Name: co-immunoprecipitation assay for studying functional interactions between receptors and enzymes
Uploaded: 2018-09-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes at JoVE.com

Dette prosjektet ble finansiert av NIH tilskudd 1R01AI125640-01 og Rheumatology Research Foundation.

1. hva celler
<ol><li>Frø HEK 293T celler i tolv 10 cm plater (5 x 106 celler per plate) dagen før transfection (figur 1). Utføre celle tellingen bruker en hemocytometer. For hver plate, kan du bruke 10 mL av DMEM med 10% FBS og 1% penicillin/streptomycin. Inkuber cellene på 37 ° C i 5% CO2.</li>
	<li>Når cellene er 80-90% confluent, transfect 5 HEK 293T plater med ett av følgende plasmider en lipid-baserte transfection reagens: en SHP2-uttrykke vektor, en PD-1...

<ol>
	<li>Montor, W. R., Salas, A., Melo, F. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+tyrosine+kinases+and+downstream+pathways+as+druggable+targets+for+cancer+treatment:+the+current+arsenal+of+inhibitors.">Receptor tyrosine kinases and downstream pathways as druggable targets for cancer treatment: the current arsenal of inhibitors.</a> Molecular Cancer. 17 (1), (2018).</li><li>Ngoenkam, J., Schamel, W. W., Pongcharoen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selected+signalling+proteins+recruited+to+the+T-cell+receptor-CD3+complex.">Selected signalling proteins recruited to the T-cell receptor-CD3 complex.</a> Immunology. 153 (1), 42-50 (2018).</li><li>Azoulay-Alfaguter, I., Strazza, M., Pedoeem, A., Mor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+coreceptor+programmed+death+1+inhibits+T-cell+adhesion+by+regulating+Rap1.">The coreceptor programmed death 1 inhibits T-cell adhesion by regulating Rap1.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (2), 564-567 (2015).</li><li>Chemnitz, J. M., Parry, R. V., Nichols, K. E., June, C. H., Riley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHP-1+and+SHP-2+associate+with+immunoreceptor+tyrosine-based+switch+motif+of+programmed+death+1+upon+primary+human+T+cell+stimulation,+but+only+receptor+ligation+prevents+T+cell+activation.">SHP-1 and SHP-2 associate with immunoreceptor tyrosine-based switch motif of programmed death 1 upon primary human T cell stimulation, but only receptor ligation prevents T cell activation.</a> The Journal of Immunology. 173 (2), 945-954 (2004).</li><li>Patsoukis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+effects+of+PD-1+on+Akt+and+Ras+pathways+regulate+molecular+components+of+the+cell+cycle+and+inhibit+T+cell+proliferation.">Selective effects of PD-1 on Akt and Ras pathways regulate molecular components of the cell cycle and inhibit T cell proliferation.</a> Science Signaling. 5 (230), 46 (2012).</li><li>Pentcheva-Hoang, T., Chen, L., Pardoll, D. M., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+death-1+concentration+at+the+immunological+synapse+is+determined+by+ligand+affinity+and+availability.">Programmed death-1 concentration at the immunological synapse is determined by ligand affinity and availability.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (45), (2007).</li><li>Yokosuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+death+1+forms+negative+costimulatory+microclusters+that+directly+inhibit+T+cell+receptor+signaling+by+recruiting+phosphatase+SHP2.">Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2.</a> The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1201-1217 (2012).</li><li>Hui, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+costimulatory+receptor+CD28+is+a+primary+target+for+PD-1-mediated+inhibition.">T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition.</a> Science. 355 (6332), 1428-1433 (2017).</li><li>Sheppard, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+inhibits+T-cell+receptor+induced+phosphorylation+of+the+ZAP70/CD3zeta+signalosome+and+downstream+signaling+to+PKCtheta.">PD-1 inhibits T-cell receptor induced phosphorylation of the ZAP70/CD3zeta signalosome and downstream signaling to PKCtheta.</a> FEBS Letters. 574 (1-3), 37-41 (2004).</li><li>Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+immunoreceptor+inhibits+B+cell+receptor-mediated+signaling+by+recruiting+src+homology+2-domain-containing+tyrosine+phosphatase+2+to+phosphotyrosine.">PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (24), 13866-13871 (2001).</li><li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonism+between+binding+site+affinity+and+conformational+dynamics+tunes+alternative+cis-interactions+within+Shp2.">Antagonism between binding site affinity and conformational dynamics tunes alternative cis-interactions within Shp2.</a> Nature Communications. 4, 2037 (2013).</li><li>Peled, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+purification+mass+spectrometry+analysis+of+PD-1+uncovers+SAP+as+a+new+checkpoint+inhibitor.">Affinity purification mass spectrometry analysis of PD-1 uncovers SAP as a new checkpoint inhibitor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), E468-E477 (2018).</li><li>Jang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protein+tyrosine+phosphatase+inhibitor,+pervanadate,+inhibits+angiotensin+II-Induced+beta-arrestin+cleavage.">A protein tyrosine phosphatase inhibitor, pervanadate, inhibits angiotensin II-Induced beta-arrestin cleavage.</a> Molecules and Cells. 28 (1), 25-30 (2009).</li><li>Pluskey, S., Wandless, T. J., Walsh, C. T., Shoelson, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+stimulation+of+SH-PTP2+phosphatase+activity+by+simultaneous+occupancy+of+both+SH2+domains.">Potent stimulation of SH-PTP2 phosphatase activity by simultaneous occupancy of both SH2 domains.</a> The Journal of Biological Chemistry. 270 (7), 2897-2900 (1995).</li><li>McAvoy, T., Nairn, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serine/threonine+protein+phosphatase+assays.">Serine/threonine protein phosphatase assays.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).</li><li>Shlapatska, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD150+association+with+either+the+SH2-containing+inositol+phosphatase+or+the+SH2-containing+protein+tyrosine+phosphatase+is+regulated+by+the+adaptor+protein+SH2D1A.">CD150 association with either the SH2-containing inositol phosphatase or the SH2-containing protein tyrosine phosphatase is regulated by the adaptor protein SH2D1A.</a> The Journal of Immunology. 166 (9), 5480-5487 (2001).</li></ol>

