Name: co-immunoprecipitation assay for studying functional interactions between receptors and enzymes
Uploaded: 2018-09-28T15:00:00
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Dieses Projekt wurde von NIH-Stipendien 1R01AI125640-01 und der Rheumatologie Research Foundation finanziert.

1. die Transfektion von Zellen
<ol><li>Samen Sie HEK 293T Zellen in zwölf 10 cm Teller (5 x 106 Zellen pro Platte) am Vortag Transfektion (Abbildung 1). Führen Sie die Zellzählung mit einem Hemocytometer. Verwenden Sie für jede Platte 10 mL DMEM mit 10 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin ergänzt. Inkubation der Zellen bei 37 ° C in 5 % CO2.</li>
	<li>Sobald die Zellen 80-90 % Zusammenfluss sind, transfizieren 5 HEK 293T Platten mit einem Lipid-basierte Transfe...

<ol>
	<li>Montor, W. R., Salas, A., Melo, F. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+tyrosine+kinases+and+downstream+pathways+as+druggable+targets+for+cancer+treatment:+the+current+arsenal+of+inhibitors.">Receptor tyrosine kinases and downstream pathways as druggable targets for cancer treatment: the current arsenal of inhibitors.</a> Molecular Cancer. 17 (1), (2018).</li><li>Ngoenkam, J., Schamel, W. W., Pongcharoen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selected+signalling+proteins+recruited+to+the+T-cell+receptor-CD3+complex.">Selected signalling proteins recruited to the T-cell receptor-CD3 complex.</a> Immunology. 153 (1), 42-50 (2018).</li><li>Azoulay-Alfaguter, I., Strazza, M., Pedoeem, A., Mor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+coreceptor+programmed+death+1+inhibits+T-cell+adhesion+by+regulating+Rap1.">The coreceptor programmed death 1 inhibits T-cell adhesion by regulating Rap1.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (2), 564-567 (2015).</li><li>Chemnitz, J. M., Parry, R. V., Nichols, K. E., June, C. H., Riley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHP-1+and+SHP-2+associate+with+immunoreceptor+tyrosine-based+switch+motif+of+programmed+death+1+upon+primary+human+T+cell+stimulation,+but+only+receptor+ligation+prevents+T+cell+activation.">SHP-1 and SHP-2 associate with immunoreceptor tyrosine-based switch motif of programmed death 1 upon primary human T cell stimulation, but only receptor ligation prevents T cell activation.</a> The Journal of Immunology. 173 (2), 945-954 (2004).</li><li>Patsoukis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+effects+of+PD-1+on+Akt+and+Ras+pathways+regulate+molecular+components+of+the+cell+cycle+and+inhibit+T+cell+proliferation.">Selective effects of PD-1 on Akt and Ras pathways regulate molecular components of the cell cycle and inhibit T cell proliferation.</a> Science Signaling. 5 (230), 46 (2012).</li><li>Pentcheva-Hoang, T., Chen, L., Pardoll, D. M., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+death-1+concentration+at+the+immunological+synapse+is+determined+by+ligand+affinity+and+availability.">Programmed death-1 concentration at the immunological synapse is determined by ligand affinity and availability.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (45), (2007).</li><li>Yokosuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+death+1+forms+negative+costimulatory+microclusters+that+directly+inhibit+T+cell+receptor+signaling+by+recruiting+phosphatase+SHP2.">Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2.</a> The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1201-1217 (2012).</li><li>Hui, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+costimulatory+receptor+CD28+is+a+primary+target+for+PD-1-mediated+inhibition.">T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition.</a> Science. 355 (6332), 1428-1433 (2017).</li><li>Sheppard, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+inhibits+T-cell+receptor+induced+phosphorylation+of+the+ZAP70/CD3zeta+signalosome+and+downstream+signaling+to+PKCtheta.">PD-1 inhibits T-cell receptor induced phosphorylation of the ZAP70/CD3zeta signalosome and downstream signaling to PKCtheta.</a> FEBS Letters. 574 (1-3), 37-41 (2004).</li><li>Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+immunoreceptor+inhibits+B+cell+receptor-mediated+signaling+by+recruiting+src+homology+2-domain-containing+tyrosine+phosphatase+2+to+phosphotyrosine.">PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (24), 13866-13871 (2001).</li><li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonism+between+binding+site+affinity+and+conformational+dynamics+tunes+alternative+cis-interactions+within+Shp2.">Antagonism between binding site affinity and conformational dynamics tunes alternative cis-interactions within Shp2.</a> Nature Communications. 4, 2037 (2013).</li><li>Peled, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+purification+mass+spectrometry+analysis+of+PD-1+uncovers+SAP+as+a+new+checkpoint+inhibitor.">Affinity purification mass spectrometry analysis of PD-1 uncovers SAP as a new checkpoint inhibitor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), E468-E477 (2018).</li><li>Jang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protein+tyrosine+phosphatase+inhibitor,+pervanadate,+inhibits+angiotensin+II-Induced+beta-arrestin+cleavage.">A protein tyrosine phosphatase inhibitor, pervanadate, inhibits angiotensin II-Induced beta-arrestin cleavage.</a> Molecules and Cells. 28 (1), 25-30 (2009).</li><li>Pluskey, S., Wandless, T. J., Walsh, C. T., Shoelson, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+stimulation+of+SH-PTP2+phosphatase+activity+by+simultaneous+occupancy+of+both+SH2+domains.">Potent stimulation of SH-PTP2 phosphatase activity by simultaneous occupancy of both SH2 domains.</a> The Journal of Biological Chemistry. 270 (7), 2897-2900 (1995).</li><li>McAvoy, T., Nairn, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serine/threonine+protein+phosphatase+assays.">Serine/threonine protein phosphatase assays.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).</li><li>Shlapatska, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD150+association+with+either+the+SH2-containing+inositol+phosphatase+or+the+SH2-containing+protein+tyrosine+phosphatase+is+regulated+by+the+adaptor+protein+SH2D1A.">CD150 association with either the SH2-containing inositol phosphatase or the SH2-containing protein tyrosine phosphatase is regulated by the adaptor protein SH2D1A.</a> The Journal of Immunology. 166 (9), 5480-5487 (2001).</li></ol>

