Name: co-immunoprecipitation assay for studying functional interactions between receptors and enzymes
Uploaded: 2018-09-28T15:00:00
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Ce projet a été financé par le NIH subventions 1R01AI125640-01 et la rhumatologie Research Foundation.

1. la transfection de cellules
<ol><li>Les semences des cellules HEK 293 t en douze plaques de 10 cm (5 x 106 cellules / plaque) la veille de la transfection (Figure 1). Effectuer le comptage des cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Pour chaque plaque, utiliser 10 mL de DMEM additionné de 10 % de SVF et 1 % la pénicilline/streptomycine. Incuber les cellules à 37 ° C à 5 % de CO2.</li>
	<li>Une fois que les cellules sont 80 à 90 % anastomosé, transfecter...

<ol>
	<li>Montor, W. R., Salas, A., Melo, F. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+tyrosine+kinases+and+downstream+pathways+as+druggable+targets+for+cancer+treatment:+the+current+arsenal+of+inhibitors.">Receptor tyrosine kinases and downstream pathways as druggable targets for cancer treatment: the current arsenal of inhibitors.</a> Molecular Cancer. 17 (1), (2018).</li><li>Ngoenkam, J., Schamel, W. W., Pongcharoen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selected+signalling+proteins+recruited+to+the+T-cell+receptor-CD3+complex.">Selected signalling proteins recruited to the T-cell receptor-CD3 complex.</a> Immunology. 153 (1), 42-50 (2018).</li><li>Azoulay-Alfaguter, I., Strazza, M., Pedoeem, A., Mor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+coreceptor+programmed+death+1+inhibits+T-cell+adhesion+by+regulating+Rap1.">The coreceptor programmed death 1 inhibits T-cell adhesion by regulating Rap1.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (2), 564-567 (2015).</li><li>Chemnitz, J. M., Parry, R. V., Nichols, K. E., June, C. H., Riley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHP-1+and+SHP-2+associate+with+immunoreceptor+tyrosine-based+switch+motif+of+programmed+death+1+upon+primary+human+T+cell+stimulation,+but+only+receptor+ligation+prevents+T+cell+activation.">SHP-1 and SHP-2 associate with immunoreceptor tyrosine-based switch motif of programmed death 1 upon primary human T cell stimulation, but only receptor ligation prevents T cell activation.</a> The Journal of Immunology. 173 (2), 945-954 (2004).</li><li>Patsoukis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+effects+of+PD-1+on+Akt+and+Ras+pathways+regulate+molecular+components+of+the+cell+cycle+and+inhibit+T+cell+proliferation.">Selective effects of PD-1 on Akt and Ras pathways regulate molecular components of the cell cycle and inhibit T cell proliferation.</a> Science Signaling. 5 (230), 46 (2012).</li><li>Pentcheva-Hoang, T., Chen, L., Pardoll, D. M., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+death-1+concentration+at+the+immunological+synapse+is+determined+by+ligand+affinity+and+availability.">Programmed death-1 concentration at the immunological synapse is determined by ligand affinity and availability.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (45), (2007).</li><li>Yokosuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+death+1+forms+negative+costimulatory+microclusters+that+directly+inhibit+T+cell+receptor+signaling+by+recruiting+phosphatase+SHP2.">Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2.</a> The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1201-1217 (2012).</li><li>Hui, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+costimulatory+receptor+CD28+is+a+primary+target+for+PD-1-mediated+inhibition.">T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition.</a> Science. 355 (6332), 1428-1433 (2017).</li><li>Sheppard, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+inhibits+T-cell+receptor+induced+phosphorylation+of+the+ZAP70/CD3zeta+signalosome+and+downstream+signaling+to+PKCtheta.">PD-1 inhibits T-cell receptor induced phosphorylation of the ZAP70/CD3zeta signalosome and downstream signaling to PKCtheta.</a> FEBS Letters. 574 (1-3), 37-41 (2004).</li><li>Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+immunoreceptor+inhibits+B+cell+receptor-mediated+signaling+by+recruiting+src+homology+2-domain-containing+tyrosine+phosphatase+2+to+phosphotyrosine.">PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (24), 13866-13871 (2001).</li><li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonism+between+binding+site+affinity+and+conformational+dynamics+tunes+alternative+cis-interactions+within+Shp2.">Antagonism between binding site affinity and conformational dynamics tunes alternative cis-interactions within Shp2.</a> Nature Communications. 4, 2037 (2013).</li><li>Peled, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+purification+mass+spectrometry+analysis+of+PD-1+uncovers+SAP+as+a+new+checkpoint+inhibitor.">Affinity purification mass spectrometry analysis of PD-1 uncovers SAP as a new checkpoint inhibitor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), E468-E477 (2018).</li><li>Jang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protein+tyrosine+phosphatase+inhibitor,+pervanadate,+inhibits+angiotensin+II-Induced+beta-arrestin+cleavage.">A protein tyrosine phosphatase inhibitor, pervanadate, inhibits angiotensin II-Induced beta-arrestin cleavage.</a> Molecules and Cells. 28 (1), 25-30 (2009).</li><li>Pluskey, S., Wandless, T. J., Walsh, C. T., Shoelson, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+stimulation+of+SH-PTP2+phosphatase+activity+by+simultaneous+occupancy+of+both+SH2+domains.">Potent stimulation of SH-PTP2 phosphatase activity by simultaneous occupancy of both SH2 domains.</a> The Journal of Biological Chemistry. 270 (7), 2897-2900 (1995).</li><li>McAvoy, T., Nairn, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serine/threonine+protein+phosphatase+assays.">Serine/threonine protein phosphatase assays.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).</li><li>Shlapatska, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD150+association+with+either+the+SH2-containing+inositol+phosphatase+or+the+SH2-containing+protein+tyrosine+phosphatase+is+regulated+by+the+adaptor+protein+SH2D1A.">CD150 association with either the SH2-containing inositol phosphatase or the SH2-containing protein tyrosine phosphatase is regulated by the adaptor protein SH2D1A.</a> The Journal of Immunology. 166 (9), 5480-5487 (2001).</li></ol>

