Name: co-immunoprecipitation assay for studying functional interactions between receptors and enzymes
Uploaded: 2018-09-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes at JoVE.com

Detta projekt har finansierats av NIH Grants 1R01AI125640-01 och reumatologi Research Foundation.

1. transfection celler
<ol><li>Utsäde HEK 293T celler i tolv 10 cm plattor (5 x 106 celler per platta) dagen innan transfection (figur 1). Utföra den cell som räknar med en hemocytometer. För varje platta, använda 10 mL DMEM kompletteras med 10% FBS och 1% penicillin/streptomycin. Inkubera cellerna vid 37 ° C i 5% CO2.</li>
	<li>När cellerna är 80-90% konfluenta, transfect 5 HEK 293T plattor med ett lipid-baserade transfection reagens med en av de följande pl...

<ol>
	<li>Montor, W. R., Salas, A., Melo, F. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+tyrosine+kinases+and+downstream+pathways+as+druggable+targets+for+cancer+treatment:+the+current+arsenal+of+inhibitors.">Receptor tyrosine kinases and downstream pathways as druggable targets for cancer treatment: the current arsenal of inhibitors.</a> Molecular Cancer. 17 (1), (2018).</li><li>Ngoenkam, J., Schamel, W. W., Pongcharoen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selected+signalling+proteins+recruited+to+the+T-cell+receptor-CD3+complex.">Selected signalling proteins recruited to the T-cell receptor-CD3 complex.</a> Immunology. 153 (1), 42-50 (2018).</li><li>Azoulay-Alfaguter, I., Strazza, M., Pedoeem, A., Mor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+coreceptor+programmed+death+1+inhibits+T-cell+adhesion+by+regulating+Rap1.">The coreceptor programmed death 1 inhibits T-cell adhesion by regulating Rap1.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (2), 564-567 (2015).</li><li>Chemnitz, J. M., Parry, R. V., Nichols, K. E., June, C. H., Riley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHP-1+and+SHP-2+associate+with+immunoreceptor+tyrosine-based+switch+motif+of+programmed+death+1+upon+primary+human+T+cell+stimulation,+but+only+receptor+ligation+prevents+T+cell+activation.">SHP-1 and SHP-2 associate with immunoreceptor tyrosine-based switch motif of programmed death 1 upon primary human T cell stimulation, but only receptor ligation prevents T cell activation.</a> The Journal of Immunology. 173 (2), 945-954 (2004).</li><li>Patsoukis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+effects+of+PD-1+on+Akt+and+Ras+pathways+regulate+molecular+components+of+the+cell+cycle+and+inhibit+T+cell+proliferation.">Selective effects of PD-1 on Akt and Ras pathways regulate molecular components of the cell cycle and inhibit T cell proliferation.</a> Science Signaling. 5 (230), 46 (2012).</li><li>Pentcheva-Hoang, T., Chen, L., Pardoll, D. M., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+death-1+concentration+at+the+immunological+synapse+is+determined+by+ligand+affinity+and+availability.">Programmed death-1 concentration at the immunological synapse is determined by ligand affinity and availability.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (45), (2007).</li><li>Yokosuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+death+1+forms+negative+costimulatory+microclusters+that+directly+inhibit+T+cell+receptor+signaling+by+recruiting+phosphatase+SHP2.">Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2.</a> The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1201-1217 (2012).</li><li>Hui, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+costimulatory+receptor+CD28+is+a+primary+target+for+PD-1-mediated+inhibition.">T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition.</a> Science. 355 (6332), 1428-1433 (2017).</li><li>Sheppard, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+inhibits+T-cell+receptor+induced+phosphorylation+of+the+ZAP70/CD3zeta+signalosome+and+downstream+signaling+to+PKCtheta.">PD-1 inhibits T-cell receptor induced phosphorylation of the ZAP70/CD3zeta signalosome and downstream signaling to PKCtheta.</a> FEBS Letters. 574 (1-3), 37-41 (2004).</li><li>Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+immunoreceptor+inhibits+B+cell+receptor-mediated+signaling+by+recruiting+src+homology+2-domain-containing+tyrosine+phosphatase+2+to+phosphotyrosine.">PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (24), 13866-13871 (2001).</li><li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonism+between+binding+site+affinity+and+conformational+dynamics+tunes+alternative+cis-interactions+within+Shp2.">Antagonism between binding site affinity and conformational dynamics tunes alternative cis-interactions within Shp2.</a> Nature Communications. 4, 2037 (2013).</li><li>Peled, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+purification+mass+spectrometry+analysis+of+PD-1+uncovers+SAP+as+a+new+checkpoint+inhibitor.">Affinity purification mass spectrometry analysis of PD-1 uncovers SAP as a new checkpoint inhibitor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), E468-E477 (2018).</li><li>Jang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protein+tyrosine+phosphatase+inhibitor,+pervanadate,+inhibits+angiotensin+II-Induced+beta-arrestin+cleavage.">A protein tyrosine phosphatase inhibitor, pervanadate, inhibits angiotensin II-Induced beta-arrestin cleavage.</a> Molecules and Cells. 28 (1), 25-30 (2009).</li><li>Pluskey, S., Wandless, T. J., Walsh, C. T., Shoelson, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+stimulation+of+SH-PTP2+phosphatase+activity+by+simultaneous+occupancy+of+both+SH2+domains.">Potent stimulation of SH-PTP2 phosphatase activity by simultaneous occupancy of both SH2 domains.</a> The Journal of Biological Chemistry. 270 (7), 2897-2900 (1995).</li><li>McAvoy, T., Nairn, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serine/threonine+protein+phosphatase+assays.">Serine/threonine protein phosphatase assays.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).</li><li>Shlapatska, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD150+association+with+either+the+SH2-containing+inositol+phosphatase+or+the+SH2-containing+protein+tyrosine+phosphatase+is+regulated+by+the+adaptor+protein+SH2D1A.">CD150 association with either the SH2-containing inositol phosphatase or the SH2-containing protein tyrosine phosphatase is regulated by the adaptor protein SH2D1A.</a> The Journal of Immunology. 166 (9), 5480-5487 (2001).</li></ol>