Reseptor-enzym interaksjoner er avgjørende for intracellulær signalering. Mange enzymer er rekruttert til reseptorer gjennom SH2 domener binding til fosforylert tyrosines som dekorerer haler av samme reseptorer. Imidlertid er enzymer ofte i lukket inaktive konformasjonen, og aktivering krever en conformational endring11 som kan være formidlet av andre domener av samme reseptoren. Analysen beskrevet her tiltak samspillet mellom reseptorer og enzymer som aktiviteten indusert av disse interaksjone...

Katalytisk reseptorer og receptor tyrosine kinaser er transmembrane proteiner som forårsaker binding av en ekstracellulære ligand enzymatisk aktivitet på intracellulær siden1. Noen reseptorer har både reseptor og enzymatiske funksjoner, mens andre rekruttere spesielle enzymer som kinaser og phosphatases til cytoplasmiske halen. Rekruttering av et enzym reseptorens halen og påfølgende katalytiske handlingen av dette enzymet er to separate prosesser som ikke alltid er regulert av den samme protein domener2. Dessverre er det ingen spesifikke verktøy å vurdere både samhandling og enzymatiske aktiviteten samtidig. Funksjonell co-immunoprecipitation analysen beskrevet her er en nyttig metode for å analysere rekruttering av et enzym på halen av en reseptor fra aktivering sin. Denne analysen benytter immunoprecipitation av merket reseptorer av antistoff perler. Deretter utføres en enzymatisk aktivitet analysen og western blot analyse på perler. Det overordnede målet med denne metoden er å avdekke hvilke protein domener er nødvendig for kommunikasjon mellom reseptorer og enzymer (vurdert ved western blot analyse) og hvilke domener er obligatorisk for full aktivering av enzymer (målt ved på-perle enzymatisk aktivitet analysen). Det er viktig å utvikle verktøy for å studere de separate funksjonene av reseptor-assosiert enzymer på grunn av deres engasjement i patogenesen av menneskelige sykdommer. Videre kan videre forståelse virkningsmekanismer av disse proteinene bidra til utformingen av romanen terapeutisk intervensjon.
Programmert død-1 (PD-1) er en hemmende reseptor på overflaten av T-celler og er nødvendig for å begrense overdreven T celle svar. De siste årene, har anti-PD-1 antistoffer vært medvirkende i behandlingen av flere malignitet1,2. PD-1 ligation begrenser tallrike T celle-funksjoner, inkludert spredning, vedheft og sekresjon av flere cytokiner3,4,5. PD-1 er lokalisert til immunologiske synapse, grensesnittet mellom T celler og antigen-presentasjon celler6, der det colocalizes med T-celle reseptor (TCR)7. Deretter tyrosin fosfatase SHP2 [Src homologi 2 (SH2) domenet som inneholder tyrosin fosfatase 2] rekruttert til cytoplasmiske hale av PD-1, fører til dephosphorylation av viktige tyrosin rester TCR komplekset og assosierte proksimale signalnettverk molekyler,3,,4,,5,,8,,9. Cytoplasmiske halen av PD-1 inneholder to tyrosin motiver, en immunoreceptor tyrosin-baserte hemmende motiv (svart) og en immunoreceptor tyrosin basert-bryteren motiv (ITSM)10. Både motiver er fosforylert på PD-1 ligation9,10. Mutagenese undersøkelser avdekket en primær rolle for ITSM i SHP2 rekruttering, i motsetning til svart, hvis rolle i PD-1 signalering og funksjon ikke er klart4.
SHP2 vedtar enten en lukket (kastet), hemmet conformation eller en åpen (utvidet), aktiv konformasjon11. Bidraget fra hver hale domenet av PD-1 SHP2 binding eller aktivisering har ennå ikke utredet. For å besvare dette spørsmålet, utviklet vi en analyse som gjør parallelle testing av rekrutteringen av SHP2 på halen av PD-1 og dens aktivitet12. Vi ansatt co-immunoprecipitation og på-perle fosfatase aktivitet analysen å teste både samhandling og enzymatiske aktiviteten i parallell. Bruker denne analysen, viser vi at ITSM av PD-1 er tilstrekkelig å rekruttere SHP2 på halen av PD-1, mens svart av PD-1 er nødvendig å fullt utvide og aktiverer enzymet.