Rezeptor-Enzym Interaktionen sind entscheidend für die intrazelluläre Signalisierung. Viele Enzyme werden rekrutiert, an Rezeptoren durch SH2-Domänen binden an phosphorylierten Tyrosines, die Enden von den gleichen Rezeptoren zu schmücken. Jedoch Enzyme sind oft in geschlossenen inaktive Konformationen gefaltet und Aktivierung erfordert eine Konformationsänderung11 , die von anderen Domänen die gleichen Rezeptor vermittelt werden können. Der Test beschriebenen hier Maßnahmen, die die Wechs...

Katalytische Rezeptoren und Rezeptor-Tyrosin-Kinasen sind transmembrane Proteine in die Bindung eines extrazellulären Liganden enzymatische Aktivität auf die intrazelluläre Seite1verursacht. Einige Rezeptoren besitzen Rezeptor und enzymatische Funktionen, während andere spezifische Enzyme wie Kinasen und Phosphatasen zu ihre cytoplasmatischen Tails zu rekrutieren. Rekrutierung eines Enzyms an den Rezeptor Tail und die anschließende katalytische Wirkung dieses Enzyms sind zwei separate Prozesse, die nicht immer von der gleichen Protein Domänen2geregelt sind. Leider gibt es keine spezifische Werkzeuge, um das Zusammenspiel und die enzymatische Aktivität gleichzeitig zu beurteilen. Hier beschriebenen funktionellen co-Immunopräzipitation-Assay ist eine nützliche Methode, um die Rekrutierung eines Enzyms am Schwanz eines Rezeptors aus seiner Aktivierung zu sezieren. Dieser Assay nutzt Immunopräzipitation tagged Rezeptoren durch Antikörper-beschichtete Perlen. Anschließend erfolgt eine enzymatische Aktivität Assay und western-Blot-Analyse auf Perlen. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist zu entdecken, welche Protein-Domains für Interaktionen zwischen Rezeptoren und Enzymen (bewertet von western-Blot Analyse) notwendig sind und welche Domains sind verbindlich für die vollständige Aktivierung der Enzyme (gemessen am Wulst enzymatische Aktivität Assay). Es ist bezeichnend, Werkzeuge für das Studium der getrennten Funktionen der Rezeptor-assoziierten Enzyme aufgrund ihrer Beteiligung an der Pathogenese von Krankheiten des Menschen zu entwickeln. Weitere Verständnis der Wirkmechanismen dieser Proteine kann darüber hinaus die Gestaltung der neue therapeutische Interventionen helfen.
Programmierten Tod-1 (PD-1) ist eine inhibitorische Rezeptor auf der Oberfläche von T-Zellen und ist erforderlich für die Begrenzung der übermäßige T-Zell-Reaktionen. In den letzten Jahren haben Anti-PD-1 Antikörper bei der Behandlung von mehreren Malignome1,2verwickelt. PD-1 Ligatur hemmt zahlreiche T-Zell-Funktionen, einschließlich der Proliferation, Haftung und Sekretion von mehrere Zytokine3,4,5. PD-1 ist auf der immunologischen Synapse, die Schnittstelle zwischen T-Zellen und Antigen-präsentierenden Zellen6, lokalisiert, wo es mit dem T-Zell-Rezeptor (TCR)7colocalizes. Anschließend die Tyrosin-Phosphatase SHP2 [Src Homologie 2 (SH2) Domäne mit Tyrosin Phosphatase 2] wird der cytoplasmatischen Schwanz des PD-1, führt zu wichtigen Tyrosin Rückstände innerhalb der TCR komplex und die damit verbundenen proximalen dephosphorylation rekrutiert Signalisierung Moleküle3,4,5,8,9. Die zytoplasmatischen Schweif von PD-1 enthält zwei Tyrosin Motive, ein Immunoreceptor Tyrosin-basierte hemmenden Motiv (ITIM) und eine Immunoreceptor Tyrosin basierend-Schalter Motiv (ITSM)10. Beide Motive sind auf PD-1 Ligatur9,10phosphoryliert. Mutagenese Studien ergaben eine primäre Rolle für die ITSM im SHP2 Einstellung, im Gegensatz zu den ITIM, deren Rolle in der PD-1 Signal- und Funktion nicht klar ist4.
