tyrosine+phosphatase+2+to+phosphotyrosine.">PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (24), 13866-13871 (2001).</li><li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonism+between+binding+site+affinity+and+conformational+dynamics+tunes+alternative+cis-interactions+within+Shp2.">Antagonism between binding site affinity and conformational dynamics tunes alternative cis-interactions within Shp2.</a> Nature Communications. 4, 2037 (2013).</li><li>Peled, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+purification+mass+spectrometry+analysis+of+PD-1+uncovers+SAP+as+a+new+checkpoint+inhibitor.">Affinity purification mass spectrometry analysis of PD-1 uncovers SAP as a new checkpoint inhibitor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), E468-E477 (2018).</li><li>Jang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protein+tyrosine+phosphatase+inhibitor,+pervanadate,+inhibits+angiotensin+II-Induced+beta-arrestin+cleavage.">A protein tyrosine phosphatase inhibitor, pervanadate, inhibits angiotensin II-Induced beta-arrestin cleavage.</a> Molecules and Cells. 28 (1), 25-30 (2009).</li><li>Pluskey, S., Wandless, T. J., Walsh, C. T., Shoelson, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+stimulation+of+SH-PTP2+phosphatase+activity+by+simultaneous+occupancy+of+both+SH2+domains.">Potent stimulation of SH-PTP2 phosphatase activity by simultaneous occupancy of both SH2 domains.</a> The Journal of Biological Chemistry. 270 (7), 2897-2900 (1995).</li><li>McAvoy, T., Nairn, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serine/threonine+protein+phosphatase+assays.">Serine/threonine protein phosphatase assays.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).</li><li>Shlapatska, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD150+association+with+either+the+SH2-containing+inositol+phosphatase+or+the+SH2-containing+protein+tyrosine+phosphatase+is+regulated+by+the+adaptor+protein+SH2D1A.">CD150 association with either the SH2-containing inositol phosphatase or the SH2-containing protein tyrosine phosphatase is regulated by the adaptor protein SH2D1A.</a> The Journal of Immunology. 166 (9), 5480-5487 (2001).</li></ol>

Receptor-enzym interacties zijn van cruciaal belang voor het intracellulaire signalering. Vele enzymen worden gerekruteerd voor receptoren via SH2 domeinen binden aan gefosforyleerd tyrosines dat van de staart van de dezelfde receptoren versieren. Echter enzymen zijn vaak gevouwen in gesloten inactief conformaties en activering vereist een conformationele verandering11 die door andere domeinen van de dezelfde receptor gemedieerde kan worden. Hier beschreven de test maatregelen de interacties tusse...

