Name: co-immunoprecipitation assay for studying functional interactions between receptors and enzymes
Uploaded: 2018-09-28T15:00:00
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इस परियोजना को NIH अनुदान 1R01AI125640-01 और संधिवातीयशास्त्र रिसर्च फाउंडेशन द्वारा वित्तपोषित किया गया था ।

1. कोशिकाओं की अभिकर्मक
<ol><li>बीज HEK 293T कोशिकाओं में १२ १० सेमी प्लेट्स (5 x 106 कोशिकाओं प्रति प्लेट) दिन पहले अभिकर्मक (चित्रा 1) । एक hemocytometer का उपयोग कर सेल गिनती प्रदर्शन । प्रत्येक प्लेट के लिए, 10% F...

<ol>
	<li>Montor, W. R., Salas, A., Melo, F. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+tyrosine+kinases+and+downstream+pathways+as+druggable+targets+for+cancer+treatment:+the+current+arsenal+of+inhibitors.">Receptor tyrosine kinases and downstream pathways as druggable targets for cancer treatment: the current arsenal of inhibitors.</a> Molecular Cancer. 17 (1), (2018).</li><li>Ngoenkam, J., Schamel, W. W., Pongcharoen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selected+signalling+proteins+recruited+to+the+T-cell+receptor-CD3+complex.">Selected signalling proteins recruited to the T-cell receptor-CD3 complex.</a> Immunology. 153 (1), 42-50 (2018).</li><li>Azoulay-Alfaguter, I., Strazza, M., Pedoeem, A., Mor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+coreceptor+programmed+death+1+inhibits+T-cell+adhesion+by+regulating+Rap1.">The coreceptor programmed death 1 inhibits T-cell adhesion by regulating Rap1.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (2), 564-567 (2015).</li><li>Chemnitz, J. M., Parry, R. V., Nichols, K. E., June, C. H., Riley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHP-1+and+SHP-2+associate+with+immunoreceptor+tyrosine-based+switch+motif+of+programmed+death+1+upon+primary+human+T+cell+stimulation,+but+only+receptor+ligation+prevents+T+cell+activation.">SHP-1 and SHP-2 associate with immunoreceptor tyrosine-based switch motif of programmed death 1 upon primary human T cell stimulation, but only receptor ligation prevents T cell activation.</a> The Journal of Immunology. 173 (2), 945-954 (2004).</li><li>Patsoukis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+effects+of+PD-1+on+Akt+and+Ras+pathways+regulate+molecular+components+of+the+cell+cycle+and+inhibit+T+cell+proliferation.">Selective effects of PD-1 on Akt and Ras pathways regulate molecular components of the cell cycle and inhibit T cell proliferation.</a> Science Signaling. 5 (230), 46 (2012).</li><li>Pentcheva-Hoang, T., Chen, L., Pardoll, D. M., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+death-1+concentration+at+the+immunological+synapse+is+determined+by+ligand+affinity+and+availability.">Programmed death-1 concentration at the immunological synapse is determined by ligand affinity and availability.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (45), (2007).</li><li>Yokosuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+death+1+forms+negative+costimulatory+microclusters+that+directly+inhibit+T+cell+receptor+signaling+by+recruiting+phosphatase+SHP2.">Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2.</a> The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1201-1217 (2012).</li><li>Hui, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+costimulatory+receptor+CD28+is+a+primary+target+for+PD-1-mediated+inhibition.">T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition.</a> Science. 355 (6332), 1428-1433 (2017).</li><li>Sheppard, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+inhibits+T-cell+receptor+induced+phosphorylation+of+the+ZAP70/CD3zeta+signalosome+and+downstream+signaling+to+PKCtheta.">PD-1 inhibits T-cell receptor induced phosphorylation of the ZAP70/CD3zeta signalosome and downstream signaling to PKCtheta.</a> FEBS Letters. 574 (1-3), 37-41 (2004).</li><li>Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+immunoreceptor+inhibits+B+cell+receptor-mediated+signaling+by+recruiting+src+homology+2-domain-containing+tyrosine+phosphatase+2+to+phosphotyrosine.">PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (24), 13866-13871 (2001).</li><li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonism+between+binding+site+affinity+and+conformational+dynamics+tunes+alternative+cis-interactions+within+Shp2.">Antagonism between binding site affinity and conformational dynamics tunes alternative cis-interactions within Shp2.</a> Nature Communications. 4, 2037 (2013).</li><li>Peled, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+purification+mass+spectrometry+analysis+of+PD-1+uncovers+SAP+as+a+new+checkpoint+inhibitor.">Affinity purification mass spectrometry analysis of PD-1 uncovers SAP as a new checkpoint inhibitor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), E468-E477 (2018).</li><li>Jang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protein+tyrosine+phosphatase+inhibitor,+pervanadate,+inhibits+angiotensin+II-Induced+beta-arrestin+cleavage.">A protein tyrosine phosphatase inhibitor, pervanadate, inhibits angiotensin II-Induced beta-arrestin cleavage.</a> Molecules and Cells. 28 (1), 25-30 (2009).</li><li>Pluskey, S., Wandless, T. J., Walsh, C. T., Shoelson, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+stimulation+of+SH-PTP2+phosphatase+activity+by+simultaneous+occupancy+of+both+SH2+domains.">Potent stimulation of SH-PTP2 phosphatase activity by simultaneous occupancy of both SH2 domains.</a> The Journal of Biological Chemistry. 270 (7), 2897-2900 (1995).</li><li>McAvoy, T., Nairn, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serine/threonine+protein+phosphatase+assays.">Serine/threonine protein phosphatase assays.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).</li><li>Shlapatska, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD150+association+with+either+the+SH2-containing+inositol+phosphatase+or+the+SH2-containing+protein+tyrosine+phosphatase+is+regulated+by+the+adaptor+protein+SH2D1A.">CD150 association with either the SH2-containing inositol phosphatase or the SH2-containing protein tyrosine phosphatase is regulated by the adaptor protein SH2D1A.</a> The Journal of Immunology. 166 (9), 5480-5487 (2001).</li></ol>