SHP2 nimmt entweder eine geschlossene (gefaltet), Konformation oder eine offene (verlängert), aktive Konformation11gehemmt. Der Beitrag der jeweiligen Tail-Domäne von PD-1 SHP2 Bindung oder Aktivierung ist noch nicht aufgeklärt. Um diese Frage zu beantworten, haben wir eine Probe, die es ermöglicht parallele Prüfung der Einstellung von SHP2 am Schwanz des PD-1 und seine Aktivität12entwickelt. Wir Beschäftigten co-Immunopräzipitation und eine auf Perle Phosphatase Aktivität Assay, das Zusammenspiel und die Enzymaktivität parallel zu testen. Mit Hilfe dieser Assay, zeigen wir, dass die ITSM PD-1 ausreichend ist, um SHP2 am Schwanz des PD-1, während die ITIM PD-1 erforderlich ist, um vollständig zu erweitern und aktivieren das Enzym zu rekrutieren.
Es gibt viele Rezeptoren, die einige angrenzende Gebiete in den zytoplasmatischen Schwänzen haben. Die funktionale co-Immunopräzipitation-Assay kann die Rolle von bestimmten Domänen aufzudecken, die für Protein Rekrutierung oder enzymatische Aktivierung notwendig sind.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-516F</td>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424-R</td>
			<td>1.5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated FBS</td>
			<td>Denville</td>
			<td>FB5001-H</td>
			<td>Fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin / Streptomycin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP295950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose without L-glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-614F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFect Transfection Reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>301305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SHP2</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;GFP-agarose</td>
			<td>MBL</td>
			<td>D153-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>118144600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Actin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-1616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK-293 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orthovanadate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>216763</td>
			<td>30%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td>EDTA-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC2676</td>
			<td>Modified Laemmli buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% Tris-Glycine Mini Gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>XP04205BOX</td>
			<td>15-well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membranes</td>
			<td>General Electric</td>
			<td>10600004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td>N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1532</td>
			<td>Dithiothreitol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pNPP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>20-106</td>
			<td>p-Nitrophenyl Phosphate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td>Sodium hydroxide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>23225</td>
			<td>Bi Cinchoninic Acid assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

co-immunoprecipitation assay for studying functional interactions between receptors and enzymes

