Name: co-immunoprecipitation assay for studying functional interactions between receptors and enzymes
Uploaded: 2018-09-28T15:00:00
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Este projecto foi financiado pelo NIH bolsas 1R01AI125640-01 e a Fundação de pesquisa de Reumatologia.

1. transfecção de células
<ol><li>Células de 293T HEK as sementes em doze placas de 10 cm (5 x 106 células por placa) na véspera do transfection (Figura 1). Realize a contagem de células usando um hemocytometer. Para cada placa, use 10 mL de DMEM suplementado com 10% FBS e 1% penicilina/estreptomicina. Incube a 37 ° C em 5% CO2células.</li>
	<li>Uma vez que as células são 80-90% de confluencia, transfect 5 placas HEK 293T, usando um reagente de Transfeccao ...

<ol>
	<li>Montor, W. R., Salas, A., Melo, F. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+tyrosine+kinases+and+downstream+pathways+as+druggable+targets+for+cancer+treatment:+the+current+arsenal+of+inhibitors.">Receptor tyrosine kinases and downstream pathways as druggable targets for cancer treatment: the current arsenal of inhibitors.</a> Molecular Cancer. 17 (1), (2018).</li><li>Ngoenkam, J., Schamel, W. W., Pongcharoen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selected+signalling+proteins+recruited+to+the+T-cell+receptor-CD3+complex.">Selected signalling proteins recruited to the T-cell receptor-CD3 complex.</a> Immunology. 153 (1), 42-50 (2018).</li><li>Azoulay-Alfaguter, I., Strazza, M., Pedoeem, A., Mor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+coreceptor+programmed+death+1+inhibits+T-cell+adhesion+by+regulating+Rap1.">The coreceptor programmed death 1 inhibits T-cell adhesion by regulating Rap1.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (2), 564-567 (2015).</li><li>Chemnitz, J. M., Parry, R. V., Nichols, K. E., June, C. H., Riley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHP-1+and+SHP-2+associate+with+immunoreceptor+tyrosine-based+switch+motif+of+programmed+death+1+upon+primary+human+T+cell+stimulation,+but+only+receptor+ligation+prevents+T+cell+activation.">SHP-1 and SHP-2 associate with immunoreceptor tyrosine-based switch motif of programmed death 1 upon primary human T cell stimulation, but only receptor ligation prevents T cell activation.</a> The Journal of Immunology. 173 (2), 945-954 (2004).</li><li>Patsoukis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+effects+of+PD-1+on+Akt+and+Ras+pathways+regulate+molecular+components+of+the+cell+cycle+and+inhibit+T+cell+proliferation.">Selective effects of PD-1 on Akt and Ras pathways regulate molecular components of the cell cycle and inhibit T cell proliferation.</a> Science Signaling. 5 (230), 46 (2012).</li><li>Pentcheva-Hoang, T., Chen, L., Pardoll, D. M., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+death-1+concentration+at+the+immunological+synapse+is+determined+by+ligand+affinity+and+availability.">Programmed death-1 concentration at the immunological synapse is determined by ligand affinity and availability.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (45), (2007).</li><li>Yokosuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+death+1+forms+negative+costimulatory+microclusters+that+directly+inhibit+T+cell+receptor+signaling+by+recruiting+phosphatase+SHP2.">Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2.</a> The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1201-1217 (2012).</li><li>Hui, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+costimulatory+receptor+CD28+is+a+primary+target+for+PD-1-mediated+inhibition.">T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition.</a> Science. 355 (6332), 1428-1433 (2017).</li><li>Sheppard, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+inhibits+T-cell+receptor+induced+phosphorylation+of+the+ZAP70/CD3zeta+signalosome+and+downstream+signaling+to+PKCtheta.">PD-1 inhibits T-cell receptor induced phosphorylation of the ZAP70/CD3zeta signalosome and downstream signaling to PKCtheta.</a> FEBS Letters. 574 (1-3), 37-41 (2004).</li><li>Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+immunoreceptor+inhibits+B+cell+receptor-mediated+signaling+by+recruiting+src+homology+2-domain-containing+tyrosine+phosphatase+2+to+phosphotyrosine.">PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (24), 13866-13871 (2001).</li><li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonism+between+binding+site+affinity+and+conformational+dynamics+tunes+alternative+cis-interactions+within+Shp2.">Antagonism between binding site affinity and conformational dynamics tunes alternative cis-interactions within Shp2.</a> Nature Communications. 4, 2037 (2013).</li><li>Peled, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+purification+mass+spectrometry+analysis+of+PD-1+uncovers+SAP+as+a+new+checkpoint+inhibitor.">Affinity purification mass spectrometry analysis of PD-1 uncovers SAP as a new checkpoint inhibitor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), E468-E477 (2018).</li><li>Jang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protein+tyrosine+phosphatase+inhibitor,+pervanadate,+inhibits+angiotensin+II-Induced+beta-arrestin+cleavage.">A protein tyrosine phosphatase inhibitor, pervanadate, inhibits angiotensin II-Induced beta-arrestin cleavage.</a> Molecules and Cells. 28 (1), 25-30 (2009).</li><li>Pluskey, S., Wandless, T. J., Walsh, C. T., Shoelson, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+stimulation+of+SH-PTP2+phosphatase+activity+by+simultaneous+occupancy+of+both+SH2+domains.">Potent stimulation of SH-PTP2 phosphatase activity by simultaneous occupancy of both SH2 domains.</a> The Journal of Biological Chemistry. 270 (7), 2897-2900 (1995).</li><li>McAvoy, T., Nairn, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serine/threonine+protein+phosphatase+assays.">Serine/threonine protein phosphatase assays.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).</li><li>Shlapatska, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD150+association+with+either+the+SH2-containing+inositol+phosphatase+or+the+SH2-containing+protein+tyrosine+phosphatase+is+regulated+by+the+adaptor+protein+SH2D1A.">CD150 association with either the SH2-containing inositol phosphatase or the SH2-containing protein tyrosine phosphatase is regulated by the adaptor protein SH2D1A.</a> The Journal of Immunology. 166 (9), 5480-5487 (2001).</li></ol>

