Name: co-immunoprecipitation assay for studying functional interactions between receptors and enzymes
Uploaded: 2018-09-28T15:00:00
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Este proyecto fue financiado por subvenciones de NIH 1R01AI125640-01 y la Fundación de investigación de reumatología.

1. transfección de células
<ol><li>La semilla células HEK 293T en doce placas de 10 cm (5 x 106 células por placa) el día antes de transfección (figura 1). Realizar el conteo de células usando un hemocitómetro. Para cada placa, use 10 mL de DMEM suplementado con 10% de SBF y el 1% de penicilina/estreptomicina. Incube las células a 37 ° C en 5% CO2.</li>
	<li>Una vez que las células son 80-90% confluente, transfectar 5 placas HEK 293T utilizando un reactivo ...

<ol>
	<li>Montor, W. R., Salas, A., Melo, F. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+tyrosine+kinases+and+downstream+pathways+as+druggable+targets+for+cancer+treatment:+the+current+arsenal+of+inhibitors.">Receptor tyrosine kinases and downstream pathways as druggable targets for cancer treatment: the current arsenal of inhibitors.</a> Molecular Cancer. 17 (1), (2018).</li><li>Ngoenkam, J., Schamel, W. W., Pongcharoen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selected+signalling+proteins+recruited+to+the+T-cell+receptor-CD3+complex.">Selected signalling proteins recruited to the T-cell receptor-CD3 complex.</a> Immunology. 153 (1), 42-50 (2018).</li><li>Azoulay-Alfaguter, I., Strazza, M., Pedoeem, A., Mor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+coreceptor+programmed+death+1+inhibits+T-cell+adhesion+by+regulating+Rap1.">The coreceptor programmed death 1 inhibits T-cell adhesion by regulating Rap1.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (2), 564-567 (2015).</li><li>Chemnitz, J. M., Parry, R. V., Nichols, K. E., June, C. H., Riley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHP-1+and+SHP-2+associate+with+immunoreceptor+tyrosine-based+switch+motif+of+programmed+death+1+upon+primary+human+T+cell+stimulation,+but+only+receptor+ligation+prevents+T+cell+activation.">SHP-1 and SHP-2 associate with immunoreceptor tyrosine-based switch motif of programmed death 1 upon primary human T cell stimulation, but only receptor ligation prevents T cell activation.</a> The Journal of Immunology. 173 (2), 945-954 (2004).</li><li>Patsoukis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+effects+of+PD-1+on+Akt+and+Ras+pathways+regulate+molecular+components+of+the+cell+cycle+and+inhibit+T+cell+proliferation.">Selective effects of PD-1 on Akt and Ras pathways regulate molecular components of the cell cycle and inhibit T cell proliferation.</a> Science Signaling. 5 (230), 46 (2012).</li><li>Pentcheva-Hoang, T., Chen, L., Pardoll, D. M., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+death-1+concentration+at+the+immunological+synapse+is+determined+by+ligand+affinity+and+availability.">Programmed death-1 concentration at the immunological synapse is determined by ligand affinity and availability.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (45), (2007).</li><li>Yokosuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+death+1+forms+negative+costimulatory+microclusters+that+directly+inhibit+T+cell+receptor+signaling+by+recruiting+phosphatase+SHP2.">Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2.</a> The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1201-1217 (2012).</li><li>Hui, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+costimulatory+receptor+CD28+is+a+primary+target+for+PD-1-mediated+inhibition.">T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition.</a> Science. 355 (6332), 1428-1433 (2017).</li><li>Sheppard, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+inhibits+T-cell+receptor+induced+phosphorylation+of+the+ZAP70/CD3zeta+signalosome+and+downstream+signaling+to+PKCtheta.">PD-1 inhibits T-cell receptor induced phosphorylation of the ZAP70/CD3zeta signalosome and downstream signaling to PKCtheta.</a> FEBS Letters. 574 (1-3), 37-41 (2004).</li><li>Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+immunoreceptor+inhibits+B+cell+receptor-mediated+signaling+by+recruiting+src+homology+2-domain-containing+tyrosine+phosphatase+2+to+phosphotyrosine.">PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (24), 13866-13871 (2001).</li><li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonism+between+binding+site+affinity+and+conformational+dynamics+tunes+alternative+cis-interactions+within+Shp2.">Antagonism between binding site affinity and conformational dynamics tunes alternative cis-interactions within Shp2.</a> Nature Communications. 4, 2037 (2013).</li><li>Peled, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+purification+mass+spectrometry+analysis+of+PD-1+uncovers+SAP+as+a+new+checkpoint+inhibitor.">Affinity purification mass spectrometry analysis of PD-1 uncovers SAP as a new checkpoint inhibitor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), E468-E477 (2018).</li><li>Jang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protein+tyrosine+phosphatase+inhibitor,+pervanadate,+inhibits+angiotensin+II-Induced+beta-arrestin+cleavage.">A protein tyrosine phosphatase inhibitor, pervanadate, inhibits angiotensin II-Induced beta-arrestin cleavage.</a> Molecules and Cells. 28 (1), 25-30 (2009).</li><li>Pluskey, S., Wandless, T. J., Walsh, C. T., Shoelson, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+stimulation+of+SH-PTP2+phosphatase+activity+by+simultaneous+occupancy+of+both+SH2+domains.">Potent stimulation of SH-PTP2 phosphatase activity by simultaneous occupancy of both SH2 domains.</a> The Journal of Biological Chemistry. 270 (7), 2897-2900 (1995).</li><li>McAvoy, T., Nairn, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serine/threonine+protein+phosphatase+assays.">Serine/threonine protein phosphatase assays.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).</li><li>Shlapatska, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD150+association+with+either+the+SH2-containing+inositol+phosphatase+or+the+SH2-containing+protein+tyrosine+phosphatase+is+regulated+by+the+adaptor+protein+SH2D1A.">CD150 association with either the SH2-containing inositol phosphatase or the SH2-containing protein tyrosine phosphatase is regulated by the adaptor protein SH2D1A.</a> The Journal of Immunology. 166 (9), 5480-5487 (2001).</li></ol>