रिसेप्टर-एंजाइम बातचीत intracellular संकेतन के लिए महत्वपूर्ण हैं. कई एंजाइमों SH2 phosphorylated tyrosines के लिए बाध्यकारी डोमेन के माध्यम से रिसेप्टर्स के लिए भर्ती कर रहे हैं कि एक ही रिसेप्टर्स की पूंछ को सजाने. हालांकि, एं...

उत्प्रेरक रिसेप्टर्स और रिसेप्टर tyrosine kinases transmembrane प्रोटीन है जिसमें एक extracellular ligand के बंधन एंजाइमी ओर1पर intracellular गतिविधि का कारण बनता है । कुछ रिसेप्टर्स दोनों रिसेप्टर और एंजाइमी कार्यों के अधिकारी, जबकि दूसरों को अपने cytoplasmic पूंछ के लिए इस तरह के kinases और phosphatases के रूप में विशिष्ट एंजाइमों की भर्ती. रिसेप्टर की पूंछ के लिए एक एंजाइम की भर्ती और इस एंजाइम के बाद उत्प्रेरक कार्रवाई दो अलग प्रक्रियाओं है कि हमेशा एक ही प्रोटीन डोमेन2द्वारा विनियमित नहीं कर रहे हैं । दुर्भाग्य से, एक साथ बातचीत और एंजाइमी गतिविधि दोनों का आकलन करने के लिए कोई विशिष्ट उपकरण हैं । कार्यात्मक सह immunoprecipitation परख यहां वर्णित एक उपयोगी तरीका है अपने सक्रियण से एक रिसेप्टर की पूंछ के लिए एक एंजाइम की भर्ती काटना है । इस परख एंटीबॉडी-लेपित मोतियों से टैग रिसेप्टर्स के immunoprecipitation का इस्तेमाल करता है । बाद में, दोनों एक एंजाइमी गतिविधि परख और मोतियों पर पश्चिमी दाग विश्लेषण प्रदर्शन कर रहे हैं । इस विधि के समग्र लक्ष्य को उजागर करने के लिए जो प्रोटीन डोमेन रिसेप्टर्स और एंजाइमों के बीच बातचीत के लिए आवश्यक हैं (पश्चिमी ब्लाट विश्लेषण द्वारा मूल्यांकन) और जो डोमेन एंजाइमों की पूरी सक्रियण के लिए अनिवार्य कर रहे हैं (पर से मापा-मनका एंजाइमी गतिविधि परख) । यह रिसेप्टर के अलग कार्यों का अध्ययन करने के लिए उपकरण विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है-जुड़े एंजाइमों मानव रोगों के रोगजनन में उनकी भागीदारी के कारण. इसके अलावा, आगे इन प्रोटीन की कार्रवाई के तंत्र को समझने के उपंयास चिकित्सीय हस्तक्षेप के डिजाइन में मदद कर सकते हैं ।
क्रमादेशित मृत्यु-1 (पीडी-1) टी कोशिकाओं की सतह पर एक निरोधात्मक रिसेप्टर है और अत्यधिक टी सेल प्रतिक्रियाओं को सीमित करने के लिए आवश्यक है. हाल के वर्षों में, विरोधी पीडी-1 एंटीबॉडी एकाधिक द्रोह1,2के उपचार में फंसाया गया है । पीडी-1 बंधाव प्रसार, आसंजन, और कई साइटोकिंस3,4,5के स्राव सहित कई टी सेल कार्यों को नियंत्रित करता है । पीडी-1 प्रतिरक्षा synapse, टी कोशिकाओं और प्रतिजन के बीच इंटरफेस-6कोशिकाओं को पेश करने के लिए स्थानीयकृत है, जहां यह टी सेल रिसेप्टर (TCR)7के साथ colocalizes. इसके बाद, tyrosine फॉस्फेट SHP2 [Src समरूपता 2 (SH2) डोमेन युक्त tyrosine फॉस्फेट 2] पीडी-1 की cytoplasmic पूंछ के लिए भर्ती है, dephosphorylation परिसर और उससे जुड़े समीपस्थ के भीतर प्रमुख tyrosine अवशेषों के TCR के लिए अग्रणी अणुओं3,4,5,8,9संकेत । पीडी-1 के cytoplasmic टेल दो tyrosine रूपांकनों, एक immunoreceptor tyrosine आधारित निरोधात्मक आकृति (इति॒), और एक immunoreceptor tyrosine आधारित-स्विच आकृति (आईटीएसएम)10शामिल हैं । दोनों रूपांकनों पीडी-1 बंधाव9,10पर phosphorylated हैं । Mutagenesis स्टडीज में SHP2 भर्ती में आईटीएसएम के लिए एक प्राथमिक भूमिका का पता चला है, के रूप में इति॒, पीडी-1 संकेतन और समारोह में जिनकी भूमिका4स्पष्ट नहीं है ।
SHP2 को गोद ले या तो एक बंद (मुड़ा हुआ), बाधित रचना या एक खुला (विस्तारित), सक्रिय अनुरूपता11. SHP2 बाइंडिंग या सक्रियण के लिए पीडी-1 के प्रत्येक टेल डोमेन के योगदान का अभी तक आविर्भाव नहीं हुआ है । इस सवाल का जवाब देने के लिए, हम एक परख है कि SHP2 की भर्ती के समानांतर परीक्षण पीडी-1 की पूंछ और अपनी गतिविधि12में सक्षम बनाता है विकसित की है । हम सह immunoprecipitation और एक पर-मनका फॉस्फेट गतिविधि परख कार्यरत दोनों बातचीत और समानांतर में एंजाइमी गतिविधि का परीक्षण । इस परख का उपयोग हम बताते हैं कि पीडी-1 की आईटीएसएम को पीडी-1 की टेल तक SHP2 भर्ती करने के लिए पर्याप्त है, जबकि पीडी-1 के इति॒ को पूरी तरह से बढ़ाने और एंजाइम को एक्टिवेट करने की जरूरत है ।
वहां कई रिसेप्टर्स कि उनके cytoplasmic पूंछ में कई आसंन डोमेन है । कार्यात्मक सह immunoprecipitation परख विशिष्ट डोमेन है कि या तो प्रोटीन भर्ती या एंजाइमी सक्रियण के लिए आवश्यक है की भूमिका को उजागर कर सकते हैं ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-516F</td>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424-R</td>
			<td>1.5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated FBS</td>
			<td>Denville</td>
			<td>FB5001-H</td>
			<td>Fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin / Streptomycin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP295950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose without L-glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-614F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFect Transfection Reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>301305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SHP2</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;GFP-agarose</td>
			<td>MBL</td>
			<td>D153-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>118144600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Actin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-1616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK-293 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orthovanadate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>216763</td>
			<td>30%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td>EDTA-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC2676</td>
			<td>Modified Laemmli buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% Tris-Glycine Mini Gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>XP04205BOX</td>
			<td>15-well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membranes</td>
			<td>General Electric</td>
			<td>10600004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td>N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1532</td>
			<td>Dithiothreitol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pNPP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>20-106</td>
			<td>p-Nitrophenyl Phosphate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td>Sodium hydroxide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>23225</td>
			<td>Bi Cinchoninic Acid assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