Des interactions de récepteur-enzyme sont cruciales pour la signalisation intracellulaire. De nombreuses enzymes sont recrutés aux récepteurs à travers les domaines SH2 liant à des tyrosines phosphorylés qui décorent les queues des mêmes récepteurs. Cependant, enzymes sont souvent pliés en conformations inactives fermées, et l’activation requiert un changement conformationnel de11 qui peut être médiée par les autres domaines d’un même récepteur. Le test décrit ici mesures les ...

Récepteurs catalytiques et récepteurs tyrosine kinases sont des protéines transmembranaires dont liaison d’un ligand extracellulaire provoque l’activité enzymatique du côté intracellulaire1. Certains récepteurs possèdent les récepteurs et les fonctions enzymatiques, tandis que d’autres recrutent des enzymes spécifiques tels que les kinases et phosphatases à leur queue cytoplasmique. Recrutement d’une enzyme à queue du récepteur et de l’action subséquente catalytique de l’enzyme sont deux processus distincts qui ne sont pas toujours régis par la même protéine domaines2. Malheureusement, il n’y a pas d’outils spécifiques pour évaluer l’interaction et l’activité enzymatique en même temps. L’essai de co-immunoprécipitation fonctionnelle décrite ici est une méthode utile pour disséquer le recrutement d’une enzyme de la queue d’un récepteur de son activation. Ce test utilise immunoprécipitation des récepteurs marqués par perles recouverts d’anticorps. Par la suite, une analyse d’activité enzymatique et analyse par western blot sur perles sont effectuées. L’objectif général de cette méthode consiste à découvrir quels domaines protéiques sont nécessaires pour les interactions entre les récepteurs et les enzymes (évaluées par analyse par western blot) et quels domaines sont obligatoires pour l’activation complète des enzymes (mesurée par sur-perle dosage de l’activité enzymatique). Il est important de développer des outils pour étudier les fonctions distinctes des enzymes associées aux récepteurs en raison de leur implication dans la pathogenèse des maladies humaines. Par ailleurs, mieux comprendre les mécanismes d’action de ces protéines peut aider à la conception de nouvelles interventions thérapeutiques.
1 mort programmée (PD-1) est un récepteur inhibiteur sur la surface des cellules T et est nécessaire pour limiter les lymphocytes T excessive. Ces dernières années, les anticorps anti-PD-1 ont été impliqués dans le traitement de multiples affections malignes1,2. PD-1 ligature retient de nombreuses fonctions des lymphocytes T, y compris la prolifération, adhérence et la sécrétion de plusieurs cytokines3,4,5. PD-1 est localisée à la synapse immunologique, l’interface entre les lymphocytes T et les présentatrices d’antigène des cellules6, où il approche avec les récepteurs des lymphocytes T (TCR)7. Par la suite, la tyrosine-phosphatase SHP2 [homologie Src 2 (SH2) domaine contenant tyrosine-phosphatase 2] est recruté à la queue cytoplasmique de PD-1, conduisant à la déphosphorylation des résidus tyrosine clé au sein du complex TCR et ses associés proximales signalisation des molécules3,4,5,8,9. La queue cytoplasmique de PD-1 contient deux motifs de tyrosine, un motif inhibiteur d’immunoreceptor tyrosine-basé (ITIM) et un immunoreceptor tyrosine motif basé-commutateur (ITSM)10. Les deux motifs sont phosphorylées après ligature de PD-19,10. Études de mutagenèse ont révélé un rôle primordial pour la GSTI SHP2 recrutement, par opposition à l’ITIM, dont le rôle dans la signalisation PD-1 et la fonction n’est pas clair4.
Shp2 adopte soit une fermée (plié), inhibe la conformation ou un ouvert (étendu), conformation active11. La contribution de chaque domaine de queue de PD-1 à SHP2 liaison ou l’activation n’a pas encore été élucidée. Pour répondre à cette question, nous avons développé un test qui permet l’essai parallèle du recrutement de SHP2 à la queue de PD-1 et son activité12. Nous avons utilisé co-immunoprécipitation et un dosage de l’activité de sur-bead phosphatase pour tester l’interaction et l’activité enzymatique en parallèle. À l’aide de ce test, nous montrons que l’ITSM de PD-1 est suffisant pour recruter SHP2 à la queue de PD-1, tandis que l’ITIM de PD-1 est nécessaire pour pleinement s’étendent et activer l’enzyme.