Receptor-enzym interaktioner är avgörande för Intracellulär signalering. Många enzymer rekryteras till receptorer genom SH2 domäner bindande till fosforylerade tyrosines som pryder svansar av samma receptorer. Men enzymer är ofta vikta till stängda inaktiva konformationer och aktiveringen kräver en conformationaländring11 som kan medlas av andra domäner i samma receptor. Analysen beskrivs här åtgärder interaktioner mellan receptorer, enzymer samt aktivitet induceras av dessa interakt...

Katalytisk receptorer och receptortyrosinkinaser är transmembrana proteiner som orsakar bindningen av en extracellulär ligand enzymatisk aktivitet på intracellulära sida1. Vissa receptorer besitter både receptor och enzymatiska funktioner, medan andra rekrytera specifika enzymer såsom kinaser och fosfataser till deras cytoplasmiska svansar. Rekrytering av ett enzym till receptorns tail och det efterföljande katalys av detta enzym är två separata processer som inte alltid regleras av samma protein domäner2. Tyvärr finns det inga särskilda verktyg för att bedöma både interaktion och enzymatisk aktivitet samtidigt. Funktionella co-immunoprecipitation analysen beskrivs här är en användbar metod att dissekera rekrytering av ett enzym till svansen på en receptor från dess aktivering. Denna analys använder tredjeparts immunoprecipitation av märkta receptorer av antikroppsbelagda pärlor. Därefter utförs både en enzymatisk aktivitet assay och western blot analys på pärlor. Det övergripande målet med denna metod är att avslöja vilka protein domäner är nödvändiga för interaktioner mellan receptorer och enzymer (bedömd med western blot analys) och vilka domäner är obligatoriska för fullständig aktivering av enzymer (mätt på-pärla enzymatisk aktivitet assay). Det är betydelsefullt att utveckla verktyg för att studera de separata funktionerna av receptor-associerade enzymer på grund av sin inblandning i patogenesen av mänskliga sjukdomar. Dessutom kan ytterligare förstå verkningsmekanismer av dessa proteiner hjälpa utformningen av nya terapeutiska interventioner.
Programmerad död-1 (PD-1) är en hämmande receptor på ytan av T-celler och krävs för att begränsa överdriven T-cell svar. Under de senaste åren har anti-PD-1 antikroppar varit inblandade i behandlingen av flera maligniteter1,2. PD-1 ligatur hindrar många T-cellfunktioner, inklusive spridning, adhesion och sekretion av flera cytokiner3,4,5. PD-1 är lokaliserad till immunologisk synaps, gränssnittet mellan T-celler och antigen-presenterande celler6, där det colocalizes med T-cells-receptorn (TCR)7. Därefter den tyrosin fosfatas SHP2 [Src homologi 2 (SH2) domänen som innehåller tyrosin fosfatas 2] rekryteras till den cytoplasmiska svansen av PD-1, vilket leder till dephosphorylation av nyckel tyrosin rester inom komplexa TCR och dess associerade proximala Signaling molekyler3,4,5,8,9. Den cytoplasmiska svansen av PD-1 innehåller två tyrosin motiv, en immunoreceptor tyrosin-baserade hämmande motiv (svart) och en immunoreceptor tyrosin baserat-switch motiv (ITSM)10. Både motiv är fosforyleras vid PD-1 ligatur9,10. Mutagenes studier har visat en primär roll i ITSM SHP2 rekrytering, i motsats till den svart, vars roll i PD-1 signalering och funktion inte är klart4.
SHP2 antar antingen ett stängt (flertrådigt), inhiberad konformation eller öppen (extended), aktiv konformation11. Bidraget från varje svans domän av PD-1 SHP2 bindande eller aktiveringen är ännu inte klarlagd. För att besvara den frågan har utvecklat vi en analysmetod som möjliggör parallella testning av rekrytering av SHP2 till svansen av PD-1 och dess aktivitet12. Vi anställd co-immunoprecipitation och en på-pärla fosfatas aktivitet assay att testa både interaktion och enzymatisk aktivitet parallellt. Med denna analys, visar vi att den ITSM av PD-1 är tillräcklig för att rekrytera SHP2 till svansen av PD-1, medan den svart av PD-1 krävs att fullt förlänga och aktivera enzymet.
I området i närheten finns det många receptorer som har flera intilliggande domäner i deras cytoplasmiska svansar. Funktionella co-immunoprecipitation analysen kan avslöja rollen av specifika domäner som är nödvändiga för antingen protein rekrytering eller enzymatisk aktivering.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-516F</td>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424-R</td>
			<td>1.5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated FBS</td>
			<td>Denville</td>
			<td>FB5001-H</td>
			<td>Fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin / Streptomycin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP295950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose without L-glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-614F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFect Transfection Reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>301305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SHP2</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;GFP-agarose</td>
			<td>MBL</td>
			<td>D153-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>118144600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Actin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-1616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK-293 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orthovanadate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>216763</td>
			<td>30%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td>EDTA-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC2676</td>
			<td>Modified Laemmli buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% Tris-Glycine Mini Gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>XP04205BOX</td>
			<td>15-well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membranes</td>
			<td>General Electric</td>
			<td>10600004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td>N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1532</td>
			<td>Dithiothreitol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pNPP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>20-106</td>
			<td>p-Nitrophenyl Phosphate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td>Sodium hydroxide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>23225</td>
			<td>Bi Cinchoninic Acid assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

