Name: co-immunoprecipitation assay for studying functional interactions between receptors and enzymes
Uploaded: 2018-09-28T15:00:00
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Questo progetto è stato finanziato da sovvenzioni NIH 1R01AI125640-01 e la reumatologia Research Foundation.

1. transfezione delle celle
<ol><li>Le cellule HEK 293T del seme in dodici piatti da 10 cm (5 x 106 cellule per piastra) il giorno prima di transfezione (Figura 1). Eseguire il conteggio delle cellule usando un emocitometro. Per ogni piastra, utilizzare 10 mL di DMEM completati con 10% FBS e 1% di penicillina/streptomicina. Incubare le cellule a 37 ° C in 5% CO2.</li>
	<li>Una volta che le cellule sono 80-90% confluenti, transfect 5 piastre HEK 293T utilizzando un re...

<ol>
	<li>Montor, W. R., Salas, A., Melo, F. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+tyrosine+kinases+and+downstream+pathways+as+druggable+targets+for+cancer+treatment:+the+current+arsenal+of+inhibitors.">Receptor tyrosine kinases and downstream pathways as druggable targets for cancer treatment: the current arsenal of inhibitors.</a> Molecular Cancer. 17 (1), (2018).</li><li>Ngoenkam, J., Schamel, W. W., Pongcharoen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selected+signalling+proteins+recruited+to+the+T-cell+receptor-CD3+complex.">Selected signalling proteins recruited to the T-cell receptor-CD3 complex.</a> Immunology. 153 (1), 42-50 (2018).</li><li>Azoulay-Alfaguter, I., Strazza, M., Pedoeem, A., Mor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+coreceptor+programmed+death+1+inhibits+T-cell+adhesion+by+regulating+Rap1.">The coreceptor programmed death 1 inhibits T-cell adhesion by regulating Rap1.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (2), 564-567 (2015).</li><li>Chemnitz, J. M., Parry, R. V., Nichols, K. E., June, C. H., Riley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHP-1+and+SHP-2+associate+with+immunoreceptor+tyrosine-based+switch+motif+of+programmed+death+1+upon+primary+human+T+cell+stimulation,+but+only+receptor+ligation+prevents+T+cell+activation.">SHP-1 and SHP-2 associate with immunoreceptor tyrosine-based switch motif of programmed death 1 upon primary human T cell stimulation, but only receptor ligation prevents T cell activation.</a> The Journal of Immunology. 173 (2), 945-954 (2004).</li><li>Patsoukis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+effects+of+PD-1+on+Akt+and+Ras+pathways+regulate+molecular+components+of+the+cell+cycle+and+inhibit+T+cell+proliferation.">Selective effects of PD-1 on Akt and Ras pathways regulate molecular components of the cell cycle and inhibit T cell proliferation.</a> Science Signaling. 5 (230), 46 (2012).</li><li>Pentcheva-Hoang, T., Chen, L., Pardoll, D. M., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+death-1+concentration+at+the+immunological+synapse+is+determined+by+ligand+affinity+and+availability.">Programmed death-1 concentration at the immunological synapse is determined by ligand affinity and availability.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (45), (2007).</li><li>Yokosuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+death+1+forms+negative+costimulatory+microclusters+that+directly+inhibit+T+cell+receptor+signaling+by+recruiting+phosphatase+SHP2.">Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2.</a> The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1201-1217 (2012).</li><li>Hui, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+costimulatory+receptor+CD28+is+a+primary+target+for+PD-1-mediated+inhibition.">T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition.</a> Science. 355 (6332), 1428-1433 (2017).</li><li>Sheppard, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+inhibits+T-cell+receptor+induced+phosphorylation+of+the+ZAP70/CD3zeta+signalosome+and+downstream+signaling+to+PKCtheta.">PD-1 inhibits T-cell receptor induced phosphorylation of the ZAP70/CD3zeta signalosome and downstream signaling to PKCtheta.</a> FEBS Letters. 574 (1-3), 37-41 (2004).</li><li>Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+immunoreceptor+inhibits+B+cell+receptor-mediated+signaling+by+recruiting+src+homology+2-domain-containing+tyrosine+phosphatase+2+to+phosphotyrosine.">PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (24), 13866-13871 (2001).</li><li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonism+between+binding+site+affinity+and+conformational+dynamics+tunes+alternative+cis-interactions+within+Shp2.">Antagonism between binding site affinity and conformational dynamics tunes alternative cis-interactions within Shp2.</a> Nature Communications. 4, 2037 (2013).</li><li>Peled, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+purification+mass+spectrometry+analysis+of+PD-1+uncovers+SAP+as+a+new+checkpoint+inhibitor.">Affinity purification mass spectrometry analysis of PD-1 uncovers SAP as a new checkpoint inhibitor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), E468-E477 (2018).</li><li>Jang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protein+tyrosine+phosphatase+inhibitor,+pervanadate,+inhibits+angiotensin+II-Induced+beta-arrestin+cleavage.">A protein tyrosine phosphatase inhibitor, pervanadate, inhibits angiotensin II-Induced beta-arrestin cleavage.</a> Molecules and Cells. 28 (1), 25-30 (2009).</li><li>Pluskey, S., Wandless, T. J., Walsh, C. T., Shoelson, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+stimulation+of+SH-PTP2+phosphatase+activity+by+simultaneous+occupancy+of+both+SH2+domains.">Potent stimulation of SH-PTP2 phosphatase activity by simultaneous occupancy of both SH2 domains.</a> The Journal of Biological Chemistry. 270 (7), 2897-2900 (1995).</li><li>McAvoy, T., Nairn, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serine/threonine+protein+phosphatase+assays.">Serine/threonine protein phosphatase assays.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).</li><li>Shlapatska, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD150+association+with+either+the+SH2-containing+inositol+phosphatase+or+the+SH2-containing+protein+tyrosine+phosphatase+is+regulated+by+the+adaptor+protein+SH2D1A.">CD150 association with either the SH2-containing inositol phosphatase or the SH2-containing protein tyrosine phosphatase is regulated by the adaptor protein SH2D1A.</a> The Journal of Immunology. 166 (9), 5480-5487 (2001).</li></ol>