Receptor-enzima interações são cruciais para sinalização intracelular. Muitas enzimas são recrutadas aos receptores através de domínios SH2 vinculando a tyrosines fosforiladas que decoram as caudas dos mesmos receptores. No entanto, enzimas são muitas vezes dobradas em conformações inativas fechadas e ativação requer uma mudança conformacional11 que pode ser mediada por outros domínios do mesmo receptor. O ensaio descrito aqui medidas as interações entre receptores e enzimas, bem ...

Receptores catalíticos e quinase de tirosina do receptor é proteínas transmembrana, na qual a ligação de um ligante extracelular causa atividade enzimática no intracelular lado1. Alguns receptores possuem tanto receptor e funções enzimáticas, enquanto outros recrutam enzimas específicas tais como quinases e fosfatases para sua cauda citoplasmática. Recrutamento de uma enzima, a cauda do receptor e a subsequente ação catalítica desta enzima são dois processos separados que não são sempre regulados pela mesma proteína domínios2. Infelizmente, não há nenhum ferramentas específicas para avaliar a interação e a atividade enzimática em simultâneo. O ensaio funcional co-imunoprecipitação descrito aqui é um método útil para dissecar o recrutamento de uma enzima para a cauda de um receptor de sua ativação. Este ensaio utiliza imunoprecipitação de receptores marcados por grânulos revestidos de anticorpo. Posteriormente, um ensaio de atividade enzimática e análise ocidental do borrão em grânulos são executadas. O objectivo geral deste método é para descobrir quais domínios da proteína são necessários para interações entre receptores e enzimas (avaliadas pela análise ocidental do borrão) e os domínios são obrigatórios para a ativação completa das enzimas (medido por no grânulo ensaio de atividade enzimática). É significativo desenvolver ferramentas para estudar as funções separadas de enzimas associadas do receptor, devido ao seu envolvimento na patogênese de doenças humanas. Além disso, ainda mais, compreender os mecanismos de ação dessas proteínas pode ajudar a concepção de novas intervenções terapêuticas.
Morte programada-1 (PD-1) é um receptor inibitório na superfície de células T e é necessário para limitar a excessiva de células T respostas. Nos últimos anos, os anticorpos anti-PD-1 têm sido implicados no tratamento de várias neoplasias malignas1,2. PD-1 ligadura restringe várias funções de células T, incluindo a proliferação, adesão e secreção de várias citocinas3,4,5. PD-1 está localizada a sinapse imunológica, a interface entre as células T e apresentadoras células6, onde ele colocalizes com os receptores de células T (TCR)7. Posteriormente, a tirosina fosfatase SHP2 [Src homologia 2 (SH2) domínio contendo tirosina fosfatase 2] é recrutado para a cauda citoplasmática da PD-1, levando a dephosphorylation de resíduos tirosina chave dentro complexo TCR e seu associado proximais sinalização moléculas3,4,5,8,9. A cauda citoplasmática da PD-1 contém dois motivos de tirosina, um immunoreceptor baseada em tirosina inibitório do motivo (ITIM) e um immunoreceptor tirosina motivo baseado-switch (ITSM)10. Ambos os motivos são fosforilados sobre PD-1 ligadura9,10. Mutagênese estudos têm revelado um papel primordial para o ITSM no recrutamento, em oposição a ITIM, cujo papel na função e PD-1 sinalização não é claro. SHP24.
SHP2 adota qualquer um fechado (dobrado), inibiu a conformação ou aberto (estendido), conformação ativa11. A contribuição de cada domínio de cauda do PD-1 SHP2 vinculação ou ativação ainda não foi elucidada. Para responder a esta pergunta, nós desenvolvemos um ensaio que permite testar paralelo do recrutamento de SHP2 à cauda da PD-1 e sua atividade12. Utilizamos o co-imunoprecipitação e um ensaio de atividade de fosfatase em grânulo para testar a interação e a atividade enzimática em paralelo. Usando este ensaio, mostramos que o ITSM de PD-1 é suficiente para recrutar SHP2 à cauda da PD-1, enquanto o ITIM de PD-1 é necessária para totalmente estender e ativar a enzima.