Il n’y a de nombreux récepteurs disposant de plusieurs domaines adjacents dans leurs queues cytoplasmique. Le test fonctionnel co-immunoprécipitation peut découvrir le rôle des domaines spécifiques qui sont nécessaires pour le recrutement de protéines ou activation enzymatique.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-516F</td>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424-R</td>
			<td>1.5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated FBS</td>
			<td>Denville</td>
			<td>FB5001-H</td>
			<td>Fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin / Streptomycin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP295950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose without L-glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-614F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFect Transfection Reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>301305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SHP2</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;GFP-agarose</td>
			<td>MBL</td>
			<td>D153-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>118144600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Actin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-1616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK-293 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orthovanadate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>216763</td>
			<td>30%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td>EDTA-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC2676</td>
			<td>Modified Laemmli buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% Tris-Glycine Mini Gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>XP04205BOX</td>
			<td>15-well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membranes</td>
			<td>General Electric</td>
			<td>10600004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td>N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1532</td>
			<td>Dithiothreitol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pNPP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>20-106</td>
			<td>p-Nitrophenyl Phosphate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td>Sodium hydroxide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>23225</td>
			<td>Bi Cinchoninic Acid assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

co-immunoprecipitation assay for studying functional interactions between receptors and enzymes

Associés aux récepteurs enzymes sont les principaux médiateurs d’activation cellulaire. Ces enzymes sont réglementés, au moins en partie, par des interactions physiques avec des queues cytoplasmique des récepteurs. Souvent, les interactions sont dus à des domaines spécifiques de la protéine et aboutir à l’activation des enzymes. Il existe plusieurs méthodes pour étudier les interactions entre protéines. Tandis que co-immunoprécipitation est couramment utilisée pour étudier des domaines qui sont requises pour les interactions protéine-protéine, il ne sont a aucun tests que la contribution de domaines spécifiques à l’activité des enzymes recrutés en même temps le document. Par conséquent, la méthode décrite ici combine co-immunoprécipitation et un dosage de l’activité enzymatique sur la perle pour l’évaluation simultanée des interactions entre les protéines et l’activation enzymatique associée. Ce protocole vise à identifier les domaines qui sont essentiels pour les interactions physiques entre une protéine et enzymatiques et les domaines qui sont obligatoires pour l’activation complète de l’enzyme. On démontre l’importance de ce test, comme certains récepteurs domaines protéiques contribuent à la liaison de l’enzyme de la queue cytoplasmique du récepteur, tandis que d’autres domaines sont nécessaires pour réguler les fonctions de la même enzyme.

Alors que la contribution de l’ITSM de PD-1 à SHP2 liaison est établie, le rôle de l’ITIM de PD-1 est moins clair. Parce que SHP2 a deux domaines SH2 qui peuvent se lier à deux phosphotyrosines séquentiels sur PD-1 (une tyrosine dans l’ITSM) et l’autre à l’ITIM, nous avons émis l’hypothèse que l’ITSM de PD-1 ancre SHP2 PD-1, tandis que l’ITIM de PD-1 facilite l’activité SHP2 en stabilisant sa Ouvrez l’état conformationnel11,...