co-immunoprecipitation assay for studying functional interactions between receptors and enzymes

रिसेप्टर-संबद्ध एंजाइमों सेलुलर सक्रियण के प्रमुख मध्यस्थों हैं. इन एंजाइमों विनियमित रहे हैं, कम से कम भाग में, रिसेप्टर्स की cytoplasmic पूंछ के साथ शारीरिक बातचीत से. बातचीत अक्सर विशिष्ट प्रोटीन डोमेन और एंजाइमों के सक्रियकरण में परिणाम के माध्यम से होते हैं । वहां प्रोटीन के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए कई तरीके हैं । जबकि सह immunoprecipitation सामांयतः डोमेन है कि प्रोटीन के लिए आवश्यक है अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जाता है प्रोटीन बातचीत, वहां कोई परख रहे है कि दस्तावेज एक ही समय में भर्ती एंजाइमों की गतिविधि के लिए विशिष्ट डोमेन का योगदान । तदनुसार, विधि यहां वर्णित सह immunoprecipitation और एक पर-मनका एंजाइमी प्रोटीन और संबंधित एंजाइमी सक्रियण के बीच बातचीत के एक साथ मूल्यांकन के लिए गतिविधि परख को जोड़ती है । इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य है कि एक प्रोटीन और एंजाइम और डोमेन है कि एंजाइम की पूरी सक्रियण के लिए अनिवार्य कर रहे है के बीच शारीरिक बातचीत के लिए महत्वपूर्ण है डोमेन की पहचान करने के लिए है । इस परख के महत्व का प्रदर्शन किया है, के रूप में कुछ रिसेप्टर प्रोटीन डोमेन रिसेप्टर के cytoplasmic पूंछ करने के लिए एंजाइम के बंधन में योगदान है, जबकि अन्य डोमेन के लिए एक ही एंजाइम के समारोह को विनियमित करने के लिए आवश्यक हैं.

जबकि पीडी-1 के आईटीएसएम का योगदान SHP2 बाइंडिंग के लिए स्थापित किया गया है, पीडी-1 के इति॒ की भूमिका कम स्पष्ट है । क्योंकि SHP2 दो SH2 डोमेन है जो पीडी-1 पर दो अनुक्रमिक phosphotyrosines को बाइंड कर सकता है (एक tyrosine ...

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Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes

सह रिसेप्टर्स और एंजाइमों के बीच कार्यात्मक बातचीत का अध्ययन करने के लिए immunoprecipitation परख

यहां, हम सह के लिए एक प्रोटोकॉल वर्तमान immunoprecipitation और एक पर-मनका एंजाइमी गतिविधि परख के लिए एक साथ प्लाज्मा झिल्ली रिसेप्टर्स के विशिष्ट प्रोटीन डोमेन के योगदान का अध्ययन दोनों एंजाइम भर्ती और एंजाइम गतिविधि ।