Existem muitos receptores que possuem vários domínios adjacentes em sua cauda citoplasmática. O ensaio funcional co-imunoprecipitação pode descobrir o papel de domínios específicos que são necessárias para o recrutamento de proteína ou ativação enzimática.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-516F</td>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424-R</td>
			<td>1.5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated FBS</td>
			<td>Denville</td>
			<td>FB5001-H</td>
			<td>Fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin / Streptomycin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP295950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose without L-glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-614F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFect Transfection Reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>301305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SHP2</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;GFP-agarose</td>
			<td>MBL</td>
			<td>D153-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>118144600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Actin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-1616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK-293 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orthovanadate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>216763</td>
			<td>30%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td>EDTA-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC2676</td>
			<td>Modified Laemmli buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% Tris-Glycine Mini Gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>XP04205BOX</td>
			<td>15-well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membranes</td>
			<td>General Electric</td>
			<td>10600004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td>N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1532</td>
			<td>Dithiothreitol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pNPP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>20-106</td>
			<td>p-Nitrophenyl Phosphate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td>Sodium hydroxide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>23225</td>
			<td>Bi Cinchoninic Acid assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

co-immunoprecipitation assay for studying functional interactions between receptors and enzymes

Receptores associados a enzimas são os principais mediadores de ativação celular. Estas enzimas são regulamentadas, pelo menos em parte, pelas interações físicas com cauda citoplasmática dos receptores de. As interações frequentemente ocorrem através de domínios da proteína específica e resultam em ativação das enzimas. Existem vários métodos para estudar as interações entre proteínas. Enquanto co-imunoprecipitação é comumente usado para estudar os domínios que são necessários para interações da proteína-proteína, existem ensaios sem esse documento a contribuição de domínios específicos para a atividade das enzimas recrutadas ao mesmo tempo. Por conseguinte, o método descrito aqui combina co-imunoprecipitação e um ensaio de atividade enzimática em grânulo para avaliação simultânea das interações entre proteínas e associado da ativação enzimática. O objetivo do presente protocolo é identificar os domínios que são críticos para interações físicas entre uma proteína e enzima e os domínios que são obrigatórios para a completa ativação da enzima. A importância deste teste é demonstrada, como receptor de certo domínios da proteína contribuem para a ligação da enzima para a cauda citoplasmática do receptor, enquanto outros domínios são necessários para regular a função da mesma enzima.

Enquanto a contribuição do ITSM de PD-1 para SHP2 ligação é estabelecida, o papel do ITIM de PD-1 é menos claro. Porque SHP2 tem dois domínios SH2 que podem ligar dois phosphotyrosines sequenciais em PD-1, (uma tirosina no ITSM) e outra no ITIM, formulamos a hipótese que o ITSM de PD-1 Ancora SHP2 PD-1, enquanto o ITIM de PD-1 facilita a atividade SHP2, estabilizando seu Abra o estado conformacional11,14. Para testar isso,...