Rezeptor-assoziierten Enzyme sind die wichtigsten Vermittler der zellulären Aktivierung. Diese Enzyme sind mindestens im Teil, durch die physikalischen Wechselwirkungen mit zytoplasmatischen Schwänzen der Rezeptoren geregelt. Die Interaktionen oft durch spezifisches Protein Domänen auftreten und Aktivierung der Enzyme führen. Es gibt mehrere Methoden, um Interaktionen zwischen Proteinen zu untersuchen. Während co-Immunopräzipitation häufig verwendet, um Domänen zu studieren, die für Protein-Protein-Wechselwirkungen erforderlich sind, gibt es keine Tests dieses Dokument den Beitrag von bestimmten Domänen zur Aktivität der rekrutierten Enzyme zur gleichen Zeit. Die hier beschriebene Methode kombiniert dementsprechend co-Immunopräzipitation und eine enzymatische Aktivität auf Perle-Assay für simultane Auswertung der Wechselwirkungen zwischen Proteinen und damit verbundenen enzymatische Aktivierung. Das Ziel dieses Protokolls ist, die Domains zu identifizieren, die sind entscheidend für die physikalischen Wechselwirkungen zwischen Protein und Enzym und Domänen, die für die vollständige Aktivierung des Enzyms obligatorisch sind. Die Bedeutung des Assays gezeigt, als bestimmten Rezeptor Protein Domänen dazu beitragen, die Bindung des Enzyms der cytoplasmatischen Schwanz des Rezeptors, während andere Bereiche sind notwendig, um die Funktion des gleichen Enzyms zu regulieren.

Der Beitrag von ITSM PD-1 SHP2 Bindung festgelegt ist, ist die Rolle von ITIM PD-1 weniger klar. Da SHP2 zwei SH2-Domänen, die an zwei sequentielle Phosphotyrosines PD-1 (ein Tyrosin in den ITSM) und ein weiteres in der ITIM binden können verfügt, wir vermutet, dass die ITSM PD-1 SHP2 PD-1, Anker während die ITIM PD-1 SHP2 Aktivität durch die Stabilisierung erleichtert der Öffnen Sie conformational Zustand11,14. Um dies zu t...

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Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes

Co-Immunopräzipitation Test zur Untersuchung funktionalen Wechselwirkungen zwischen Rezeptoren und Enzymen

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für co-Immunopräzipitation und eine enzymatische Aktivität auf Perle Assay, den Beitrag der spezifischen Proteins Domänen der Plasmamembran Rezeptoren Enzym Rekrutierung und Enzym-Aktivität gleichzeitig zu studieren.