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Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes

Co-Immunoprécipitation dosage pour l’étude des Interactions fonctionnelles entre les récepteurs et les Enzymes

Nous présentons ici un protocole pour co-immunoprécipitation et un dosage de l’activité enzymatique sur-perle d’étudier simultanément la contribution de domaines de protéines spécifiques des récepteurs de la membrane plasmique à la fois de recrutement d’enzyme et de l’activité enzymatique.

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la signalisation cellulaire telles que l’importance de différents domaines protéiques dans l’interaction des enzymes réceptifs et l’activation enzymatique. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet des tests concomitants des interactions enzymatiques des récepteurs et les conséquences fonctionnelles de cette interaction sur l’activité enzymatique. Pour chaque plaque, utiliser 10 millilitres de DMEM complétés par 10%FBS et 1% de pénicilline et de streptocotomycine.La veille de la transfection, les cellules embryonnaires embryonnaires de semence 293-T en plaques de 12 10 centimètres à l’aide d’un hémocytomètre pour compter les cellules. Incuber à 37 degrés Celsius en 5%C02. Une fois que les cellules sont 80 à 90% confluent, utilisez un agent de transfection à base de lipides pour transfecter cinq des plaques.Effectuez la transfection en suivant les instructions du fabricant pour les cellules d’adhérence dans des plaques de 10 centimètres. Puis transfect un deuxième ensemble identique de cinq plaques avec une plaque supplémentaire servant de contrôle non transmis pour la mesure de la quantité de protéines exprimées avant l’immunoprécipitation. Incuber les plaques transfectées dans un incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius en 5% de CO2 pendant 48 heures.Utilisez un microscope fluorescent pour examiner les cellules pour l’expression GFP et s’assurer que la transfection a eu lieu avec succès. Mélanger 15 microlitres d’orthovanadate de sodium de 100 millimifères avec 50 microlitres de peroxyde d’hydrogène à 30 % pour préparer un mélange de pervanadate frais. Pour phosphorer les versions marquées de PD-1, retirez les supports des cellules transfectées PD-1-GFP.Ajouter 10 millilitres de DMEM ordinaire et 10 microlitres de pervanadate à chaque assiette. Incuber dans l’obscurité à température ambiante pendant 15 minutes. Après cela, laver les cellules trois fois dans le PBS glacé à l’aide de cinq millilitres de PBS par lavage.Lors de l’immunoprécipice, toutes les étapes doivent être effectuées soit sur la glace ou à quatre degrés Celsius. Complétez le tampon de lyse avec des inhibiteurs de protéase en dissolvant un comprimé des inhibiteurs en 10 millilitres de tampon. Ajoutez également un millimolaire d’orthovanadate de sodium au tampon qui sera utilisé sur les plaques transfectées PD-1-GFP.Ajouter 500 microlitres de tampon de lyse glacée aux cellules, en s’assurant d’ajouter le tampon de lyse contenant l’orthovanadate de sodium aux plaques contenant des cellules transfectées PD-1-GFP. Utilisez un grattoir cellulaire pour retirer et recueillir immédiatement les cellules des plaques. Transférer les lysates dans des tubes froids de 1,5 millilitre et les faire pivoter à 0,005 fois la gravité et à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes.Pour recueillir le supernatant post-noyaux des lysates, faites-les tourner à 10 000 fois la gravité et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Transférer les supernatants dans de nouveaux tubes et jeter la pastille. Conservez les supernatants pour la deuxième série de six plaques sur la glace pour une analyse ultérieure du WCL.Pour commencer à préparer des perles anti-GFP, secouez doucement la bouteille contenant les perles avant de l’ouvrir pour éviter le décantation. Retirez 40 microlitres des perles anti-GFP du lisier par chaque condition. Centrifugeuse à 500 fois la gravité et quatre degrés Celsius pendant trois minutes.Retirer le supernatant pour laver les perles, en s’assurant de minimiser le contact entre la pipette et les perles pour éviter la perte. Resuspendez les perles dans 80 microlitres de tampon de lyse par échantillon. Ajouter les perles lavées directement à la cellule lysate à partir des cellules d’expression PD-1-GFP de la première série de quatre plaques.Tournez à 0,005 fois la gravité pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius pour immunoprécipifier les protéines étiquetées GFP. Lavez les perles trois fois à l’aide d’un millilitre de tampon de lyse froide qui ne contient pas d’orthovanadate pour chaque lavage. Puis centrifugeuse à 2500 fois la gravité pendant 10 secondes.Diviser le lysate du SHP2 actif à partir du premier ensemble de plaques en trois portions égales et ajouter une partie à chacun des trois tubes contenant les perles lavées PD-1-GFP contenant. Ajouter 1/3 du volume de lysate des cellules non infectées au deuxième tube des perles PD-1-GFP de type sauvage. Jetez les 2/3 restants.Incuber les perles pendant quatre heures à quatre degrés Celsius avec rotation douce à 0,005 fois la gravité. Après cela, lavez les perles deux fois à l’aide d’un millilitre de tampon de lyse froide pour chaque lavage. Ajouter 80 microlitres de tampon de lyse à chaque échantillon, en veillant à ce que le volume total dans chaque tube soit de 100 microlitres.