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Co-imunoprecipitação ensaio para estudar interações funcionais entre receptores e enzimas

Aqui, apresentamos um protocolo para co-imunoprecipitação e um ensaio de atividade enzimática em grânulo para estudar simultaneamente a contribuição de domínios da proteína específica dos receptores de membrana plasmática ao recrutamento de enzima e atividade enzimática.

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo de sinalização celular, como a importância de diferentes domínios proteicos na interação entre enzimas receptoras e ativação enzimática. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite testes concomitantes de interações entre enzimas receptoras e as consequências funcionais dessa interação na atividade enzimápica. Para cada placa, utilize 10 mililitros de DMEM suplementados com 10% FBS e 1%penicilina e estreptomicina.Um dia antes da transfecção, as células embrionárias humanas 293-T em 12 placas de 10 centímetros usando um hemótmetro para contar as células. Incubar a 37 graus Celsius em 5%C02. Uma vez que as células sejam 80 a 90% confluentes, use um agente de transfecção à base de lipídio para transfetar cinco das placas.Realize a transfecção seguindo as instruções do fabricante para células de adesão em placas de 10 centímetros. Em seguida, transfem um segundo conjunto idêntico de cinco placas, juntamente com uma placa adicional servindo como um controle não transtrafetado para a medição da quantidade de proteína expressa antes da imunoprecipitação. Incubar as placas transfeinadas em uma incubadora de cultura tecidual a 37 graus Celsius em 5% de CO2 por 48 horas.Use um microscópio fluorescente para examinar as células para a expressão GFP e garantir que a transfecção tenha ocorrido com sucesso. Misture 15 microlitadores de ortovanadato de sódio de 100 milimolares com 50 microlitadores de peróxido de hidrogênio de 30% para preparar uma mistura fresca de pervanadato. Para fosforilar as versões marcadas do PD-1, remova a mídia das células transfecidas PD-1-GFP.Adicione 10 mililitros de DMEM simples e 10 microliters de pervanadate a cada placa. Incubar no escuro à temperatura ambiente por 15 minutos. Depois disso, lave as células três vezes em PBS gelado usando cinco mililitros de PBS por lavagem.Durante a realização da imunoprecipitação, todas as etapas devem ser realizadas no gelo ou em quatro graus Celsius. Suplemente o tampão de lise com inibidores de protease dissolvendo um comprimido dos inibidores em 10 mililitros de tampão. Adicione também um milimão de ortovanadato de sódio ao tampão que será usado nas placas transfecidas PD-1-GFP.Adicione 500 microliters de tampão de lise gelada às células, certificando-se de adicionar o tampão de lise contendo a ortovanadate de sódio apenas às placas contendo células transfectadas PD-1-GFP. Use um raspador de células para remover imediatamente e coletar as células das placas. Transfira os lises em tubos frios de 1,5 mililitro e gire-os a 0,005 vezes a gravidade e a quatro graus Celsius por 30 minutos.Para coletar o supernanato pós-núcleo dos lises, gire-os a 10.000 vezes a gravidade e quatro graus Celsius por 10 minutos. Transfira os supernantes em novos tubos e descarte a pelota. Armazene os supernacantes para o segundo conjunto de seis placas no gelo para análise posterior do WCL.Para começar a preparar contas anti-GFP, agite suavemente a garrafa contendo as contas antes de abrir para evitar a fixação. Remova 40 microliters das contas anti-GFP do chorume por cada condição. Centrífuga a 500 vezes a gravidade e 4 graus Celsius por três minutos.Remova o supernatante para lavar as contas, certificando-se de minimizar o contato entre a pipeta e as contas para evitar perdas. Resuspenja as contas em 80 microliters de tampão de lise por amostra. Adicione as contas lavadas diretamente ao lisecelular das células expressas PD-1-GFP do primeiro conjunto de quatro placas.Gire a 0,005 vezes a gravidade por 30 minutos a quatro graus Celsius para imunoprecipitar as proteínas marcadas pelo GFP. Lave as contas três vezes usando um mililitro de tampão de lise fria que não contenha ortovanadato para cada lavagem. Em seguida, centrífuga a 2.500 vezes gravidade por 10 segundos.Divida o lise do SHP2 ativo do primeiro conjunto de placas em três porções iguais e adicione uma porção a cada um dos três tubos contendo as contas que contêm PD-1-GFP