Interacciones receptor-enzima están cruciales para la señalización intracelular. Muchas enzimas son reclutadas a los receptores a través de dominios SH2 a tirosinas fosforiladas que decoran las colas de los mismos receptores. Sin embargo, enzimas se doblan a menudo en conformaciones inactivos cerrados, y la activación requiere un cambio conformacional11 que puede estar mediado por otros dominios del receptor del mismo. El ensayo descrito aquí medidas de las interacciones entre receptores y e...

Receptores catalíticos y cinasas de tirosina de receptores son proteínas transmembranales en la que la Unión de un ligando extracelular provoca actividad enzimática en el lado intracelular1. Algunos receptores poseen receptores y funciones enzimáticas, mientras que otros reclutan las enzimas específicas como las quinasas y fosfatasas que sus colas citoplásmicas. Contratación de una enzima a la cola del receptor y la acción catalítica de esta enzima son dos procesos separados que no siempre están regulados por la misma proteína dominios2. Por desgracia, hay no hay herramientas específicas para evaluar la interacción y la actividad enzimática al mismo tiempo. El ensayo funcional co-inmunoprecipitación se describe aquí es un método útil para disecar la contratación de una enzima a la cola de un receptor de su activación. Este ensayo utiliza inmunoprecipitación de receptores etiquetados granos recubiertos de anticuerpos. Posteriormente, un ensayo de actividad enzimática y la mancha blanca /negra occidental análisis en granos se llevan a cabo. El objetivo general de este método es descubrir qué dominios de proteína son necesarios para las interacciones entre los receptores y enzimas (determinadas por análisis de western blot) y qué dominios son obligatorios para la completa activación de las enzimas (medido por el cordón ensayo de actividad enzimática). Es importante desarrollar herramientas para el estudio de las funciones separadas de enzimas asociado a receptor debido a su participación en la patogenia de enfermedades humanas. Por otra parte, la mayor comprensión de los mecanismos de acción de estas proteínas puede ayudar el diseño de nuevas intervenciones terapéuticas.
Muerte programada-1 (PD-1) es un receptor inhibitorio en la superficie de las células de T y es necesaria para limitar el excesivo T cell responses. En los últimos años, se han implicado anticuerpos anti-PD-1 en el tratamiento de múltiples tumores malignos1,2. PD-1 ligadura refrena numerosas funciones de la célula de T, incluyendo la proliferación, adhesión y secreción de varias citoquinas3,4,5. PD-1 se localiza en la sinapsis inmunológica, la interfaz entre las células T y células presentadoras de antígeno6, donde colocalizes con el receptor de células T (TCR)7. Posteriormente, la tirosina fosfatasa SHP2 [homología Src 2 (SH2) dominio que contiene tirosina fosfatasa 2] es reclutado a la cola citoplasmática de PD-1, conduce a la desfosforilación de residuos claves de tirosina dentro el complejo TCR y su asociado proximal señalización de moléculas3,4,5,8,9. La cola citoplasmática de PD-1 contiene dos motivos de tirosina, un immunoreceptor basados en tirosina inhibidor adorno (ITIM) y un immunoreceptor tyrosine interruptor basado en motif (ITSM)10. Ambos motivos son fosforiladas en PD-1 ligadura9,10. Estudios de mutagénesis han revelado un papel primordial para el ITSM en el reclutamiento, a diferencia de ITIM, cuyo papel en la señalización de PD-1 y la función no está clara de SHP24.
SHP2 adopta sea un cerrado (doblado), inhibió la conformación o abierto (extendido), conformación activa11. La contribución de cada dominio de la cola de PD-1 SHP2 vinculante o activación aún no se ha aclarado. Para responder a esta pregunta, hemos desarrollado un análisis que permite la prueba paralela del reclutamiento de SHP2 a la cola de PD-1 y su actividad12. Emplean co-inmunoprecipitación y un análisis de la actividad de fosfatasa en grano para probar la interacción y la actividad enzimática en paralelo. Usando este análisis, nos muestran que el ITSM de PD-1 es suficiente para reclutar SHP2 a la cola de PD-1, mientras que el ITIM de PD-1 se necesita ampliar y activar la enzima.
