Name: co-immunoprecipitation assay for studying functional interactions between receptors and enzymes
Uploaded: 2018-09-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes at JoVE.com

Этот проект финансировался NIH грантов 1R01AI125640-01 и ревматологии исследовательский фонд.

1. transfection клеток
<ol><li>Семя ГЭС 293T клетки в двенадцать 10 см пластины (5 х 106 клеток на пластину) за день до трансфекции (рис. 1). Выполните подсчет клеток с помощью Горяева. Для каждой пластины используйте 10 мл DMEM дополнена 10% FBS и 1% пенициллина/стрептомицина. Инкубируйте ?...

<ol>
	<li>Montor, W. R., Salas, A., Melo, F. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+tyrosine+kinases+and+downstream+pathways+as+druggable+targets+for+cancer+treatment:+the+current+arsenal+of+inhibitors.">Receptor tyrosine kinases and downstream pathways as druggable targets for cancer treatment: the current arsenal of inhibitors.</a> Molecular Cancer. 17 (1), (2018).</li><li>Ngoenkam, J., Schamel, W. W., Pongcharoen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selected+signalling+proteins+recruited+to+the+T-cell+receptor-CD3+complex.">Selected signalling proteins recruited to the T-cell receptor-CD3 complex.</a> Immunology. 153 (1), 42-50 (2018).</li><li>Azoulay-Alfaguter, I., Strazza, M., Pedoeem, A., Mor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+coreceptor+programmed+death+1+inhibits+T-cell+adhesion+by+regulating+Rap1.">The coreceptor programmed death 1 inhibits T-cell adhesion by regulating Rap1.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (2), 564-567 (2015).</li><li>Chemnitz, J. M., Parry, R. V., Nichols, K. E., June, C. H., Riley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHP-1+and+SHP-2+associate+with+immunoreceptor+tyrosine-based+switch+motif+of+programmed+death+1+upon+primary+human+T+cell+stimulation,+but+only+receptor+ligation+prevents+T+cell+activation.">SHP-1 and SHP-2 associate with immunoreceptor tyrosine-based switch motif of programmed death 1 upon primary human T cell stimulation, but only receptor ligation prevents T cell activation.</a> The Journal of Immunology. 173 (2), 945-954 (2004).</li><li>Patsoukis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+effects+of+PD-1+on+Akt+and+Ras+pathways+regulate+molecular+components+of+the+cell+cycle+and+inhibit+T+cell+proliferation.">Selective effects of PD-1 on Akt and Ras pathways regulate molecular components of the cell cycle and inhibit T cell proliferation.</a> Science Signaling. 5 (230), 46 (2012).</li><li>Pentcheva-Hoang, T., Chen, L., Pardoll, D. M., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+death-1+concentration+at+the+immunological+synapse+is+determined+by+ligand+affinity+and+availability.">Programmed death-1 concentration at the immunological synapse is determined by ligand affinity and availability.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (45), (2007).</li><li>Yokosuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+death+1+forms+negative+costimulatory+microclusters+that+directly+inhibit+T+cell+receptor+signaling+by+recruiting+phosphatase+SHP2.">Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2.</a> The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1201-1217 (2012).</li><li>Hui, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+costimulatory+receptor+CD28+is+a+primary+target+for+PD-1-mediated+inhibition.">T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition.</a> Science. 355 (6332), 1428-1433 (2017).</li><li>Sheppard, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+inhibits+T-cell+receptor+induced+phosphorylation+of+the+ZAP70/CD3zeta+signalosome+and+downstream+signaling+to+PKCtheta.">PD-1 inhibits T-cell receptor induced phosphorylation of the ZAP70/CD3zeta signalosome and downstream signaling to PKCtheta.</a> FEBS Letters. 574 (1-3), 37-41 (2004).</li><li>Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+immunoreceptor+inhibits+B+cell+receptor-mediated+signaling+by+recruiting+src+homology+2-domain-containing+tyrosine+phosphatase+2+to+phosphotyrosine.">PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (24), 13866-13871 (2001).</li><li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonism+between+binding+site+affinity+and+conformational+dynamics+tunes+alternative+cis-interactions+within+Shp2.">Antagonism between binding site affinity and conformational dynamics tunes alternative cis-interactions within Shp2.</a> Nature Communications. 4, 2037 (2013).</li><li>Peled, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+purification+mass+spectrometry+analysis+of+PD-1+uncovers+SAP+as+a+new+checkpoint+inhibitor.">Affinity purification mass spectrometry analysis of PD-1 uncovers SAP as a new checkpoint inhibitor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), E468-E477 (2018).</li><li>Jang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protein+tyrosine+phosphatase+inhibitor,+pervanadate,+inhibits+angiotensin+II-Induced+beta-arrestin+cleavage.">A protein tyrosine phosphatase inhibitor, pervanadate, inhibits angiotensin II-Induced beta-arrestin cleavage.</a> Molecules and Cells. 28 (1), 25-30 (2009).</li><li>Pluskey, S., Wandless, T. J., Walsh, C. T., Shoelson, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+stimulation+of+SH-PTP2+phosphatase+activity+by+simultaneous+occupancy+of+both+SH2+domains.">Potent stimulation of SH-PTP2 phosphatase activity by simultaneous occupancy of both SH2 domains.</a> The Journal of Biological Chemistry. 270 (7), 2897-2900 (1995).</li><li>McAvoy, T., Nairn, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serine/threonine+protein+phosphatase+assays.">Serine/threonine protein phosphatase assays.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).</li><li>Shlapatska, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD150+association+with+either+the+SH2-containing+inositol+phosphatase+or+the+SH2-containing+protein+tyrosine+phosphatase+is+regulated+by+the+adaptor+protein+SH2D1A.">CD150 association with either the SH2-containing inositol phosphatase or the SH2-containing protein tyrosine phosphatase is regulated by the adaptor protein SH2D1A.</a> The Journal of Immunology. 166 (9), 5480-5487 (2001).</li></ol>