lavadas. Adicione 1/3 do volume de lise das células não transtravadas ao segundo tubo das contas de PD-1-GFP do tipo selvagem. Descarte o 2/3 restante.Incubar as contas por quatro horas a quatro graus Celsius com rotação suave a 0,005 vezes a gravidade. Depois disso, lave as contas duas vezes usando um mililitro de tampão de lise fria para cada lavagem. Adicione 80 microliters de tampão de lise a cada amostra, garantindo que o volume total em cada tubo seja de 100 microliters.Usando uma ponta de pipeta cortada, pipeta suavemente para cima e para baixo para misturar. Em seguida, transfira 50 microliters de cada tubo em dois tubos frescos, frescos, 1,5 mililitros. Lave as contas uma vez com tampão de lavagem de fosfatase.Em seguida, remova o supernatante completamente. Adicione 100 microliters de tampão de ensaio às contas e incubar a 30 graus Celsius por 30 minutos sob suave agitação. Quando o tampão ficar amarelo, termine a reação adicionando 50 microliters de uma solução molar de hidróxido de sódio.Centrífuga a 2.500 vezes a gravidade por 10 segundos. Depois disso, transfira o supernatante para dois poços de meia área em uma placa de 96 poços. Leia os absorventes em 405 nanômetros e expresse os resultados como densidade óptica relativa sobre a versão de controle do tipo selvagem do PD-1-GFP.Primeiro gire as contas a 2.000 vezes a gravidade e quatro graus Celsius por 30 segundos e remova o supernaspe. Adicione 20 microliters de duas vezes tampão Laemmli e ferva a 95 graus Celsius por cinco minutos. Utilizando um kit BCA, meça a concentração proteica dos controles de entrada.Transfira 30 microliters da amostra mais diluída para um novo tubo. Use tampão de lise para diluir o resto dos controles de entrada para a mesma concentração da amostra mais diluída. Em seguida, transfira 30 microliters de cada um dos controles de entrada diluídos para um novo tubo.Adicione volumes iguais de dois vezes tampão laemmli aos lises e ferva-os 95 graus Celsius por cinco minutos. Depois disso, gire as contas a 2.000 vezes a gravidade e quatro graus Celsius por 30 segundos antes de realizar a análise do Western Blot, conforme descrito no protocolo de texto. Neste estudo, desenvolve-se um ensaio combinado de co-imunoprecipitação e atividade enzimática para a avaliação paralela das interações e ativações das enzimas receptoras.Sem surpresa, o SHP2 não se vinculou ao PD-1 quando o ITSM sofreu mutação. Notavelmente, a versão mutante do ITIM inibiu a ligação SHP2 apenas em uma extensão limitada. No entanto, o ensaio de atividade SHP2-fosfates revela que o ITIM e o ITSM são igualmente indispensáveis para a atividade enzimática.Isso revela um modelo de ativação de duas etapas no qual o SHP2 é dobrado em uma conformação autoinibida em condições de repouso. Após a ativação do PD-1, o SHP2 é recrutado para o ITSM fosforilado. No entanto, o ITIM também deve ser fosfoilado para desdobrar SHP2 em sua conformação ativa.Após seu desenvolvimento, essa técnica pode abrir caminho para pesquisadores do campo da sinalização celular explorarem a função dos domínios proteicos nas interações receptor-enzimas.

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Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein (Video) | JoVE

Co-imunoprecipitação da proteína do rato Mx1 com a nucleoproteína do vírus da gripe A

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease (Video) | JoVE

Ensaio de adesão dinâmico para a análise funcional das terapias antiaderência na doença inflamatória intestinal

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions (Video) | JoVE

Uso complementar de técnicas microscópicas e leitura de fluorescência no estudo de Cryptococcus-Amoeba interações

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

Spore Adsorption as a Nonrecombinant Display System for Enzymes and Antigens

Spore Adsorption as a Nonrecombinant Display System for Enzymes and Antigens (Video) | JoVE

Adsorção de esporos, como um sistema de exibição Nonrecombinant por enzimas e antígenos

The bacterial spore is a metabolically quiescent cell, formed by a series of protective layers surrounding a dehydrated cytoplasm. This peculiar structure ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium (Video) | JoVE

Colonoid humana monocamadas para estudar interações entre epitélio Intestinal do hospedeiro, comensais e patógenos

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...