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Zellsignalbereich zu beantworten, wie z. B. die Bedeutung verschiedener Proteindomänen in der Interaktion mit Rezeptorenzymen und der enzymatischen Aktivierung. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie gleichzeitige Tests von Rezeptorenzym-Wechselwirkungen und die funktionellen Folgen dieser Wechselwirkung auf die Enzymaktivität ermöglicht. Verwenden Sie für jede Platte 10 Milliliter DMEM, ergänzt mit 10%FBS und 1%penicillin und Streptomycin.Am Tag vor der Transfektion samen menschliche embryonale Niere 293-T-Zellen in 12 10-Zentimeter-Platten mit einem Hämozytometer, um die Zellen zu zählen. Inkubieren Bei 37 Grad Celsius in 5%C02. Sobald die Zellen 80 bis 90 % konfluent sind, verwenden Sie ein lipidbasiertes Transfektionsmittel, um fünf der Platten zu transfekieren.Führen Sie die Transfektion gemäß den Anweisungen des Herstellers für Haftzellen in 10-Zentimeter-Platten durch. Dann transfezieren Sie einen identischen zweiten Satz von fünf Platten zusammen mit einer zusätzlichen Platte, die als nicht transfizierte Kontrolle für die Messung der exprimierten Proteinmenge vor der Immunpräzipitation dient. Inkubieren Sie die transfizierten Platten in einem Gewebekultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius in 5% CO2 für 48 Stunden.Verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop, um die Zellen auf GFP-Expression zu untersuchen und sicherzustellen, dass die Transfektion erfolgreich stattgefunden hat. Mischen Sie 15 Mikroliter 100-Millimolar-Natriumorthovanadate mit 50 Mikroliter n.B. 30% Wasserstoffperoxid, um ein frisches Pervanadate-Gemisch herzustellen. Um die markierten Versionen von PD-1 zu phosphorylieren, entfernen Sie das Medium aus den transfizierten PD-1-GFP-Zellen.Fügen Sie 10 Milliliter reines DMEM und 10 Mikroliter Pervanadate zu jeder Platte hinzu. Inkubieren Sie im Dunkeln bei Raumtemperatur für 15 Minuten. Danach die Zellen dreimal in eiskaltem PBS mit fünf Millilitern PBS pro Waschgang waschen.Bei der Durchführung der Immunpräzipitation sollten alle Schritte entweder auf Eis oder bei vier Grad Celsius durchgeführt werden. Ergänzen Sie den Lysepuffer mit Proteasehemmern, indem Sie eine Tablette der Inhibitoren in 10 Milliliter Puffer auflösen. Fügen Sie dem Puffer, der auf den PD-1-GFP-transfizierten Platten verwendet wird, auch ein Millimolar Natriumorthovanadate hinzu.Fügen Sie den Zellen 500 Mikroliter eiskalteLysepuffer hinzu, um den Lysepuffer, der das Natriumorthovanadate enthält, nur den Platten hinzuzufügen, die PD-1-GFP-transfizierte Zellen enthalten. Verwenden Sie einen Zellschaber, um die Zellen sofort zu entfernen und von den Platten zu sammeln. Die Lysate in 1,5-Milliliter-Kaltrohre geben und 30 Minuten lang bei 0,005-facher Schwerkraft und bei vier Grad Celsius drehen.Um den Post-Nuklei-Überstand aus den Lysaten zu sammeln, drehen Sie sie bei 10.000-facher Schwerkraft und vier Grad Celsius für 10 Minuten. Übertragen Sie die Überräube in neue Schläuche und entsorgen Sie das Pellet. Bewahren Sie die Überräube für den zweiten Satz von sechs Platten auf Eis für die spätere WCL-Analyse auf.Um mit der Vorbereitung von Anti-GFP-Perlen zu beginnen, schütteln Sie die Flasche mit den Perlen vor dem Öffnen vorsichtig, um eine Absetzung zu verhindern. Entfernen Sie 40 Mikroliter der Anti-GFP-Perlen aus der Gülle pro Zustand. Zentrifuge bei 500-facher Schwerkraft und vier Grad Celsius für drei Minuten.Entfernen Sie den Überstand, um die Perlen zu waschen, und stellen Sie sicher, dass der Kontakt zwischen der Pipette und den Perlen minimiert wird, um Verlust zu vermeiden. Resuspend ieren die Perlen in 80 Mikroliter Lysepuffer pro Probe. Fügen Sie die gewaschenen Perlen direkt in das Zelllysat aus den PD-1-GFP-exemitten Zellen des ersten Satzes von vier Platten hinzu.Drehen Sie bei 0,005-facher Schwerkraft 30 Minuten bei vier Grad Celsius, um die GFP-markierten Proteine zu immunisieren. Waschen Sie die Perlen dreimal mit einem Milliliter Kaltlysepuffer, der kein Orthovanadate für jede Wäsche enthält. Dann Zentrifuge bei 2, 500 mal Schwerkraft für 10 Sekunden.Teilen Sie das Lysat des aktiven SHP2 aus dem ersten Satz der Platten in drei gleiche Portionen und fügen Sie jedem der drei Rohre, die die gewaschenen PD-1-GFP-haltigen Perlen enthalten, einen Teil hinzu. Fügen Sie 1/3 des Lysatvolumens aus den nicht