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

यह विधि सेल-सिग्नलिंग क्षेत्र में महत्वपूर्ण प्रश्नों के उत्तर देने में मदद कर सकती है जैसे रिसेप्टर एंजाइम इंटरैक्शन और एंजाइमेटिक सक्रियण में विभिन्न प्रोटीन डोमेन का महत्व। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह रिसेप्टर एंजाइम इंटरैक्शन के सहवर्ती परीक्षण और एंजाइम गतिविधि पर इस बातचीत के कार्यात्मक परिणामों की अनुमति देता है। प्रत्येक प्लेट के लिए, 10% एफबीएस और 1% पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक डीएमईएम के 10 मिलीलीटर का उपयोग करें।ट्रांसफैक्शन से एक दिन पहले, बीज मानव भ्रूण गुर्दे २९३-टी कोशिकाओं को १२ १०-सेंटीमीटर प्लेटों में एक हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करने के लिए कोशिकाओं की गिनती । 5% C02 में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। एक बार कोशिकाओं को ८० से ९०% ढुलमुल हैं, एक लिपिड आधारित ट्रांसफैक्शन एजेंट का उपयोग करने के लिए प्लेटों के पांच ट्रांसफेक्ट ।10-सेंटीमीटर प्लेटों में कोशिकाओं के पालन के लिए निर्माता के निर्देशों के बाद ट्रांसफैक्शन करें। फिर इम्यूनोप्रिपिपिटेशन से पहले व्यक्त प्रोटीन राशि के माप के लिए एक गैर-संक्रमित नियंत्रण के रूप में सेवारत एक अतिरिक्त प्लेट के साथ पांच प्लेटों के एक समान दूसरे सेट को स्थानांतरित करें। एक ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में 48 घंटे के लिए 5% CO2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर संक्रमित प्लेटों को इनक्यूबेट करें।जीएफपी अभिव्यक्ति के लिए कोशिकाओं की जांच करने और यह सुनिश्चित करने के लिए फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करें कि ट्रांसफैक्शन सफलतापूर्वक हुआ है। 100-मिलीमोलर सोडियम ऑर्थोवनाडेट के 15 माइक्रोलीटर को 30% हाइड्रोजन पेरोक्साइड के 50 माइक्रोलीटर के साथ मिलाएं ताकि एक ताजा पेरवांडेट मिश्रण तैयार किया जा सके। पीडी-1 के टैग किए गए संस्करणों को फॉस्फोरलेट करने के लिए, मीडिया को पीडी-1-जीएफपी संक्रमित कोशिकाओं से हटा दें।प्रत्येक प्लेट में 10 मिलीलीटर सादे डीएमईएम और पर्वानाडडे के 10 माइक्रोलीटर जोड़ें। 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में इनक्यूबेट। इसके बाद, प्रति वॉश पीबीएस के पांच मिलीलीटर का उपयोग करके बर्फ-ठंडे पीबीएस में कोशिकाओं को तीन बार धोएं।इम्यूनोप्रिपिपिटेशन करते समय, सभी कदम या तो बर्फ पर या चार डिग्री सेल्सियस पर किए जाने चाहिए। बफर के 10 मिलीलीटर में अवरोधकों की एक गोली को भंग करके प्रोटीज अवरोधकों के साथ लाइसिस बफर को पूरक करें। साथ ही बफर में सोडियम ऑर्थोवानाडेट का एक मिलीमोलर डालें जिसका इस्तेमाल पीडी-1-जीएफपी-ट्रांसफेड प्लेट्स पर किया जाएगा ।