Existen muchos receptores que tienen varios dominios adyacentes en su cola citoplasmática. El análisis funcional co-inmunoprecipitación puede descubrir el papel de los dominios específicos que son necesarios para el reclutamiento de la proteína o la activación enzimática.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-516F</td>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424-R</td>
			<td>1.5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated FBS</td>
			<td>Denville</td>
			<td>FB5001-H</td>
			<td>Fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin / Streptomycin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP295950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose without L-glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-614F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFect Transfection Reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>301305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SHP2</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;GFP-agarose</td>
			<td>MBL</td>
			<td>D153-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>118144600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Actin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-1616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK-293 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orthovanadate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>216763</td>
			<td>30%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td>EDTA-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC2676</td>
			<td>Modified Laemmli buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% Tris-Glycine Mini Gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>XP04205BOX</td>
			<td>15-well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membranes</td>
			<td>General Electric</td>
			<td>10600004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td>N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1532</td>
			<td>Dithiothreitol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pNPP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>20-106</td>
			<td>p-Nitrophenyl Phosphate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td>Sodium hydroxide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>23225</td>
			<td>Bi Cinchoninic Acid assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

co-immunoprecipitation assay for studying functional interactions between receptors and enzymes

Asociado a receptor de enzimas son los principales mediadores de la activación celular. Estas enzimas son reguladas, al menos en parte, por interacciones físicas con la cola citoplasmática de los receptores. Las interacciones a menudo se producen a través de dominios específicos de la proteína y resultan en la activación de las enzimas. Existen varios métodos para estudiar interacciones entre proteínas. Co-inmunoprecipitación se utiliza habitualmente para estudiar los dominios que se requieren para las interacciones proteína-proteína, hay no hay ensayos documento la contribución de los dominios específicos a la actividad de las enzimas reclutadas al mismo tiempo. Por consiguiente, el método descrito aquí combina co-inmunoprecipitación y un análisis de la actividad enzimática en el grano para la evaluación simultánea de las interacciones entre las proteínas y la activación enzimática asociada. El objetivo de este protocolo es identificar los dominios que son esenciales para las interacciones físicas entre una proteína y enzima y los dominios que son obligatorios para la completa activación de la enzima. Se demuestra la importancia de este ensayo, como cierto receptor dominios proteicos contribuyen a la Unión de la enzima a la cola citoplasmática del receptor, mientras que otros dominios son necesarias para regular la función de la misma enzima.

Mientras se establece la contribución de la ITSM de PD-1 enlace de SHP2, el papel de ITIM de PD-1 es menos claro. Porque SHP2 tiene dos dominios SH2 que se pueden unir a dos phosphotyrosines secuenciales de PD-1 (a una tirosina en el ITSM) y otra en el ITIM, presumimos que el ITSM de PD-1 anclas SHP2 PD-1, mientras que el ITIM de PD-1 facilita la actividad de SHP2 estabilizando su Abra estado conformacional11,14. Para probar esto...