Katalytische receptoren en receptor tyrosine kinases zijn transmembraan eiwitten waarin binding van een extracellulaire ligand enzymatische activiteit op de intracellulaire kant1 veroorzaakt. Sommige receptoren bezitten zowel de receptor en de enzymatische functies, terwijl anderen specifieke enzymen zoals kinases en phosphatases aan hun cytoplasmatische staarten werven. Aanwerving van een enzym aan de receptor de staart en de daaropvolgende katalytische werking van dit enzym zijn twee afzonderlijke processen die niet altijd door de dezelfde eiwit domeinen2zijn geregeld. Helaas zijn er geen specifieke hulpmiddelen voor het beoordelen van zowel de interactie en de enzymatische activiteit tegelijkertijd. De bepaling van de functionele co-immunoprecipitation hier beschreven is een handige methode om te ontleden de aanwerving van een enzym aan de staart van een receptor van de activering. Deze test maakt gebruik van immunoprecipitation van tagged receptoren door antilichaam beklede kralen. Vervolgens worden een enzymatische activiteit assay zowel de westelijke vlekkenanalyse op parels uitgevoerd. Het algemene doel van deze methode is om te ontdekken welke domeinen eiwitten zijn nodig voor interacties tussen receptoren en enzymen (beoordeeld door westelijke vlekkenanalyse) en welke domeinen zijn verplicht voor volledige activering van de enzymen (gemeten door op-parel enzymatische activiteit assay). Het is belangrijk om instrumenten voor de studie van de afzonderlijke functies van receptor-associated enzymen als gevolg van hun betrokkenheid bij de pathogenese van ziekten bij de mens te ontwikkelen. Bovendien kan verder inzicht in de mechanismen van de actie van deze proteïnen helpen bij het ontwerp van nieuwe therapeutische interventies.
Geprogrammeerde dood-1 (PD-1) is een remmende receptor op het oppervlak van T-cellen en is vereist voor het beperken van excessieve T cel reacties. In de afgelopen jaren zijn anti-PD-1 antilichamen betrokken bij de behandeling van meerdere maligniteiten1,2. PD-1 afbinding weerhoudt talrijke T-cel-functies, met inbegrip van de proliferatie, hechting en secretie van meerdere cytokines3,-4,5. PD-1 is gelokaliseerd aan de immunologische SYNAPS, het raakvlak tussen T-cellen en antigeen-presenteren cellen6, waar het colocalizes met de T-cel-receptor (TCR)7. Vervolgens de tyrosine fosfatase SHP2 [Src homologie 2 (SH2) domein met tyrosine fosfatase 2] is gerekruteerd om de cytoplasmatische staart van PD-1, wat leidt tot dephosphorylation van belangrijke tyrosine residuen binnen de complexe TCR en de bijbehorende proximale signalering moleculen3,4,5,8,9. De cytoplasmatische staart van PD-1 bevat twee tyrosine motieven, een immunoreceptor op basis van tyrosine remmende motief (ITIM) en een immunoreceptor tyrosine gebaseerd-switch motief (ITSM)10. Beide motieven zijn phosphorylated op PD-1 afbinding9,10. Mutagenese studies is gebleken een primaire rol voor de ITSM in SHP2 werving, in tegenstelling tot de ITIM, waarvan de rol in PD-1 signalering en functie niet duidelijk is4.
SHP2 ofwel een gesloten (gevouwen) aanneemt, geremd conformatie of een open (extended), actieve conformatie11. De bijdrage van elk domein van de staart van PD-1 om SHP2 binding of activering is nog niet opgehelderd. Deze vraag te beantwoorden, ontwikkelden we een test waarmee parallelle testen van de aanwerving van SHP2 aan de staart van PD-1 en zijn activiteit12. Wij werkzaam co-immunoprecipitation en een op-kraal fosfatase activiteit assay voor het testen van zowel de interactie en de enzymatische activiteit in parallel. Met behulp van deze bepaling, laten we zien dat de ITSM van PD-1 volstaat om te werven van SHP2 aan de staart voor PD-1, terwijl de ITIM van PD-1 is nodig om volledig uit te breiden en activeren van het enzym.
Er zijn veel receptoren die meerdere aangrenzende domeinen in hun cytoplasmatische staarten hebben. De bepaling van de functionele co-immunoprecipitation kunt ontdekken de rol van specifieke domeinen die nodig voor het eiwit aanwerving of enzymatische activatie zijn.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-516F</td>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424-R</td>
			<td>1.5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated FBS</td>
			<td>Denville</td>
			<td>FB5001-H</td>
			<td>Fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin / Streptomycin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP295950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose without L-glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-614F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFect Transfection Reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>301305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SHP2</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;GFP-agarose</td>
			<td>MBL</td>
			<td>D153-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>118144600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Actin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-1616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK-293 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orthovanadate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>216763</td>
			<td>30%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td>EDTA-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC2676</td>
			<td>Modified Laemmli buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% Tris-Glycine Mini Gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>XP04205BOX</td>
			<td>15-well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membranes</td>
			<td>General Electric</td>
			<td>10600004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td>N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1532</td>
			<td>Dithiothreitol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pNPP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>20-106</td>
			<td>p-Nitrophenyl Phosphate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td>Sodium hydroxide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>23225</td>
			<td>Bi Cinchoninic Acid assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

co-immunoprecipitation assay for studying functional interactions between receptors and enzymes