कोशिकाओं में बर्फ-कोल्ड लाइसिस बफर के 500 माइक्रोलीटर जोड़ें, जिससे सोडियम ऑर्थोवानाडेट युक्त लाइसिस बफर को केवल पीडी-1-जीएफपी-संक्रमित कोशिकाओं वाली प्लेटों में जोड़ना सुनिश्चित हो। प्लेटों से कोशिकाओं को तुरंत हटाने और एकत्र करने के लिए सेल स्क्रैपर का उपयोग करें। lysates को 1.5 मिलीलीटर ठंडी ट्यूबों में स्थानांतरित करें और उन्हें 0.005 बार गुरुत्वाकर्षण और 30 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर घुमाएं।lysates से नाभिक के बाद सुपरनेट इकट्ठा करने के लिए, उन्हें 10, 000 बार गुरुत्वाकर्षण और 10 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर नीचे स्पिन । सुपरनेटेंट्स को नई ट्यूबों में स्थानांतरित करें और गोली को त्याग दें। बाद में WCL विश्लेषण के लिए बर्फ पर छह प्लेटों के दूसरे सेट के लिए supernatants स्टोर ।विरोधी GFP मोती की तैयारी शुरू करने के लिए, धीरे से बसने को रोकने के लिए खोलने से पहले मोती युक्त बोतल हिला । प्रत्येक स्थिति के अनुसार घोल से एंटी-जीएफपी मोतियों के 40 माइक्रोलीटर निकालें। तीन मिनट के लिए ५०० बार गुरुत्वाकर्षण और चार डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रलाइज ।मोतियों को धोने के लिए सुपरनेट निकालें, जिससे नुकसान को रोकने के लिए पिपेट और मोतियों के बीच संपर्क को कम करना सुनिश्चित करें। प्रति नमूना लाइसिस बफर के 80 माइक्रोलीटर में मोतियों को फिर से खर्च करें। चार प्लेटों के पहले सेट की पीडी-1-जीएफपी-एक्सप्रेसिंग कोशिकाओं से सीधे कोशिका में धोए गए मोतियों को जोड़ें।जीएफपी टैग किए गए प्रोटीन को इम्यूनोप्रिपिटेट करने के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 0.005 गुना गुरुत्वाकर्षण पर घुमाएं। मोतियों को तीन बार ठंडे लाइसिस बफर के एक मिलीलीटर का उपयोग करके धोएं जिसमें प्रत्येक धोने के लिए ऑर्थोवानाडेट नहीं होता है। फिर 10 सेकंड के लिए 2, ५०० बार गुरुत्वाकर्षण पर अपकेंद्रित्र ।प्लेटों के पहले सेट से सक्रिय SHP2 के lysate को तीन बराबर भागों में विभाजित करें और धोए गए पीडी-1-जीएफपी युक्त मोतियों वाले तीन ट्यूबों में से प्रत्येक में एक हिस्सा जोड़ें। गैर-संक्रमित कोशिकाओं से 1/3 मात्रा को जंगली प्रकार, पीडी-1-जीएफपी मोतियों की दूसरी ट्यूब में जोड़ें। शेष 2/3 को त्याग दें।मोतियों को चार घंटे तक कोमल रोटेशन के साथ चार डिग्री सेल्सियस पर ०.००५ गुना गुरुत्वाकर्षण पर इनक्यूबेट करें । इसके बाद, प्रत्येक धोने के लिए ठंडे लिसिस बफर के एक मिलीलीटर का उपयोग करके मोतियों को दो बार धोएं। प्रत्येक नमूने में लाइसिस बफर के 80 माइक्रोलीटर जोड़ें, यह सुनिश्चित करते हुए कि प्रत्येक ट्यूब में कुल मात्रा 100 माइक्रोलीटर है।एक कट पिपेट टिप का उपयोग करके, पिपेट धीरे-धीरे मिश्रण करने के लिए ऊपर और नीचे। फिर प्रत्येक ट्यूब से 50 माइक्रोलीटर को दो, ताजा, 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों में स्थानांतरित करें। मोतियों को एक बार फॉस्फेट वॉश बफर से धोएं।