Interazioni del ricevitore-enzima sono cruciali per segnalazione intracellulare. Molti enzimi sono reclutati ai ricevitori attraverso domini SH2 associazione a tirosine fosforilate che decorano le code degli stessi recettori. Tuttavia, gli enzimi sono spesso piegati in conformazioni inattive chiuse e attivazione richiede un cambiamento conformazionale11 che può essere mediato da altri domini del recettore stesso. Il test descritto qui misure le interazioni tra recettori e gli enzimi come pure l'a...

Recettori catalitici e recettori tirosin chinasici sono proteine transmembrana, in cui il legame di un ligando extracellulare causa attività enzimatica sul lato intracellulare1. Alcuni recettori possiedono recettori sia funzioni enzimatiche, mentre gli altri recluta enzimi specifici come chinasi e fosfatasi a loro code citoplasmatiche. Assunzione di un enzima alla coda del recettore e la conseguente azione catalitica di questo enzima sono due processi separati che non sono sempre disciplinati dalla stessa proteina domini2. Purtroppo, non ci sono nessun strumenti specifici per valutare l'interazione e l'attività enzimatica simultaneamente. L'analisi di co-immunoprecipitazione funzionale descritto qui è un metodo utile per sezionare il reclutamento di un enzima per la coda di un recettore dalla sua attivazione. Questo test utilizza immunoprecipitazione dei recettori contrassegnati da perline rivestite con anticorpo. Successivamente, vengono eseguite un'analisi di attività enzimatica e l'analisi western blot su perline. L'obiettivo generale di questo metodo è quello di scoprire quali domini di proteine sono necessari per le interazioni tra recettori e gli enzimi (valutati mediante analisi western blot) e quali domini sono obbligatori per completare l'attivazione degli enzimi (misurato con il tallone analisi di attività enzimatica). È significativo a sviluppare strumenti per studiare le funzioni separate di enzimi associata al recettore a causa del loro coinvolgimento nella patogenesi delle malattie umane. Inoltre, l'ulteriore comprensione dei meccanismi di azione di queste proteine può aiutare la progettazione di nuovi interventi terapeutici.
Morte programmata-1 (PD-1) è un recettore inibitorio sulla superficie delle cellule T ed è necessaria per limitare le risposte delle cellule T eccessivo. Negli ultimi anni, gli anticorpi anti-PD-1 sono stati implicati nel trattamento di tumori maligni multipli1,2. PD-1 legatura trattiene numerose funzioni a cellula T, tra cui la proliferazione, l'adesione e la secrezione di più citochine3,4,5. PD-1 è localizzato alla sinapsi immunologica, l'interfaccia tra le cellule T e cellule presentanti l'antigene6, dove esso colocalizza con il recettore delle cellule T (TCR)7. Successivamente, la tirosina fosfatasi SHP2 [Src homology 2 (SH2) dominio contenente tirosina fosfatasi 2] viene reclutato per la coda citoplasmatica di PD-1, che conduce alla defosforilazione di residui di tirosina chiave all'interno del complesso TCR e suoi associati prossimale segnalazione molecole3,4,5,8,9. La coda citoplasmatica di PD-1 contiene due motivi di tirosina, un immunorecettore basati su tirosina inibitori motivo (ITIM) e un immunorecettore tirosina motivo basato-interruttore (ITSM)10. Entrambi motivi vengono fosforilate su PD-1 legatura9,10. Studi di mutagenesi hanno rivelato un ruolo primario per l'ITSM SHP2 reclutamento, in contrasto con il ITIM, il cui ruolo nella segnalazione di PD-1 e la funzione non è chiaro4.
SHP2 adotta sia un chiuso (piegato), ha inibito la conformazione o un open (esteso), conformazione attiva11. Il contributo di ciascun dominio di coda di PD-1 SHP2 associazione o l'attivazione non è stata ancora chiarito. Per rispondere a questa domanda, abbiamo sviluppato un test che consente il test parallelo del reclutamento di SHP2 alla coda del PD-1 e sua attività12. Abbiamo impiegato co-immunoprecipitazione e un'analisi di attività della fosfatasi sul tallone per testare l'interazione e l'attività enzimatica in parallelo. Usando questa analisi, indichiamo che l'ITSM di PD-1 è sufficiente per reclutare SHP2 alla coda del PD-1, mentre il ITIM di PD-1 è necessario per estendere completamente e attivare l'enzima.