Receptor-associated enzymen zijn de grote bemiddelaars van cellulaire activering. Deze enzymen zijn geregeld, ten minste gedeeltelijk, fysieke interactie met de cytoplasmatische staarten van de receptoren. De interacties die vaak optreden door middel van specifieke proteïne domeinen en leiden tot activering van de enzymen. Er zijn verschillende methoden om de studie van interacties tussen eiwitten. Hoewel co-immunoprecipitation wordt gebruikt bij het bestuderen van domeinen die vereist voor eiwit-eiwitinteractie zijn, zijn er geen testen dat document de bijdrage van specifieke domeinen naar activiteit van de enzymen van de aangeworven op hetzelfde moment. De hier beschreven methode combineert dienovereenkomstig, co-immunoprecipitation en een enzymatische activiteit op-kraal-assay voor gelijktijdige evaluatie van interacties tussen eiwitten en bijbehorende enzymatische activatie. Het doel van dit protocol is het identificeren van de domeinen die kritisch zijn voor de fysieke interactie tussen een eiwit en enzym en de domeinen die verplicht voor volledige activering van het enzym zijn. Het belang van deze bepaling wordt aangetoond, als bepaalde receptor eiwitten domeinen bijdragen aan de binding van het enzym aan de cytoplasmatische staart van de receptor, terwijl andere domeinen nodig zijn om te regelen van de functie van het zelfde enzym.

Terwijl de bijdrage van de ITSM van PD-1 om SHP2 bindend is gevestigd, is de rol van de ITIM van PD-1 is minder duidelijk. Omdat SHP2 beschikt over twee SH2 domeinen die zich aan twee opeenvolgende phosphotyrosines op PD-1 (één tyrosine in de ITSM) en een ander in de ITIM binden kunnen, we veronderstelde dat de ITSM van PD-1 SHP2 aan PD-1, verankert terwijl de ITIM van PD-1 SHP2 activiteit door het stabiliseren van vergemakkelijkt de Open conformationele staat11<...

Watch this Scientific Journal Video about Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes at JoVE.com

Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes

Co-immunoprecipitation Assay voor het bestuderen van functionele interacties tussen receptoren en enzymen

Hier presenteren we een protocol voor co-immunoprecipitation en een op-kraal enzymatische activiteit assay gelijktijdig het bestuderen van de bijdrage van specifieke proteïne domeinen van plasmamembraan receptoren aan zowel de enzym werving en de enzymactiviteit.