इसके बाद सुपरनेट को पूरी तरह से हटा दें। मोतियों में परख बफर के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें और सौम्य आंदोलन के तहत 30 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। जब बफर पीला हो जाता है, सोडियम हाइड्रोक्साइड के एक मोलर समाधान के ५० माइक्रोलीटर जोड़कर प्रतिक्रिया समाप्त ।10 सेकंड के लिए 2, ५०० बार गुरुत्वाकर्षण पर सेंट्रलाइज । इसके बाद, सुपरनिटेंट को 96-कुएं की प्लेट में आधे क्षेत्र के दो कुओं में स्थानांतरित करें। 405 नैनोमीटर पर शोषकों को पढ़ें और पीडी-1-जीएफपी के नियंत्रण जंगली-प्रकार संस्करण पर सापेक्ष ऑप्टिकल घनत्व के रूप में परिणाम व्यक्त करें।पहले 30 सेकंड के लिए 2, 000 बार गुरुत्वाकर्षण और चार डिग्री सेल्सियस पर मोतियों को नीचे स्पिन करें और सुपरनिट को हटा दें। दो बार लामली बफर के 20 माइक्रोलीटर जोड़ें और पांच मिनट के लिए ९५ डिग्री सेल्सियस पर उबाललें । बीसीए किट का उपयोग करके, इनपुट नियंत्रणों की प्रोटीन एकाग्रता को मापें।एक नई ट्यूब के लिए सबसे पतला नमूना के 30 माइक्रोलीटर हस्तांतरण। सबसे पतला नमूना के रूप में एक ही एकाग्रता के लिए इनपुट नियंत्रण के बाकी पतला करने के लिए लाइसिस बफर का उपयोग करें। फिर प्रत्येक पतला इनपुट नियंत्रण के 30 माइक्रोलीटर को एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें।लाइसेट्स में दो बार लेमडली बफर की बराबर मात्रा डालें और उन्हें पांच मिनट के लिए ९५ डिग्री सेल्सियस उबालें । इसके बाद, पाठ प्रोटोकॉल में उल्लिखित पश्चिमी दाग विश्लेषण करने से पहले 30 सेकंड के लिए 2, 000 बार गुरुत्वाकर्षण और चार डिग्री सेल्सियस पर मोतियों को स्पिन करें। इस अध्ययन में, रिसेप्टर एंजाइम इंटरैक्शन और सक्रियण के समानांतर मूल्यांकन के लिए एक संयुक्त सह-इम्यूनोप्रिपिपिटेशन और एंजाइमेटिक गतिविधि परख विकसित की गई है।आश्चर्य की बात है, SHP2 पीडी-1 को बांधने में विफल रहा जब ITSM उत्परिवर्तित किया गया था । उल्लेखनीय है, ITIM के उत्परिवर्ती संस्करण केवल एक सीमित सीमा तक SHP2 बाध्यकारी संकोच । फिर भी, SHP2-phosphatase गतिविधि परख से पता चलता है कि ITIM और ITSM एंजाइमेटिक गतिविधि के लिए समान रूप से अपरिहार्य हैं ।यह एक दो-चरण सक्रियण मॉडल का पता चलता है जिसमें SHP2 को आराम की स्थिति में एक ऑटोइनहिबिटेड संरचना में जोड़ दिया जाता है। पीडी-1 की सक्रियता पर, SHP2 फॉस्फोरलेटेड आईटीएसएम में भर्ती किया जाता है। हालांकि, आईटीआईएम को अपनी सक्रिय संरचना में SHP2 को प्रकट करने के लिए फॉस्फोरिलेटेड भी किया जाना चाहिए।इसके विकास के बाद, यह तकनीक रिसेप्टर-एंजाइम इंटरैक्शन में प्रोटीन डोमेन के कार्य का पता लगाने के लिए सेल सिग्नलिंग के क्षेत्र में शोधकर्ताओं के लिए मार्ग प्रशस्त कर सकती है।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