Ci sono molti recettori che hanno diversi domini adiacenti in loro code citoplasmatiche. Il test funzionale di co-immunoprecipitazione può scoprire il ruolo di specifici domini che sono necessari per l'attivazione enzimatica o di assunzione di proteine.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-516F</td>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424-R</td>
			<td>1.5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated FBS</td>
			<td>Denville</td>
			<td>FB5001-H</td>
			<td>Fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin / Streptomycin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP295950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose without L-glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-614F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFect Transfection Reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>301305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SHP2</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;GFP-agarose</td>
			<td>MBL</td>
			<td>D153-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>118144600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Actin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-1616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK-293 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orthovanadate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>216763</td>
			<td>30%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td>EDTA-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC2676</td>
			<td>Modified Laemmli buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% Tris-Glycine Mini Gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>XP04205BOX</td>
			<td>15-well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membranes</td>
			<td>General Electric</td>
			<td>10600004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td>N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1532</td>
			<td>Dithiothreitol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pNPP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>20-106</td>
			<td>p-Nitrophenyl Phosphate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td>Sodium hydroxide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>23225</td>
			<td>Bi Cinchoninic Acid assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

co-immunoprecipitation assay for studying functional interactions between receptors and enzymes

Associata al recettore gli enzimi sono i principali mediatori di attivazione cellulare. Questi enzimi sono regolati, almeno in parte, da interazioni fisiche con le code citoplasmatiche dei recettori. Le interazioni si verificano attraverso domini proteici specifici spesso e provocare l'attivazione degli enzimi. Ci sono diversi metodi per studiare le interazioni tra proteine. Mentre co-immunoprecipitazione è comunemente utilizzato per lo studio di domini che sono necessari per le interazioni proteina-proteina, non ci sono nessun test che documentano il contributo di domini specifici all'attività degli enzimi reclutati allo stesso tempo. Di conseguenza, il metodo qui descritto combina co-immunoprecipitazione e un saggio di attività enzimatica sul tallone per valutazione simultanea delle interazioni tra proteine e attivazione enzimatica. L'obiettivo del presente protocollo è quello di identificare i domini che sono critici per interazioni fisiche tra una proteina ed enzima e i domini che sono obbligatori per completare l'attivazione dell'enzima. L'importanza di questo test è dimostrata, come determinato ricevitore domini proteici contribuiscono all'associazione dell'enzima per la coda citoplasmatica del recettore, mentre altri domini sono necessari per regolare la funzione dell'enzima stesso.

Mentre il contributo di ITSM di PD-1 a SHP2 associazione è stabilito, il ruolo della ITIM di PD-1 è meno chiaro. Perché SHP2 ha due domini SH2 che possono legarsi a due fosfotirosine sequenziale su PD-1 (una tirosina nell'ITSM) e un altro in ITIM, abbiamo supposto che l'ITSM di PD-1 ancore SHP2 e PD-1, mentre il ITIM di PD-1 facilita l'attività SHP2 stabilizzando la aprire stato conformazionale11,14. Per eseguire questo test, ...