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Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes

Ensayo de co-inmunoprecipitación para el estudio de las interacciones funcionales entre los receptores y enzimas

Aquí, presentamos un protocolo de co-inmunoprecipitación y un ensayo de actividad enzimática en el grano al mismo tiempo estudiar la contribución de los dominios de la proteína específica de los receptores de la membrana plasmática para reclutamiento de la enzima y la actividad enzimática.

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la señalización celular, como la importancia de diferentes dominios de proteínas en la interacción de enzimas receptoras y la activación enzimática. La principal ventaja de esta técnica es que permite pruebas concomitantes de interacciones enzimáticas receptoras y las consecuencias funcionales de esta interacción en la actividad enzimática. Para cada placa, utilice 10 mililitros de DMEM complementados con 10%FBS y 1%penicilina y estreptomicina.El día antes de la transfección, siembra células embrionarias humanas 293-T en 12 placas de 10 centímetros usando un hemocitoómetro para contar las células. Incubar a 37 grados centígrados en 5%C02. Una vez que las células son de 80 a 90%confluentes, utilice un agente de transfección a base de lípidos para transfecar cinco de las placas.Realice la transfección siguiendo las instrucciones del fabricante para las células de adherencia en placas de 10 centímetros. A continuación, transfectar un segundo juego idéntico de cinco placas junto con una placa adicional que sirve como un control no trans infectado para la medición de la cantidad de proteína expresada antes de la inmunoprecipitación. Incubar las placas trans infectadas en una incubadora de cultivo tisular a 37 grados celsius en 5%CO2 durante 48 horas.Utilice un microscopio fluorescente para examinar las células en busca de expresión de GFP y asegurarse de que la transfección se ha producido correctamente. Mezclar 15 microlitros de ortolada de sodio de 100 milimotoras con 50 microlitros de peróxido de hidrógeno al 30% para preparar una mezcla de pervanato fresco. Para fosforilar las versiones etiquetadas de PD-1, elimine los medios de las células trans infectadas PD-1-GFP.Añadir 10 mililitros de DMEM liso y 10 microlitros de pervanada a cada placa. Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después de esto, lave las células tres veces en PBS helado usando cinco mililitros de PBS por lavado.Durante la realización de la inmunoprecipitación, todos los pasos deben realizarse en hielo o a cuatro grados centígrados. Complementar el tampón de la lesis con inhibidores de la proteasa disolviendo un comprimido de los inhibidores en 10 mililitros de tampón. Agregue también un mililolar de ortovanato de sodio al tampón que se utilizará en las placas transinfectantes PD-1-GFP.Añadir 500 microlitros de tampón de lysis helada a las células, asegurándose de añadir el tampón de lelisis que contiene la ortolada de sodio a sólo las placas que contienen células transinfectantes PD-1-GFP. Utilice un rascador de células para extraer y recoger inmediatamente las células de las placas. Transfiera los lysates en tubos fríos de 1,5 mililitros y gírelos a 0,005 veces la gravedad y a cuatro grados centígrados durante 30 minutos.Para recoger el sobrenadante post-núcleos de los lysates, gíralos a 10.000 veces la gravedad y cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Transfiera los sobrenadantes a tubos nuevos y deseche el pellet. Almacene los sobrenadantes para el segundo conjunto de seis placas en hielo para su posterior análisis de LA WCL.Para comenzar a preparar cuentas anti-GFP, agita suavemente el frasco que contiene las perlas antes de abrirla para evitar el sedimento. Retire 40 microlitros de las perlas anti-GFP de la suspensión por cada condición. Centrifugar a 500 veces la gravedad y cuatro grados Celsius durante tres minutos.Retire el sobrenadante para lavar las perlas, asegurándose de minimizar el contacto entre la pipeta y las perlas para evitar la pérdida. Resuspender las perlas en 80 microlitros de tampón de lelisis por muestra. Agregue las perlas lavadas directamente al lesate celular de las células que expresan PD-1-GFP del primer conjunto de cuatro placas.Gire a 0.005 veces la gravedad durante 30 minutos a cuatro grados Celsius para inmunoprecipitar las proteínas etiquetadas con GFP. Lave las cuentas tres veces con un mililitro de tampón de lelisis fría que no contenga ortovanato para cada lavado. Luego centrifugar a 2.500 veces la gravedad