À l’aide d’une pointe de pipette coupée, pipette doucement de haut en bas pour mélanger. Transférer ensuite 50 microlitres de chaque tube en deux tubes frais de 1,5 millilitre. Lavez les perles une fois avec le tampon de lavage de phosphatase.Retirez ensuite complètement le surnatant. Ajouter 100 microlitres de tampon d’essai aux perles et incuber à 30 degrés Celsius pendant 30 minutes sous une douce agitation. Lorsque le tampon devient jaune, mettre fin à la réaction en ajoutant 50 microlitres d’une solution molaire d’hydroxyde de sodium.Centrifugeuse à 2500 fois la gravité pendant 10 secondes. Après cela, transférer le supernatant dans deux puits de demi-zone dans une plaque de 96 puits. Lisez les absorbants à 405 nanomètres et exprimez les résultats comme densité optique relative sur la version de type sauvage de contrôle de PD-1-GFP.Faites d’abord tourner les perles à 2000 fois la gravité et quatre degrés Celsius pendant 30 secondes et retirez le supernatant. Ajouter 20 microlitres de deux fois tampon Laemmli et faire bouillir à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes. À l’aide d’un kit BCA, mesurer la concentration en protéines des contrôles d’entrée.Transférer 30 microlitres de l’échantillon le plus dilué dans un nouveau tube. Utilisez le tampon de lyse pour diluer le reste des contrôles d’entrée à la même concentration que l’échantillon le plus dilué. Transférez ensuite 30 microlitres de chacune des commandes d’entrée diluées vers un nouveau tube.Ajouter des volumes égaux de deux fois tampon Laemmli aux lysates et les faire bouillir 95 degrés Celsius pendant cinq minutes. Après cela, faites tourner les perles à 2000 fois la gravité et quatre degrés Celsius pendant 30 secondes avant d’effectuer l’analyse de tache occidentale telle que décrite dans le protocole de texte. Dans cette étude, une co-immunoprécipitation combinée et un essai d’activité enzymatique sont développés pour l’évaluation parallèle des interactions et de l’activation des enzymes réceptifs.Sans surprise, SHP2 n’a pas réussi à se lier à PD-1 lorsque l’ITSM a été muté. Remarquablement, la version mutante de l’ITIM inhibait la liaison SHP2 seulement dans une mesure limitée. Néanmoins, l’analyse d’activité SHP2-phosphatase révèle que l’ITIM et l’ITSM sont tout aussi indispensables pour l’activité enzymatique.Ceci indique un modèle d’activation en deux étapes dans lequel SHP2 est plié dans une conformation autoinhibited dans des conditions de repos. Lors de l’activation du PD-1, SHP2 est recruté à l’ITSM phosphorylated. Toutefois, l’ITIM doit également être phosphorylatée pour déployer SHP2 dans sa conformation active.Après son développement, cette technique peut ouvrir la voie à des chercheurs dans le domaine de la signalisation cellulaire pour explorer la fonction des domaines protéiques dans les interactions récepteurs-enzymes.

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Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Co-immunoprécipitation de la protéine souris Mx1 avec le virus Influenza A nucléoprotéine

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Dosage d’adhérence dynamiques pour l’analyse fonctionnelle des thérapies contre les adhérences dans la maladie intestinale inflammatoire

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

Utilisation complémentaire des techniques microscopiques et de la lecture de fluorescence dans l'étude des interactions Cryptococcus-Amoeba

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Monocouches de Colonoid humain pour étudier les Interactions entre les pathogènes, germes commensaux et hôte épithélium Intestinal

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...

Analysis of Interactions between Endobiotics and Human Gut Microbiota Using In Vitro Bath Fermentation Systems

Analyse des interactions entre les endobiotiques et le microbiote intestinal humain à l'aide de systèmes de fermentation in vitro de bain

Human intestinal microorganisms have recently become an important target of research in promoting human health and preventing diseases. Consequently, ...