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Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes

Analisi di co-immunoprecipitazione per lo studio delle interazioni funzionali tra recettori e gli enzimi

Qui, presentiamo un protocollo per la co-immunoprecipitazione e un saggio di attività enzimatica sul tallone per studiare simultaneamente il contributo di domini proteici specifici dei recettori di membrana plasmatica sia reclutamento degli enzimi e l'attività dell'enzima.

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della segnalazione cellulare come l'importanza di diversi domini proteici nell'interazione enzimatica del recettore e nell'attivazione enzimatica. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente test concomitanti delle interazioni enzimatiche del recettore e delle conseguenze funzionali di questa interazione sull'attività enzimatica. Per ogni piastra, utilizzare 10 millilitri di DMEM integrati con 10%FBS e 1%penicillina e streptomicina.Il giorno prima della trasfezione, seminare cellule renali embrionali umani 293-T in piastre di 12 10 centimetri usando un emocitometro per contare le cellule. Incubare a 37 gradi Celsius nel 5%C02. Una volta che le cellule sono confluenti dall'80 al 90%, utilizzare un agente di trasfezione a base lipidica per trasfetto cinque delle piastre.Eseguire la trasfezione seguendo le istruzioni del produttore per le celle di aderenza in piastre di 10 centimetri. Quindi trasfetto un secondo set identico di cinque piastre insieme a una piastra aggiuntiva che funge da controllo non trasfetto per la misurazione della quantità di proteine espresse prima dell'immunoprecipitazione. Incubare le piastre trasfette in un incubatore di coltura tissutale a 37 gradi Celsius nel 5%CO2 per 48 ore.Utilizzare un microscopio fluorescente per esaminare le celle per l'espressione GFP e assicurarsi che la trasfezione si sia verificata correttamente. Mescolare 15 microlitri di ortovanato di sodio da 100 millimolare con 50 microlitri di perossido di idrogeno al 30% per preparare una miscela di pervanadate fresca. Per fosforilate le versioni taggate del PD-1, rimuovere il supporto dalle celle trasfette PD-1-GFP.Aggiungere 10 millilitri di DMEM semplice e 10 microlitri di pervanadate ad ogni piastra. Incubare al buio a temperatura ambiente per 15 minuti. Successivamente, lavare le cellule tre volte in PBS ghiacciato utilizzando cinque millilitri di PBS per lavaggio.Durante l'esecuzione dell'immunoprecipitazione, tutti i passaggi devono essere eseguiti sul ghiaccio o a quattro gradi Celsius. Integrare il tampone dilisi con inibitori della proteasi sciogliendo una compressa degli inibitori in 10 millilitri di tampone. Aggiungere anche un millimolare di ortovanato di sodio al tampone che verrà utilizzato sulle piastre transfette PD-1-GFP.Aggiungere 500 microlitri di tampone di lisi ghiacciata alle cellule, assicurandosi di aggiungere il tampone di lisi contenente l'ortovanato di sodio solo alle piastre contenenti cellule trasfette da PD-1-GFP. Utilizzare un raschietto per cellulare per rimuovere e raccogliere immediatamente le cellule dalle piastre. Trasferire i lisati in tubi freddi da 1,5 millilitri e ruotarli a 0,005 volte la gravità e a quattro gradi Celsius per 30 minuti.Per raccogliere il supernatante post-nuclei dai lisati, spinli verso il basso a 10.000 volte la gravità e quattro gradi Celsius per 10 minuti. Trasferire i supernatanti in nuovi tubi e scartare il pellet. Conservare i supernatanti per il secondo set di sei piastre su ghiaccio per una successiva analisi WCL.Per iniziare a preparare le perline anti-GFP, agitare delicatamente la bottiglia contenente le perline prima dell'apertura per evitare la sedimentazione. Rimuovere 40 microlitri delle perline anti-GFP dal liquame per ogni condizione. Centrifuga a 500 volte la gravità e quattro gradi Celsius per tre minuti.Rimuovere il supernatante per lavare le perline, assicurandosi di ridurre al minimo il contatto tra la pipetta e le perline per evitare perdite. Rimescolare le perline in 80 microlitri di tampone di lysis per campione. Aggiungere le perline lavate direttamente al lysate cellulare dalle cellule che esprimono PD-1-GFP del primo set di quattro piastre.Ruotare a 0,005 volte la gravità per 30 minuti a quattro gradi Celsius per immunoprecipitare le proteine taggate dalla GFP. Lavare le perline tre volte utilizzando un millilitro di tampone di lisi fredda che non contiene ortovanadate per ogni lavaggio. Quindi centrifugare a 2.500 volte la gravità per 10 secondi.Dividere il lisato dell'SHP2 attivo dal primo set di piastre in tre porzioni uguali e aggiungere una porzione a ciascuno