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मच्छर के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए एक कैल्शियम bioluminescence परख ( एडीज aegypti) और (टिक Rhipicephalus microplus) जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes.  The ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

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का उपयोग करते हुए निगरानी वृक्ष के समान सेल प्रवासन<sup&gt; 19</sup&gt; एफ /<sup&gt; 1</sup&gt; एच चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

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A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

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एक उपन्यास<em&gt; इन विट्रो</em&gt; मानव पूरे रक्त और endothelium के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए आदर्श

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Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

समय-समय पर एसिड शिफ़ धुंधला के साथ परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear में ग्लाइकोजन का पता लगाने के

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

इन्फ्लुएंजा ए वायरस nucleoprotein के साथ माउस MX1 प्रोटीन की सह immunoprecipitation

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Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

भड़काऊ आंत्र रोग में विरोधी आसंजन चिकित्सा के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए गतिशील आसंजन परख

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

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क्रिप्टोकॉकस-अमीबा इंटरेक्शन के अध्ययन में सूक्ष्म तकनीक और फ्लोरोसेंट रीडिंग का पूरक उपयोग

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

मानव कोलोनॉइड Monolayers रोगजनकों के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए, Commensals, और मेजबान आंत्र उपकला

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...

Analysis of Interactions between Endobiotics and Human Gut Microbiota Using In Vitro Bath Fermentation Systems

इन विट्रो बाथ फर्टिलाइजेशन सिस्टम का उपयोग करEndoबायोटिक्स और मानव गट माइक्रोबायोटा के बीच इंटरेक्शन का विश्लेषण

Human intestinal microorganisms have recently become an important target of research in promoting human health and preventing diseases. Consequently, ...