Det er mange reseptorer som har flere tilstøtende domener i cytoplasmiske halen. Funksjonell co-immunoprecipitation analysen kan avdekke rollen til bestemte domener som er nødvendige for protein rekruttering eller enzymatisk aktivisering.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-516F</td>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424-R</td>
			<td>1.5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated FBS</td>
			<td>Denville</td>
			<td>FB5001-H</td>
			<td>Fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin / Streptomycin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP295950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose without L-glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-614F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFect Transfection Reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>301305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SHP2</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;GFP-agarose</td>
			<td>MBL</td>
			<td>D153-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>118144600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Actin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-1616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK-293 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orthovanadate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>216763</td>
			<td>30%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td>EDTA-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC2676</td>
			<td>Modified Laemmli buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% Tris-Glycine Mini Gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>XP04205BOX</td>
			<td>15-well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membranes</td>
			<td>General Electric</td>
			<td>10600004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td>N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1532</td>
			<td>Dithiothreitol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pNPP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>20-106</td>
			<td>p-Nitrophenyl Phosphate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td>Sodium hydroxide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>23225</td>
			<td>Bi Cinchoninic Acid assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

co-immunoprecipitation assay for studying functional interactions between receptors and enzymes

Reseptor-assosiert enzymer er store meklere av aktivering. Disse enzymene er regulert, minst delvis av fysisk interaksjon med cytoplasmiske hale av reseptorer. Samhandlinger som ofte oppstår gjennom bestemt protein domener og føre aktivering av enzymer. Det finnes flere metoder til å studere samspillet mellom proteiner. Mens co-immunoprecipitation brukes vanligvis til å studere domener som kreves for protein-protein interaksjoner, er det ingen analyser dokumentet bidraget fra bestemte domener til aktivitet av rekruttert enzymer samtidig. Følgelig kombinerer metoden beskrevet her co-immunoprecipitation og på-perle enzymatisk aktivitet analysen for samtidige evaluering av samspillet mellom proteiner og tilknyttede enzymatisk aktivisering. Målet med denne protokollen er å identifisere domenene som er kritiske for fysisk interaksjon mellom et protein enzym og domenene som er obligatorisk for full aktivering av enzym. Betydningen av denne analysen er demonstrert, som enkelte reseptor protein domener bidrar til binding av enzymet til cytoplasmiske hale av reseptoren, mens andre domener er nødvendig å regulere funksjon av det samme enzymet.

Mens bidraget av ITSM PD-1 SHP2 zbindowanie opprettes, er rollen av svart PD-1 mindre klart. Fordi SHP2 har to SH2 domener som kan binde til to sammenhengende phosphotyrosines på PD-1 (ett tyrosin i ITSM) og en annen i svart, vi hypotesen at ITSM av PD-1 forankrer SHP2 PD-1, mens svart av PD-1 forenkler SHP2 aktivitet ved å stabilisere sin Åpne conformational stat11,14. For å teste dette, utviklet vi en kombinert co-immunoprec...