transfizierten Zellen in die zweite Röhre der Wildtyp-, PD-1-GFP-Perlen. Entsorgen Sie die restlichen 2/3.Bebrüte die Perlen vier Stunden lang bei vier Grad Celsius mit sanfter Rotation bei 0,005-facher Schwerkraft. Danach die Perlen zweimal mit einem Milliliter Kaltlysepuffer für jede Wäsche waschen. Fügen Sie 80 Mikroliter Lysepuffer zu jeder Probe hinzu, um sicherzustellen, dass das Gesamtvolumen in jedem Rohr 100 Mikroliter beträgt.Mit einer geschnittenen Pipettenspitze, Pipette sanft nach oben und unten zu mischen. Dann 50 Mikroliter aus jedem Rohr in zwei, frische, 1,5 Milliliter Röhren übertragen. Waschen Sie die Perlen einmal mit Phosphatase-Waschpuffer.Entfernen Sie dann den Überstand vollständig. Fügen Sie 100 Mikroliter Assaypuffer zu den Perlen hinzu und brüten bei 30 Grad Celsius 30 Minuten lang unter sanfter Erregung. Wenn der Puffer gelb wird, beenden Sie die Reaktion, indem Sie 50 Mikroliter einer Mollösung Natriumhydroxid hinzufügen.Zentrifuge bei 2, 500-mal Schwerkraft für 10 Sekunden. Danach den Überstand in zwei Brunnen der halben Fläche in einer 96-Well-Platte übertragen. Lesen Sie die Absorptionsstoffe bei 405 Nanometern und drücken Sie die Ergebnisse als relative optische Dichte über die Kontroll-Wild-Typ-Version von PD-1-GFP aus.Drehen Sie zuerst die Perlen bei 2.000 Mal Schwerkraft und vier Grad Celsius für 30 Sekunden und entfernen Sie den Überstand. 20 Mikroliter des zweifachen Laemmli-Puffers hinzufügen und bei 95 Grad Celsius fünf Minuten kochen. Messen Sie mit einem BCA-Kit die Proteinkonzentration der Eingangskontrollen.Übertragen Sie 30 Mikroliter der am häufigsten verdünnten Probe in ein neues Rohr. Verwenden Sie den Lysepuffer, um den Rest der Eingabesteuerungen auf die gleiche Konzentration wie die am häufigsten verdünnte Probe zu verdünnen. Dann übertragen Sie 30 Mikroliter jeder der verdünnten Eingangssteuerungen in ein neues Rohr.Fügen Sie den Lysaten gleiche Volumina von zwei Mal Laemmli-Puffer hinzu und kochen Sie sie fünf Minuten lang um 95 Grad Celsius. Danach drehen Sie die Perlen bei 2.000-facher Schwerkraft und vier Grad Celsius für 30 Sekunden, bevor Sie western Blot-Analysen durchführen, wie im Textprotokoll beschrieben. In dieser Studie wird ein kombinierter Co-Immunpräzipations- und enzymatischer Aktivitätstest für die parallele Bewertung von Rezeptorenzym-Wechselwirkungen und -Aktivierung entwickelt.Es überrascht nicht, dass SHP2 nicht an PD-1 gebunden werden konnte, als ITSM mutierte. Bemerkenswerterweise hemmte die mutierte Version der ITIM die SHP2-Bindung nur bedingt. Dennoch zeigt der SHP2-Phosphatase-Aktivitätstest, dass ITIM und ITSM für die enzymatische Aktivität gleichermaßen unverzichtbar sind.Dies zeigt ein zweistufiges Aktivierungsmodell, bei dem SHP2 unter Ruhebedingungen in eine autohemmte Konformation gefaltet wird. Nach Aktivierung von PD-1 wird SHP2 an das phosphorylierte ITSM rekrutiert. Das ITIM muss jedoch auch phosphoryliert werden, um SHP2 in seine aktive Konformation zu entfalten.Nach seiner Entwicklung kann diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Zellsignalisierung ebnen, um die Funktion von Proteindomänen in Rezeptor-Enzym-Wechselwirkungen zu erforschen.

Research

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Erkennen von Glykogen in peripheren mononukleären Blutzellen mit Perjodsäure-Schiff-Färbung

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Co-Immunopräzipitation der Maus Mx1 Protein mit dem Influenza A Virus Nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Dynamische Adhäsion Assay für die funktionelle Analyse von Anti-Adhäsion Therapien bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

Komplementärer Einsatz von mikroskopischen Techniken und Fluoreszenzlesen beim Studium von Cryptococcus-Amoeba-Interaktionen

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Menschliche Colonoid Monolagen Wechselwirkungen zwischen Erreger, Kommensalen und Host Darmepithel zu studieren

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...

Analysis of Interactions between Endobiotics and Human Gut Microbiota Using In Vitro Bath Fermentation Systems

Analyse von Wechselwirkungen zwischen Endobiotika und Human Gut Microbiota mit In-Vitro-Badfermentationssystemen

Human intestinal microorganisms have recently become an important target of research in promoting human health and preventing diseases. Consequently, ...