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het gebied van celsignalering, zoals het belang van verschillende eiwitdomeinen in receptorenzyminteractie en enzymatische activering. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het gelijktijdig testen van receptorenzym interacties en de functionele gevolgen van deze interactie op de enzymactiviteit mogelijk maakt. Gebruik voor elke plaat 10 milliliter DMEM aangevuld met 10%FBS en 1%penicilline en streptomycine.De dag voor transfectie, zaad menselijke embryonale nier 293-T cellen in 12 10-centimeter platen met behulp van een hemocytometer om de cellen te tellen. Incubeer bij 37 graden Celsius in 5%C02. Zodra de cellen zijn 80 tot 90%confluent, gebruik maken van een lipide-gebaseerde transfectie agent om vijf van de platen transfecteren.Voer de transfectie uit volgens de instructies van de fabrikant voor hechtingscellen in platen van 10 centimeter. Transfect een identieke tweede set van vijf platen samen met een extra plaat die dient als een niet-onverleidingde controle voor de meting van de uitgedrukte eiwithoeveelheid vóór de immunoprecipitatie. Incubeer de doorgeïnfecteerde platen in een weefselkweek incubator bij 37 graden Celsius in 5%CO2 gedurende 48 uur.Gebruik een fluorescerende microscoop om de cellen te onderzoeken op GFP-expressie en ervoor te zorgen dat de transfectie met succes is opgetreden. Meng 15 microliter van 100-millimolar natriumortovanadate met 50 microliter van 30% waterstofperoxide om een vers pervaniënaatmengsel te bereiden. Als u de getagde versies van PD-1 wilt fosforyleren, verwijdert u de media uit de transfected cellen PD-1-GFP.Voeg 10 milliliter gewone DMEM en 10 microliter pervanadate toe aan elke plaat. Incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Daarna was je de cellen drie keer in ijskoude PBS met vijf milliliter PBS per wasbeurt.Tijdens het uitvoeren van immunoprecipitatie moeten alle stappen worden uitgevoerd op ijs of bij vier graden Celsius. Vul de lysisbuffer aan met proteaseremmers door één tablet van de remmers op te lossen in 10 milliliter buffer. Voeg ook een millimolar natrium orthovanadate toe aan de buffer die zal worden gebruikt op de PD-1-GFP-transfected platen.Voeg 500 microliters ijskoude lysebuffer toe aan de cellen, zorg ervoor dat de lysebuffer met de natriumortovanadate alleen wordt toegevoegd aan de platen die PD-1-GFP-transfected cellen bevatten. Gebruik een celschraper om de cellen onmiddellijk van de platen te verwijderen en op te halen. Breng de lysates in 1,5 milliliter koude buizen en draai ze op 0,005 keer de zwaartekracht en op vier graden Celsius gedurende 30 minuten.Om de post-kernen supernatant van de lysates te verzamelen, draai ze naar beneden op 10,000 keer zwaartekracht en vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Breng de supernatants in nieuwe buizen en gooi de pellet. Bewaar de supernatants voor de tweede set van zes platen op ijs voor latere WCL-analyse.Om te beginnen met het voorbereiden van anti-GFP kralen, schud voorzichtig de fles met de kralen voor het openen om te voorkomen dat de afwikkeling. Verwijder 40 microliter van de anti-GFP kralen uit de drijfmest per aandoening. Centrifuge bij 500 keer zwaartekracht en vier graden Celsius gedurende drie minuten.Verwijder de supernatant om de kralen te wassen, zorg ervoor dat het contact tussen de pipet en de kralen te minimaliseren om verlies te voorkomen. Resuspend de kralen in 80 microliter lysis buffer per monster. Voeg de gewassen kralen direct toe aan de cellysaat van de PD-1-GFP-uitdrukkende cellen van de eerste set van vier platen.Draai bij 0,005 keer zwaartekracht gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius om de GFP-gelabelde eiwitten te immunoprecipitaten. Was de kralen drie keer met behulp van een milliliter koude lyse buffer die geen orthovanadate bevat voor elke wasbeurt. Dan centrifugeren op 2,500 keer zwaartekracht gedurende 10 seconden.Verdeel het lysaat van de actieve SHP2 van de eerste set platen in drie gelijke porties en voeg een deel toe aan elk van de drie buizen met de gewassen PD-1-GFP-bevattende kralen. Voeg 1/3 van het lysaatvolume van de niet-getransfecteerde cellen toe aan de tweede buis van de wild-type PD-1-GFP kralen. Gooi de resterende 2/3 weg.Broed de kralen vier uur lang bij vier graden Celsius met zachte rotatie bij 0,005 keer zwaartekracht. Na deze, was de kralen twee keer met behulp van een milliliter koude lyse buffer voor elke wasbeurt. Voeg 80 microliter lysebuffer toe aan elk monster, zodat het totale volume in elke buis 100 microliters is.Met behulp van een gesneden pipet tip, pipet zachtjes op en neer te mengen. Breng vervolgens 50 microliter van elke buis over in twee, verse, 1,5 milliliter buizen. Was de kralen eenmaal met fosfatase wasbuffer.Verwijder vervolgens de supernatant volledig. Voeg 100 microliter testbuffer toe aan de kralen en broed gedurende 30 minuten bij 30 graden Celsius onder zachte agitatie. Wanneer de buffer geel wordt, beëindigt u de reactie door 50 microliter van één molaire oplossing van natriumhydroxide toe te voegen.Centrifuge bij 2,500 keer zwaartekracht gedurende 10 seconden. Breng hierna de supernatant over in twee putten van het halve gebied in een 96-putplaat. Lees de absorptiesten op 405 nanometer en druk de resultaten uit als relatieve optische dichtheid over de controle wild-type versie van PD-1-GFP.Draai eerst de kralen naar beneden bij 2.000 keer zwaartekracht en vier graden Celsius gedurende 30 seconden en verwijder de supernatant. Voeg 20 microliter van twee keer Laemmli buffer en kook op 95 graden Celsius gedurende vijf minuten. Met behulp van een BCA kit meet u de eiwitconcentratie van de inputcontroles.Breng 30 microliter van het meest verdunde monster over naar een nieuwe buis. Gebruik lysisbuffer om de rest van de inputbesturingselementen te verdunnen tot dezelfde concentratie als het meest verdunde monster. Breng vervolgens 30 microliter van elk van de verdunde inputregelaars over naar een nieuwe buis.Voeg gelijke volumes van twee keer Laemmli buffer aan de lysates en kook ze 95 graden Celsius gedurende vijf minuten. Draai hierna gedurende 30 seconden de kralen op 2.000 keer zwaartekracht en vier graden Celsius af voordat u western blot-analyse uitvoert, zoals beschreven in het tekstprotocol. In deze studie wordt een gecombineerde co-immunoprecipitatie en enzymatische activiteitstest ontwikkeld voor de parallelle beoordeling van receptorenzyminteracties en -activering.Het is dan ook niet verwonderlijk dat SHP2 zich niet aan PD-1 heeft gebonden toen ITSM werd gemuteerd. Opmerkelijk is dat de mutantversie van de ITIM SHP2-binding slechts in beperkte mate remde. Niettemin blijkt uit de SHP2-fosfatase-activiteitstest dat ITIM en ITSM even onmisbaar zijn voor de enzymatische activiteit.Dit onthult een activeringsmodel in twee stappen waarin SHP2 onder rustomstandigheden is opgevouwen tot een autoinhibiteerde conformatie. Na activering van PD-1 wordt SHP2 aangeworven voor het fosforyleerde ITSM. Het ITIM moet echter ook worden gefossyleerd om SHP2 in zijn actieve conformatie te ontvouwen.Na de ontwikkeling ervan kan deze techniek de weg vrijmaken voor onderzoekers op het gebied van celsignalering om de functie van eiwitdomeinen in receptor-enzyminteracties te verkennen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