Watch this Scientific Journal Video about Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes at JoVE.com

Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes

Co-immunoprecipitation analysen for å studere funksjonell samhandling mellom reseptorer og enzymer

Her presenterer vi en protokoll for co-immunoprecipitation og på-perle enzymatisk aktivitet analysen samtidig studere bidrag av bestemt protein domener av plasma membran reseptorer både enzym rekruttering og enzym aktivitet.

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål i cellesignalfeltet, for eksempel viktigheten av forskjellige proteindomener i reseptorenzyminteraksjon og enzymatisk aktivering. Den største fordelen med denne teknikken er at den tillater samtidig testing av reseptorenzyminteraksjoner og de funksjonelle konsekvensene av denne interaksjonen på enzymaktiviteten. For hver plate, bruk 10 milliliter DMEM supplert med 10% FBS og 1% penicillin og streptomycin.Dagen før transfection, frø menneskelig embryonal nyre 293-T celler i 12 10-centimeter plater ved hjelp av et hemocytometer for å telle cellene. Inkuber ved 37 grader Celsius i 5% C02. Når cellene er 80 til 90% samløpet, bruk et lipidbasert transfeksjonsmiddel til å transfisere fem av platene.Utfør transinfeksjonen ved å følge produsentens instruksjoner for etterlevelsesceller i 10-centimeters plater. Deretter transfect et identisk andre sett med fem plater sammen med en ekstra plate som fungerer som en ikke-infisert kontroll for måling av uttrykt proteinmengde før immunforebukk. Inkuber de trans infiserte platene i en vevskulturinkubator ved 37 grader Celsius i 5% CO2 i 48 timer.Bruk et fluorescerende mikroskop for å undersøke cellene for GFP-uttrykk og sikre at transinfeksjonen har skjedd. Bland 15 mikroliter med 100 millimolar natrium orthovanadate med 50 mikroliter med 30% hydrogenperoksid for å forberede en frisk pervanadateblanding. For å fosforyler de kodede versjonene av PD-1, fjern mediet fra PD-1-GFP transfectede celler.Tilsett 10 milliliter vanlig DMEM og 10 mikroliter pervanadate til hver plate. Inkuber i mørket ved romtemperatur i 15 minutter. Etter dette vasker du cellene tre ganger i iskald PBS ved hjelp av fem milliliter PBS per vask.Mens du utfører immunforutståelse, bør alle trinnene utføres enten på is eller ved fire grader Celsius. Supplere lysis buffer med protease hemmere ved å oppløse en tablett av hemmere i 10 milliliter buffer. Legg også til en millimolar natriumorthovanadate til bufferen som skal brukes på PD-1-GFP-transfectede plater.Tilsett 500 mikroliter iskald lysisbuffer til cellene, og sørg for å legge til lysisbufferen som inneholder natriumorthovanadate til bare platene som inneholder PD-1-GFP-infiserte celler. Bruk en celleskraper til umiddelbart å fjerne og samle cellene fra platene. Overfør lysates i 1,5-milliliter kalde rør og roter dem på 0,005 ganger tyngdekraften og ved fire grader Celsius i 30 minutter.For å samle post-nuclei supernatant fra lysates, spinne dem ned på 10,000 ganger tyngdekraften og fire grader Celsius i 10 minutter. Overfør supernativane til nye rør og kast pelleten. Oppbevar supernativa for det andre settet med seks plater på is for senere WCL-analyse.For å begynne å forberede anti-GFP perler, rist forsiktig flasken som inneholder perlene før du åpner for å forhindre bosetting. Fjern 40 mikroliter av anti-GFP perler fra slurry per hver tilstand. Sentrifuge på 500 ganger tyngdekraften og fire grader Celsius i tre minutter.Fjern det overnaturlige for å vaske perlene, og sørg for å minimere kontakten mellom pipetten og perlene for å forhindre tap. Resuspend perlene i 80 mikroliter lysisbuffer per prøve. Tilsett de vasket perlene direkte til cellelylat fra PD-1-GFP-uttrykkende celler i det første settet med fire plater.Roter ved 0,005 ganger tyngdekraften i 30 minutter ved fire grader Celsius for å immunprecipitate GFP-merkede proteiner. Vask perlene tre ganger ved hjelp av en milliliter kald lysisbuffer som ikke inneholder orthovanadate for hver vask. Deretter sentrifuge på 2, 500 ganger tyngdekraften i 10 sekunder.Del lysatet til den aktive SHP2 fra det første settet med plater i tre like deler og legg til en del av hvert av de tre rørene som inneholder de vasket PD-1-GFP-inneholdende perlene. Tilsett 1/3 av lysatevolumet fra de ikke-infiserte cellene til det andre røret av villtypen