Рецептор фермента взаимодействия имеют решающее значение для внутриклеточная сигнализация. Многие ферменты набираются через SH2 доменов, привязка к фосфорилированных tyrosines, которые украшают хвосты же рецепторов рецепторы. Однако ферментов часто складывают в закрытых неактивной конфо...

Трансмембранные белки, в которых привязка внеклеточных лигандов вызывает ферментативную активность на внутриклеточную сторона1каталитического рецепторов и рецепторов тирозин киназы. Некоторые приемные устройства обладают рецепторов и ферментативные функции, в то время как другие набирать специфических ферментов как киназы и фосфатаз в их цитоплазматических хвосты. Набор фермента рецептор хвост и последующих каталитического действия этого фермента являются два отдельных процессов, которые не всегда регулируются же домены белка2. К сожалению Есть нет конкретных инструментов для оценки взаимодействия и ферментативную активность одновременно. Assay функциональные co иммунопреципитация, описанные здесь является полезным методом вскрыть вербовки фермента к хвосту рецепторов от ее активации. Этот assay иммунопреципитации тегами рецепторов использует антителами бисером. Впоследствии выполняются ферментативную активность пробирного и Западный анализ помаркой на бусины. Общая цель этого метода является выявить, какие домены белка, необходимые для взаимодействия между рецепторами и ферментов (оценены Западный анализ помаркой) и какие домены являются обязательными для полной активации ферментов (измеряется на шарик Ферментативная активность проба). Важно разработать инструменты для изучения отдельных функций рецептор связанных ферментов из-за их участие в патогенезе заболеваний человека. Кроме того дальнейшее понимание механизмов действий этих белков может помочь дизайн роман терапевтических вмешательств.
Запрограммированной смерти-1 (PD-1) является ингибирующее рецепторами на поверхности клеток T и требуется для ограничения чрезмерного Т-клеток ответов. В последние годы антитела анти PD-1 были вовлечены в лечении множественные злокачественные опухоли1,2. PD-1 перешнуровка сдерживает многочисленные функции Т-клеток, включая распространения, адгезии и секрецию несколько цитокинов3,,4-5. PD-1 локализован для иммунологических синапса, интерфейс между Т-клеток и антиген представляющих клеток6, где он colocalizes с Т клеточных рецепторов (TCR)7. Впоследствии, тирозин фосфатазы SHP2 [Src гомологии 2 (Ш2) домена, содержащие тирозин фосфатазы 2] набирается цитоплазматических хвост PD-1, приводит к dephosphorylation остатков ключевых тирозина в рамках комплекса TCR и его связанные проксимальной сигнальные молекулы3,4,5,8,9. Цитоплазматических хвост PD-1 содержит два мотивы тирозин, immunoreceptor на основе тирозин ингибирующее мотив (ITIM) и immunoreceptor тирозин основе переключатель мотив (ITSM)10. Обе мотивы фосфорилированных на PD-1 перешнуровка9,10. Мутагенез исследования показали основную роль для ITSM вербовка, в отличие от ITIM, чья роль в PD-1 сигнализации и функция не ясно SHP24.
SHP2 принимает либо закрытые (сложить), ингибирует конформации или открытой (расширенный), активной конформации11. Вклад каждого домена хвост PD-1 SHP2 привязки или активации пока не выяснены. Чтобы ответить на этот вопрос, мы разработали assay который позволяет параллельно тестирования набор SHP2 к хвосту PD-1 и его деятельность12. Мы использовали co иммунопреципитация и assay активности фосфатазы на шарик для тестирования взаимодействия и ферментативной активности параллельно. С помощью этого анализа, мы покажем, что ITSM PD-1 достаточно набрать SHP2 к хвосту PD-1, в то время как ITIM PD-1 необходимо в полной мере распространить и активировать энзим.
Есть много рецепторов, которые имеют несколько смежных доменов в их цитоплазматических хвосты. Функциональные co иммунопреципитация assay может раскрыть роль определенных доменов, которые необходимы для белка вербовки или ферментативной активации.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-516F</td>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424-R</td>
			<td>1.5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated FBS</td>
			<td>Denville</td>
			<td>FB5001-H</td>
			<td>Fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin / Streptomycin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP295950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose without L-glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-614F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFect Transfection Reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>301305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SHP2</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;GFP-agarose</td>
			<td>MBL</td>
			<td>D153-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>118144600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Actin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-1616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK-293 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orthovanadate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>216763</td>
			<td>30%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td>EDTA-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC2676</td>
			<td>Modified Laemmli buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% Tris-Glycine Mini Gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>XP04205BOX</td>
			<td>15-well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membranes</td>
			<td>General Electric</td>
			<td>10600004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td>N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1532</td>
			<td>Dithiothreitol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pNPP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>20-106</td>
			<td>p-Nitrophenyl Phosphate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td>Sodium hydroxide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>23225</td>
			<td>Bi Cinchoninic Acid assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