durante 10 segundos.Divida el el sulfato del SHP2 activo del primer conjunto de placas en tres porciones iguales y agregue una porción a cada uno de los tres tubos que contienen las perlas lavadas que contienen PD-1-GFP. Agregue 1/3 del volumen de izado de las células no tractivas al segundo tubo de las perlas PD-1-GFP de tipo salvaje. Deseche el 2/3 restante.Incubar las perlas durante cuatro horas a cuatro grados centígrados con rotación suave a 0.005 veces la gravedad. Después de esto, lave las cuentas dos veces usando un mililitro de tampón de lelisis fría para cada lavado. Añadir 80 microlitros de tampón de lelisis a cada muestra, asegurando que el volumen total en cada tubo es de 100 microlitros.Con una punta de pipeta cortada, pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para mezclar. A continuación, transfiera 50 microlitros de cada tubo a dos tubos frescos de 1,5 mililitros. Lave las cuentas una vez con el tampón de lavado de fosfatasa.A continuación, retire el sobrenadante por completo. Agregue 100 microlitros de tampón de ensayo a las perlas e incubar a 30 grados Centígrados durante 30 minutos bajo agitación suave. Cuando el tampón se vuelva amarillo, termine la reacción añadiendo 50 microlitros de una solución molar de hidróxido de sodio.Centrifugar a 2.500 veces la gravedad durante 10 segundos. Después de esto, transfiera el sobrenadante en dos pozos de media área en una placa de 96 pozos. Lea los absorbentes a 405 nanómetros y exprese los resultados como densidad óptica relativa sobre la versión de control de tipo salvaje de PD-1-GFP.Primero gira las cuentas a 2.000 veces la gravedad y cuatro grados Celsius durante 30 segundos y retira el sobrenadante. Añadir 20 microlitros de dos veces tampón Laemmli y hervir a 95 grados Celsius durante cinco minutos. Con un kit BCA, mida la concentración proteica de los controles de entrada.Transfiera 30 microlitros de la muestra más diluida a un tubo nuevo. Utilice el búfer de lelisis para diluir el resto de los controles de entrada a la misma concentración que la muestra más diluida. A continuación, transfiera 30 microlitros de cada uno de los controles de entrada diluidos a un nuevo tubo.Añadir volúmenes iguales de dos veces la tampli tampón a los lisatos y hervirlos 95 grados Celsius durante cinco minutos. Después de esto, gire hacia abajo las cuentas a 2.000 veces la gravedad y cuatro grados Celsius durante 30 segundos antes de realizar el análisis de Western Blot como se describe en el protocolo de texto. En este estudio, se desarrolla un ensayo combinado de co-inmunoprecipitación y actividad enzimática para la evaluación paralela de las interacciones y activación de enzimas receptoras.Como era de esperar, SHP2 no se adhiró al PD-1 cuando el ITSM fue mutado. Sorprendentemente, la versión mutante del ITIM inhibió la unión SHP2 sólo en una medida limitada. Sin embargo, el ensayo de actividad SHP2-fosfatasa revela que el ITIM y el ITSM son igualmente indispensables para la actividad enzimática.Esto revela un modelo de activación en dos pasos en el que SHP2 se pliega en una conformación autoinhibitada en condiciones de reposo. Tras la activación del PD-1, SHP2 es reclutado para el ITSM fosforilado. Sin embargo, el ITIM también debe ser fosforilado para desplegar SHP2 en su conformación activa.Después de su desarrollo, esta técnica puede allanar el camino para que los investigadores en el campo de la señalización celular exploren la función de los dominios proteicos en las interacciones entre receptores y enzimas.

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Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Ensayo de adhesión dinámico para el análisis funcional de las terapias anti-adherencia en enfermedad inflamatoria intestinal

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

Uso complementario de técnicas microscópicas y lectura de fluorescencia en el estudio de las interacciones Cryptococcus-Amoeba

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Monocapas de Colonoid humano para estudiar las interacciones entre patógenos, comensales y epitelio Intestinal Host

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...

Analysis of Interactions between Endobiotics and Human Gut Microbiota Using In Vitro Bath Fermentation Systems

Análisis de interacciones entre endobióticos y microbiota de tripa humana utilizando sistemas de fermentación de bañoin in vitro

Human intestinal microorganisms have recently become an important target of research in promoting human health and preventing diseases. Consequently, ...