co-immunoprecipitation assay for studying functional interactions between receptors and enzymes

Receptor-associerade enzymer är de stora medlarearna av cellulär aktivering. Dessa enzymer regleras, åtminstone delvis, fysiska interaktioner med cytoplasmiska svansar av receptorer. Samspelet ofta uppstå genom specifika protein domäner och leda till aktivering av enzymer. I området i närheten finns det flera metoder för att studera interaktioner mellan proteiner. Även co-immunoprecipitation används vanligen för att studera domäner som krävs för protein-protein interaktioner, finns inga analyser dokumentet specifika domäner till aktiviteten hos enzymerna som rekryterade bidrag samtidigt. Följaktligen kombinerar den metod som beskrivs här co-immunoprecipitation och på-pärla enzymaktivitet test för samtidig utvärdering av interaktioner mellan proteiner och associerade enzymatisk aktivering. Målet med detta protokoll är att identifiera de domäner som är kritiska för fysiska interaktioner mellan ett protein och enzym och domäner som är obligatoriska för slutföra aktiveringen av enzymet. Vikten av denna analys framgår, som vissa receptor protein domäner bidrar till bindningen av enzymet till cytoplasmiska svans av receptor, medan andra domäner är nödvändigt att reglera funktionen av samma enzym.

Medan bidraget av ITSM av PD-1 till SHP2 bindande är etablerad, är rollen av svart av PD-1 mindre tydlig. Eftersom SHP2 har två SH2-domäner som kan binda till två sekventiella phosphotyrosines på PD-1 (en tyrosin i ITSM) och en annan i svart, vi hade en hypotes att den ITSM av PD-1 ankare SHP2 till PD-1, medan den svart av PD-1 underlättar SHP2 aktivitet genom att stabilisera sin öppna konfirmerande stat11,14. För att tes...

Watch this Scientific Journal Video about Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes at JoVE.com

Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes

Co-immunoprecipitation analysmetod för att studera funktionella interaktioner mellan receptorer och enzymer

Här presenterar vi ett protokoll för co-immunoprecipitation och en på-pärla enzymatisk aktivitet assay att samtidigt studera bidrag specifikt protein domäner av plasma membranreceptorer både enzym rekrytering och enzymaktivitet.