co-immunoprecipitation assay for studying functional interactions between receptors and enzymes

Рецептор связанных ферментов являются основными посредниками клеточных активации. Эти ферменты, регулируются, по крайней мере в части, физических взаимодействий с хвостами цитоплазматических рецепторов. Взаимодействия часто происходят через конкретные белка доменов и привести к активации ферментов. Существует несколько методов для изучения взаимодействия белков. В то время как co иммунопреципитация обычно используется для изучения домены, которые требуются для взаимодействий протеин протеина, есть без анализов, этот документ вклад конкретных доменов на активность ферментов, набранных в то же время. Соответственно метод, описанный здесь сочетает в себе co иммунопреципитация и ферментативную активность на шарик assay для одновременной оценки взаимодействия белков и связанные ферментативной активации. Цель настоящего Протокола заключается в идентификации доменов, которые являются критическими для физических взаимодействий между белков и ферментов и домены, которые являются обязательными для полной активации фермента. Продемонстрировал важное значение этот assay, как некоторые рецептор доменов протеина вклад связывание фермента цитоплазматических хвост рецептора, в то время как другие домены необходимо регулировать функции же фермент.

Хотя вклад ITSM PD-1 SHP2 связывание устанавливается, роль ITIM PD-1 менее ясно. Поскольку SHP2 имеет два SH2 доменов, которые можно привязать к двум последовательным phosphotyrosines PD-1 (один тирозина в ITSM), а другой в ITIM, мы предположили, что ITSM PD-1 якорей SHP2 PD-1, в то время как ITIM PD-1 облегчает SH...

Watch this Scientific Journal Video about Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes at JoVE.com

Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes

Co Иммунопреципитация Assay для изучения функционального взаимодействия между рецепторами и ферменты

Здесь мы представляем собой протокол для co иммунопреципитация и ферментативную активность на шарик assay одновременно изучать вклад доменов конкретных протеина плазматической мембраны рецепторов фермента вербовки и активность фермента.