Een Calcium Bioluminescentie Assay voor functionele analyse van Mosquito ( Aedes aegypti) En Tick ( Rhipicephalus MicroPlus) G eiwit-gekoppelde receptoren

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes.  The ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Monitoring Dendritische cel-migratie met behulp van<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H Magnetic Resonance Imaging

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

Studeren Interacties van<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Met Neutrofielen door flowcytometrie en Time Lapse Microscopie

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel<em&gt; In vitro</em&gt; Model voor het bestuderen van de interactie tussen menselijk volbloed en endotheel

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Detecteren Glycogeen in perifeer bloed mononucleaire cellen met Periodic Acid Schiff kleuring

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Co-immunoprecipitatie van de Muis Mx1 eiwit met het influenza A-virus nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Dynamische wrijvingscoëfficiënt Assay voor de functionele analyse van Anti-adhesie therapieën in ontstekingsdarmziekte

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

Aanvullend gebruik van microscopische technieken en fluorescentie lezen in het bestuderen van interacties Cryptococcus-amoeba

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Menselijke Colonoid Monolayers studie van interacties tussen ziekteverwekkers, Commensals en Host intestinaal epitheel

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...

Analysis of Interactions between Endobiotics and Human Gut Microbiota Using In Vitro Bath Fermentation Systems

Analyse van interacties tussen Endobiotica en humane gut microbiota met behulp van in-vitro Bad fermentatiesystemen

Human intestinal microorganisms have recently become an important target of research in promoting human health and preventing diseases. Consequently, ...