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor inom cellsignaleringsfältet såsom betydelsen av olika proteindomäner i receptorenzyminteraktion och enzymatisk aktivering. Den största fördelen med denna teknik är att den möjliggör samtidig testning av receptorenzyminteraktioner och de funktionella konsekvenserna av denna interaktion på enzymaktiviteten. För varje platta, använd 10 milliliter DMEM kompletterat med 10%FBS och 1%penicillin och streptomycin.Dagen före transfection, utsäde mänskliga embryonala njure 293-T-celler i 12 10-centimeter plattor med hjälp av en hemocytometer för att räkna cellerna. Inkubera vid 37 grader Celsius i 5%C02. När cellerna är 80 till 90%konfluenta, använd en lipidbaserad transfection agent för att transfekt fem av plattorna.Utför transfektionen efter tillverkarens anvisningar för följsamhetsceller i 10-centimetersplattor. Sedan transfect en identisk andra uppsättning fem plattor tillsammans med en ytterligare platta som tjänstgör som en icke-transfected kontroll för mätning av uttryckt proteinmängd före immunoprecipitation. Inkubera de transdpekterade plattorna i en inkubator för vävnadskultur vid 37 grader Celsius i 5%CO2 i 48 timmar.Använd ett fluorescerande mikroskop för att undersöka cellerna för GFP uttryck och se till att transfection har framgångsrikt inträffat. Blanda 15 mikroliter av 100-millimolar natrium ortovanat med 50 mikroliter av 30%väteperoxid för att förbereda en färsk pervanadat blandning. Om du vill fosforylera de märkta versionerna av PD-1 tar du bort mediet från de PD-1-GFP-transfekterade cellerna.Tillsätt 10 milliliter vanligt DMEM och 10 mikroliter pervanadate till varje platta. Inkubera i mörker i rumstemperatur i 15 minuter. Efter detta tvättar du cellerna tre gånger i iskall PBS med fem milliliter PBS per tvätt.Medan du utför immunoprecipitation, alla steg bör utföras antingen på is eller vid fyra grader Celsius. Komplettera lysbufferten med proteashämmare genom att lösa upp en tablett av inhibitorerna i 10 milliliter buffert. Lägg även till en millimol av natriumorvanat till bufferten som kommer att användas på de PD-1-GFP-transfected plattorna.Tillsätt 500 mikroliter av iskall lysbuffert till cellerna, se till att lägga till lysbufferten som innehåller natriumortovanaten till endast de plattor som innehåller PD-1-GFP-transfekterade celler. Använd en cellskrapa för att omedelbart ta bort och samla in cellerna från plattorna. Överför lysaterna till 1,5-milliliter kalla rör och rotera dem på 0,005 gånger gravitationen och vid fyra grader Celsius i 30 minuter.För att samla in post-atomkärnor supernatant från lysates, snurra ner dem på 10,000 gånger gravitation och fyra grader Celsius i 10 minuter. Överför supernatanterna till nya rör och kasta pelleten. Förvara supernatanterna för den andra uppsättningen av sex plattor på is för senare WCL-analys.För att börja förbereda anti-GFP pärlor, skaka försiktigt flaskan som innehåller pärlorna innan öppning för att förhindra sedimentering. Ta bort 40 mikroliter av anti-GFP-pärlorna från slurry per varje villkor. Centrifug vid 500 gånger gravitation och fyra grader Celsius i tre minuter.Ta bort supernatanten för att tvätta pärlorna, se till att minimera kontakten mellan pipetten och pärlorna för att förhindra förlust. Resuspend pärlorna i 80 mikroliter av lysbuffert per prov. Lägg till de tvättade pärlorna direkt i cellen lysate från PD-1-GFP-expressing cellerna i den första uppsättningen av fyra plattor.Rotera på 0,005 gånger gravitationen i 30 minuter vid fyra grader Celsius för att immunfälla de GFP-taggade proteinerna. Tvätta pärlorna tre gånger med hjälp av en milliliter kalllyssbuffert som inte innehåller ortovanat för varje tvätt. Sedan centrifug vid 2, 500 gånger gravitationen i 10 sekunder.Dela lysate av den aktiva SHP2 från den första uppsättningen av plattor i tre lika stora delar och lägg en del till var och en av de tre rör som innehåller de tvättade PD-1-GFP-innehållande pärlor. Lägg till 1/3 av lysate-volymen från de icke-transfekterade cellerna till det andra röret av vildtyps-, PD-1-GFP-pärlorna. Kassera resterande 2/3.Inkubera pärlorna i fyra timmar vid fyra grader Celsius med mild rotation vid 0,005 gånger gravitationen. Efter detta, tvätta pärlorna två gånger med hjälp av en milliliter kalllyss buffert för varje tvätt. Tillsätt 80 mikroliter av lysbuffert till varje prov, vilket säkerställer att den totala volymen i varje rör är 100 mikroliter.Använd en skuren pipettspets, pipettera försiktigt upp och ner för att blanda. Överför sedan 50 mikroliter från varje rör till två, färska, 1,5 milliliter rör. Tvätta pärlorna en gång med fosfatastvättbuffert.Ta sedan bort supernatanten helt. Tillsätt 100 mikroliter assaybuffert till pärlorna och inkubera i 30 grader Celsius i 30 minuter under mild agitation. När bufferten blir gul, avsluta reaktionen genom att tillsätta 50 mikroliter av en mollösning av natriumhydroxid.Centrifugera vid 2, 500 gånger gravitation i 10 sekunder. Efter detta överför supernatanten till två brunnar av halva området i en 96-brunnsplatta. Avläs absorbenterna vid 405 nanometer och uttryck resultaten som relativ optisk densitet över kontrollversionen av vildtyp av PD-1-GFP.Snurra först ner pärlorna vid 2, 000 gånger gravitation och fyra grader Celsius i 30 sekunder och ta bort supernatanten. Tillsätt 20 mikroliter av två gånger Laemmli buffert och koka vid 95 grader Celsius i fem minuter. Med hjälp av en BCA-sats mäter du proteinkoncentrationen hos ingångskontrollerna.Överför 30 mikroliter av det mest utspädda provet till ett nytt rör. Använd lysbuffert för att späda ut resten av inmatningskontrollerna till samma koncentration som det mest utspädda provet. Överför sedan 30 mikroliter av var och en av de utspädda inmatningskontrollerna till ett nytt rör.Tillsätt lika stora volymer på två gånger Laemmli buffert till lysates och koka dem 95 grader Celsius i fem minuter. Efter detta snurra ner pärlorna på 2, 000 gånger gravitation och fyra grader Celsius i 30 sekunder innan du utför Western Blot analys som beskrivs i textprotokollet. I denna studie utvecklas en kombinerad co-immunoprecipitation och enzymatisk aktivitetsanalys för den parallella bedömningen av receptorenzyminteraktioner och aktivering.Föga förvånande misslyckades SHP2 att binda till PD-1 när ITSM var muterad. Anmärkningsvärt nog inhiberade den mutanta versionen av ITIM SHP2-bindningen endast i begränsad utsträckning. Trots det avslöjar SHP2-fosfatasaktivitetsanalysen att ITIM och ITSM är lika oumbärliga för den enzymatiska aktiviteten.Detta avslöjar en tvåstegs aktivering modell där SHP2 viks till en autoinhibited konformation under viloförhållanden. Vid aktivering av PD-1 rekryteras SHP2 till fosforylerat ITSM. Dock måste ITIM också fosforyleras för att veckla upp SHP2 i sin aktiva konformation.Efter dess utveckling kan denna teknik bana väg för forskare inom cellsignalering att utforska funktionen av proteindomäner i receptor-enzym interaktioner.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