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области сигнализации клеток, такие как важность различных белковых областей в взаимодействии ферментов рецепторов и ферментной активации. Основным преимуществом этой методики является то, что она позволяет сопутствуя тестированию взаимодействия ферментов рецепторов и функциональных последствий этого взаимодействия на активность фермента. Для каждой пластины используйте 10 миллилитров DMEM, дополненных 10%FBS и 1%пенициллином и стрептомицином.За день до трансфекции семенная эмбриональная почка человека 293-Т-клетки в 12 10-сантиметровых пластин с использованием гемоцитометра для подсчета клеток. Инкубация при 37 градусах по Цельсию в 5%C02. После того, как клетки от 80 до 90% стечения, использовать липид на основе трансфекции агента для трансфекции пять пластин.Выполните трансфекцию в соответствии с инструкциями производителя по присоединению ячеек в 10-сантиметровых пластинах. Затем трансфект идентичный второй набор из пяти пластин вместе с одной дополнительной пластиной, выступающей в качестве нетрансфицированного контроля для измерения выраженного количества белка до иммунопреципиентации. Инкубировать трансфицированные пластины в инкубаторе культуры тканей при 37 градусах по Цельсию в 5%CO2 в течение 48 часов.Используйте флуоресцентный микроскоп для изучения клеток для экспрессии GFP и обеспечения трансфекции успешно произошло. Смешайте 15 микролитров 100-миллимолярной ортованата натрия с 50 микролитров 30%перекиси водорода, чтобы подготовить свежую смесь перванадата. Для фосфорилировать помеченные версии PD-1, удалить средства массовой информации из PD-1-GFP трансфицированных клеток.Добавьте 10 миллилитров простого DMEM и 10 микролитров перваната к каждой пластине. Инкубировать в темноте при комнатной температуре в течение 15 минут. После этого, мыть клетки три раза в ледяной PBS с помощью пяти миллилитров PBS за стирку.При выполнении иммунопреципиентации все шаги должны выполняться либо на льду, либо при четырех градусах Цельсия. Дополнить буфер лиза ингибиторами протеазы, растворив одну таблетку ингибиторов в 10 миллилитров буфера. Кроме того, добавить один миллимоляр натрия ортованадат в буфер, который будет использоваться на PD-1-GFP-трансфицированных пластин.Добавьте 500 микролитров ледяного буфера лиза в клетки, убедившись, что добавить буфер лиза, содержащий ортованата натрия только пластины, содержащие PD-1-GFP-трансфицированных клеток. Используйте сотовый скребок, чтобы немедленно удалить и собрать клетки из пластин. Перенесите лисаты в 1,5-миллилитровые холодные трубки и поверните их в 0,005 раза тяжести и при четырех градусах Цельсия в течение 30 минут.Чтобы собрать супернатант после ядра из ликатов, вращайте их вниз при 10 000 раз гравитации и четырех градусах по Цельсию в течение 10 минут. Перенесите супернатанты в новые трубки и отбросьте гранулы. Храните супернатанты для второго набора из шести пластин на льду для более длительного анализа WCL.Чтобы начать подготовку анти-GFP бусы, осторожно встряхните бутылку, содержащую бисер перед открытием, чтобы предотвратить урегулирование. Удалите 40 микролитров анти-GFP шарики из суспензии на каждое условие. Центрифуга при 500-времени гравитации и четыре градуса по Цельсию в течение трех минут.Удалите супернатант для мытья бисера, убедившись, чтобы свести к минимуму контакт между пипеткой и бисером, чтобы предотвратить потерю. Перепродюсатор бисера в 80 микролитров буфера лиза на образец. Добавьте вымытые бусы непосредственно в лизат клетки из клеток PD-1-GFP-экспрессии первого набора из четырех пластин.Поверните в 0,005 раза тяжести в течение 30 минут при четырех градусах по Цельсию, чтобы иммунопреципилитировать GFP-тегами белков. Вымойте бисер три раза, используя один миллилитр холодного лиза буфера, который не содержит ортованата для каждого мытья. Затем центрифуга при 2500 раз больше гравитации в течение 10 секунд.Разделите лизат активного SHP2 из первого набора пластин на три равные части и добавьте часть к каждой из трех трубок, содержащих промытые PD-1-GFP-содержащие бусы. Добавьте 1/3 объема лизита из нетрансфицированных клеток во вторую трубку дикого типа, PD-1-GFP шарики. Отбросьте оставшиеся 2/3.Инкубировать бисер в течение четырех часов при четырех градусах по Цельсию с нежным вращением в 0,005 раза тяжести. После этого, мыть бисер в два раза с помощью одного миллилитра холодного лиза буфера для каждого мытья. Добавьте 80 микролитров буфера лиза в каждый образец, гарантируя, что общий объем в каждой трубке составляет 100 микролитров.Используя наконечник пипетки, пипетку аккуратно вверх и вниз, чтобы смешать. Затем перенесите 50 микролитров из каждой трубки в две, свежие, 1,5 миллилитровые трубки. Вымойте бисер один раз с фосфатазы мыть буфер.Затем удалите супернатант полностью. Добавьте 100 микролитров буфера анализа в бисер и инкубировать при 30 градусах по Цельсию в течение 30 минут под нежным возбуждением. Когда буфер желтеет, прекратите реакцию, добавив 50 микролитров одного молярного раствора гидроксида натрия.Центрифуга при 2500 раз больше гравитации в течение 10 секунд. После этого перенесите супернатант на две скважины половины площади в пластине из 96 скважин. Прочитайте абсорбенты на 405 нанометров и выразить результаты, как относительная оптическая плотность над контролем дикого типа версии PD-1-GFP.Первый спина вниз шарики на 2000 раз тяжести и четыре градуса по Цельсию в течение 30 секунд и удалить супернатант. Добавьте 20 микролитров в два раза буфер Laemmli и кипятить при 95 градусов по Цельсию в течение пяти минут. Используя комплект BCA, измерьте концентрацию протеина управления входного сигнала.Перенесите 30 микролитров наиболее разбавленного образца в новую трубку. Используйте буфер лиза, чтобы разбавить остальные элементы управления ввода до той же концентрации, что и наиболее разбавленный образец. Затем перенесите 30 микролитров каждого из разбавленных элементов управления ввода в новую трубку.Добавить равные объемы в два раза Laemmli буфер лизирует и варить их 95 градусов по Цельсию в течение пяти минут. После этого, спина вниз бисера в 2000 раз тяжести и четыре градуса по Цельсию в течение 30 секунд, прежде чем выполнять анализ западной пятно, как указано в текстовом протоколе. В этом исследовании для параллельной оценки взаимодействий и активации рецепторов разработан комбинированный анализ ко-иммунопреципиентации и ферментной активности.Неудивительно, что SHP2 не удалось связать с PD-1, когда ITSM мутировал. Примечательно, что мутантная версия ITIM препятствовала связыванию SHP2 лишь в ограниченной степени. Тем не менее, анализ активности SHP2-phosphatase показывает, что ITIM и ITSM одинаково незаменимы для энзиматической деятельности.Это показывает двухшаговую модель активации, в которой SHP2 складывается в автоматическую конформацию в условиях покоя. После активации PD-1, SHP2 набирается в фосфорилированных ITSM. Тем не менее, ITIM также должны быть фосфорилированы, чтобы развернуть SHP2 в его активной конформации.После его развития, этот метод может проложить путь для исследователей в области сигнализации клеток, чтобы исследовать функцию белковых доменов в рецепторно-ферментных взаимодействий.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