dei tre tubi contenenti le perline lavate contenenti PD-1-GFP. Aggiungere 1/3 del volume di lisato dalle cellule non trasfette al secondo tubo delle perle PD-1-GFP di tipo selvatico. Scartare il restante 2/3.Incubare le perline per quattro ore a quattro gradi Celsius con una rotazione delicata a 0,005 volte la gravità. Dopo questo, lavare le perline due volte usando un millilitro di tampone di lisi fredda per ogni lavaggio. Aggiungere 80 microlitri di tampone dilisi a ciascun campione, assicurando che il volume totale in ogni tubo sia di 100 microlitri.Utilizzando una punta di pipetta tagliata, pipettare delicatamente su e giù per mescolare. Quindi trasferire 50 microlitri da ogni tubo in due tubi freschi da 1,5 millilitri. Lavare le perline una volta con tampone di lavaggio fosfatasi.Quindi rimuovere completamente il supernatante. Aggiungere 100 microlitri di tampone di dosaggio alle perline e incubare a 30 gradi Celsius per 30 minuti sotto delicata agitazione. Quando il tampone diventa giallo, terminare la reazione aggiungendo 50 microlitri di una soluzione molare di idrossido di sodio.Centrifuga a 2.500 volte la gravità per 10 secondi. Successivamente, trasferire il supernatante in due pozzi di mezza area in una piastra da 96 po '. Leggere gli assorbenti a 405 nanometri ed esprimere i risultati come densità ottica relativa sulla versione di controllo di tipo selvaggio di PD-1-GFP.Prima spin giù le perline a 2.000 volte la gravità e quattro gradi Celsius per 30 secondi e rimuovere il supernatante. Aggiungere 20 microlitri di tampone Laemmli due volte e far bollire a 95 gradi Celsius per cinque minuti. Utilizzando un kit BCA, misurare la concentrazione proteica dei controlli di input.Trasferire 30 microlitri del campione più diluito in un nuovo tubo. Utilizzare il tampone di lisi per diluire il resto dei controlli di input alla stessa concentrazione del campione più diluito. Quindi trasferire 30 microlitri di ciascuno dei comandi di ingresso diluiti su un nuovo tubo.Aggiungere volumi uguali di due volte il buffer Laemmli ai lisati e farli bollire di 95 gradi Celsius per cinque minuti. Successivamente, spingi le perline a 2.000 volte la gravità e quattro gradi Celsius per 30 secondi prima di eseguire l'analisi Western Blot come delineato nel protocollo di testo. In questo studio, viene sviluppato un saggio combinato di co-immunoprecipitazione e attività enzimatica per la valutazione parallela delle interazioni enzimatiche del recettore e dell'attivazione.Non sorprende che SHP2 non sia riuscito a legarsi al PD-1 quando ITSM è stato mutato. Sorprendentemente, la versione mutante dell'ITIM inibì l'associazione SHP2 solo in misura limitata. Tuttavia, il saggio di attività SHP2-fosfatasi rivela che ITIM e ITSM sono ugualmente indispensabili per l'attività enzimatica.Ciò rivela un modello di attivazione in due fase in cui SHP2 viene piegato in una conformazione automatica in condizioni di riposo. All'attivazione del PD-1, SHP2 viene reclutato nell'ITSM fosforilato. Tuttavia, l'ITIM deve anche essere fosforilato per dispiegarsi SHP2 nella sua conformazione attiva.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica può aprire la strada ai ricercatori nel campo della segnalazione cellulare per esplorare la funzione dei domini proteici nelle interazioni recettore-enzima.

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The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Rilevamento glicogeno in cellule periferiche mononucleate del sangue con Periodic Acid Schiff colorazione

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Co-immunoprecipitazione della proteina mouse Mx1 con il virus nucleoproteina Influenza A

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Analisi di adesione dinamico per l'analisi funzionale delle terapie di anti-adesione nelle malattie intestinali infiammatorie

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

Uso complementare di tecniche microscopiche e lettura di fluorescenza nello studio delle interazioni Cryptococcus-Amoeba

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Monostrati Colonoid umana per studiare le interazioni tra gli agenti patogeni, Commensals ed epitelio intestinale Host

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...

Analysis of Interactions between Endobiotics and Human Gut Microbiota Using In Vitro Bath Fermentation Systems

Analisi delle interazioni tra endobiotici e microbiota intestinale umana utilizzando sistemi di fermentazione bagno in vitro

Human intestinal microorganisms have recently become an important target of research in promoting human health and preventing diseases. Consequently, ...