En Kalcium bioluminescence-analys för funktionsanalys av Mosquito ( Aedes aegypti) Och Tick ( Rhipicephalus MicroPlus) G proteinkopplade receptorer

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes.  The ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Övervakning dendritceller Migration hjälp<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H Magnetic Resonance Imaging

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

Studera Interaktioner av<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Med Neutrofiler genom flödescytometri-och Time Lapse Mikroskopi

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel<em&gt; In vitro</em&gt; Modell för att studera interaktioner mellan humant helblod och endotelet

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Upptäcka Glykogen i perifera mononukleära blodceller med Periodic Acid Schiff Färgning

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Co-immunoprecipitation av Mouse Mx1 Protein med influensa A-virus nukleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Dynamiska vidhäftning test för funktionell analys av anti vidhäftning terapier vid inflammatorisk tarmsjukdom

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

Kompletterande användning av mikroskopiska tekniker och fluorescens läsning i studera Cryptococcus-amoeba interaktioner

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Mänskliga Colonoid enskiktslager att studera interaktioner mellan patogener, förknippas och värd Intestinal epitel

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...

Analysis of Interactions between Endobiotics and Human Gut Microbiota Using In Vitro Bath Fermentation Systems

Analys av interaktioner mellan Endobiotika och Human Gut Microbiota med in vitro-system för bad jäsning

Human intestinal microorganisms have recently become an important target of research in promoting human health and preventing diseases. Consequently, ...