Анализ кальция Биолюминесценция для функционального анализа Mosquito ( Aedes aegypti) И Tick ( Rhipicephalus MicroPlus) G-белком рецепторы

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes.  The ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Мониторинг дендритных клеток с использованием миграции<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H Магнитно-резонансная томография

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

Изучение взаимодействий<em&gt; Золотистый стафилококк</em&gt; С нейтрофилами с помощью проточной цитометрии и микроскопии Длительная

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

Роман<em&gt; В пробирке</em&gt; Модель для изучения взаимодействия между человеческим цельной крови и эндотелия

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Обнаружение гликогена в мононуклеарных клеток периферической крови с йодной кислотой Шиффа окрашивания

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Co-иммунопреципитации белка мыши MX1 с вирусом гриппа А нуклеопротеидную

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Адгезию динамической Assay для функционального анализа антиадгезионное терапии в воспалительных заболеваний кишечника

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

Дополнительное использование микроскопических методов и флуоресценции Чтение в изучении Cryptococcus-Amoeba Взаимодействия

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Человеческого Colonoid монослои для изучения взаимодействия между патогенов, Комменсалами и принимающих кишечного эпителия

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...

Analysis of Interactions between Endobiotics and Human Gut Microbiota Using In Vitro Bath Fermentation Systems

Анализ взаимодействия между эндобиотики и человека кишки микробиоты использованием в пробирке ванны системы брожения

Human intestinal microorganisms have recently become an important target of research in promoting human health and preventing diseases. Consequently, ...