PD-1-GFP perler. Kast de resterende 2/3.Inkuber perlene i fire timer ved fire grader Celsius med mild rotasjon på 0,005 ganger tyngdekraften. Etter dette vasker du perlene to ganger ved hjelp av en milliliter kald lysisbuffer for hver vask. Tilsett 80 mikroliter lysisbuffer i hver prøve, slik at det totale volumet i hvert rør er 100 mikroliter.Bruk en kuttet pipettespiss, pipette forsiktig opp og ned for å blande. Overfør deretter 50 mikroliter fra hvert rør til to, friske, 1,5 milliliter rør. Vask perlene en gang med fosfatasevaskbuffer.Fjern deretter supernatanten helt. Tilsett 100 mikroliter med analysebuffer til perlene og inkuber ved 30 grader Celsius i 30 minutter under mild agitasjon. Når bufferen blir gul, avslutt reaksjonen ved å legge til 50 mikroliter av en molarløsning av natriumhydroksid.Sentrifuge på 2, 500 ganger tyngdekraften i 10 sekunder. Etter dette, overføre supernatant i to brønner av halvt område i en 96-brønns plate. Les absorberende ved 405 nanometer og uttrykk resultatene som relativ optisk tetthet over kontrollen wild-type versjon av PD-1-GFP.Først spinne ned perlene på 2000 ganger tyngdekraften og fire grader Celsius i 30 sekunder og fjern det overnaturlige. Tilsett 20 mikroliter to ganger Laemmli buffer og kok ved 95 grader Celsius i fem minutter. Bruk et BCA-sett til å måle proteinkonsentrasjonen av inngangskontrollene.Overfør 30 mikroliter av den mest fortynnede prøven til et nytt rør. Bruk lysisbufferen til å fortynne resten av inngangskontrollene til samme konsentrasjon som den mest fortynnede prøven. Overfør deretter 30 mikroliter av hver av de fortynnede inngangskontrollene til et nytt rør.Tilsett like volumer på to ganger Laemmli buffer til lysates og kok dem 95 grader Celsius i fem minutter. Etter dette, spinne ned perlene på 2000 ganger tyngdekraften og fire grader Celsius i 30 sekunder før du utfører Western Blot analyse som beskrevet i tekstprotokollen. I denne studien utvikles en kombinert co-immunoprecipitation og enzymatisk aktivitetsanalyse for parallell vurdering av reseptorenzyminteraksjoner og aktivering.Ikke overraskende klarte ikke SHP2 å binde til PD-1 da ITSM ble mutert. Bemerkelsesverdig, den muterte versjonen av ITIM hemmet SHP2 binding bare i begrenset grad. Likevel viser SHP2-fosfataseaktivitetsanalysen at ITIM og ITSM er like uunnværlige for enzymatisk aktivitet.Dette avslører en to-trinns aktiveringsmodell der SHP2 er brettet inn i en autohemmet konformasjon under hvileforhold. Ved aktivering av PD-1 rekrutteres SHP2 til fosforet ITSM. ITIM må imidlertid også fosforyleres for å utfolde SHP2 i sin aktive konformasjon.Etter utviklingen kan denne teknikken bane vei for forskere innen cellesignalering for å utforske funksjonen til proteindomener i reseptor-enzyminteraksjoner.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes.  The ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

Studerer Samhandling av<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Med Neutrophils ved flowcytometri og Time Lapse Mikroskopi

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel<em&gt; In vitro</em&gt; Modell for å studere samspillet mellom humant fullblod og endotelet

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Oppdager Glykogen i perifere mononukleære blodceller med Periodisk Acid Schiff Farging

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Co-immunoprecipitation av musen Mx1 Protein med influensa A virus nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Dynamisk vedheft analysen for funksjonell analyse av anti-vedheft terapi i inflammatorisk tarmsykdom

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

Komplementær bruk av mikroskopiske teknikker og fluorescens Reading i Studying Cryptococcus-Amoeba interaksjoner

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Menneskelig Colonoid Monolayers å studere interaksjonen mellom patogener, Commensals og vert Intestinal epitel

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...

Analysis of Interactions between Endobiotics and Human Gut Microbiota Using In Vitro Bath Fermentation Systems

Analyse av interaksjoner mellom Endobiotics og Human gut bakterieflora bruke in vitro Bath Gjærings systemer

Human intestinal microorganisms have recently become an important target of research in promoting human health and preventing diseases. Consequently, ...