Name: co-immunoprecipitation assay for studying functional interactions between receptors and enzymes
Uploaded: 2018-09-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes at JoVE.com

Bu proje NIH hibe 1R01AI125640-01 ve Romatoloji Araştırma Vakfı tarafından finanse edildi.

1. transfection hücre
<ol><li>HEK 293T hücre içine on iki 10 cm tabak (tabak başına 5 x 106 hücre) transfection (Şekil 1) önceki gün tohum. Bir hemasitometre kullanarak hücre sayımı gerçekleştirmek. Her plaka için 10 mL % 10 FBS ve % 1 penisilin/streptomisin ile desteklenmiş DMEM kullanın. %5 CO237 ° C'de hücreler kuluçkaya.</li>
	<li>Hücrelerin % 80-90 birleşmesi olduğunda, aşağıdaki Plasmid'ler ile lipid tabanlı transfection reaktif kullan...

<ol>
	<li>Montor, W. R., Salas, A., Melo, F. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+tyrosine+kinases+and+downstream+pathways+as+druggable+targets+for+cancer+treatment:+the+current+arsenal+of+inhibitors.">Receptor tyrosine kinases and downstream pathways as druggable targets for cancer treatment: the current arsenal of inhibitors.</a> Molecular Cancer. 17 (1), (2018).</li><li>Ngoenkam, J., Schamel, W. W., Pongcharoen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selected+signalling+proteins+recruited+to+the+T-cell+receptor-CD3+complex.">Selected signalling proteins recruited to the T-cell receptor-CD3 complex.</a> Immunology. 153 (1), 42-50 (2018).</li><li>Azoulay-Alfaguter, I., Strazza, M., Pedoeem, A., Mor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+coreceptor+programmed+death+1+inhibits+T-cell+adhesion+by+regulating+Rap1.">The coreceptor programmed death 1 inhibits T-cell adhesion by regulating Rap1.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (2), 564-567 (2015).</li><li>Chemnitz, J. M., Parry, R. V., Nichols, K. E., June, C. H., Riley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHP-1+and+SHP-2+associate+with+immunoreceptor+tyrosine-based+switch+motif+of+programmed+death+1+upon+primary+human+T+cell+stimulation,+but+only+receptor+ligation+prevents+T+cell+activation.">SHP-1 and SHP-2 associate with immunoreceptor tyrosine-based switch motif of programmed death 1 upon primary human T cell stimulation, but only receptor ligation prevents T cell activation.</a> The Journal of Immunology. 173 (2), 945-954 (2004).</li><li>Patsoukis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+effects+of+PD-1+on+Akt+and+Ras+pathways+regulate+molecular+components+of+the+cell+cycle+and+inhibit+T+cell+proliferation.">Selective effects of PD-1 on Akt and Ras pathways regulate molecular components of the cell cycle and inhibit T cell proliferation.</a> Science Signaling. 5 (230), 46 (2012).</li><li>Pentcheva-Hoang, T., Chen, L., Pardoll, D. M., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+death-1+concentration+at+the+immunological+synapse+is+determined+by+ligand+affinity+and+availability.">Programmed death-1 concentration at the immunological synapse is determined by ligand affinity and availability.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (45), (2007).</li><li>Yokosuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+death+1+forms+negative+costimulatory+microclusters+that+directly+inhibit+T+cell+receptor+signaling+by+recruiting+phosphatase+SHP2.">Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2.</a> The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1201-1217 (2012).</li><li>Hui, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+costimulatory+receptor+CD28+is+a+primary+target+for+PD-1-mediated+inhibition.">T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition.</a> Science. 355 (6332), 1428-1433 (2017).</li><li>Sheppard, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+inhibits+T-cell+receptor+induced+phosphorylation+of+the+ZAP70/CD3zeta+signalosome+and+downstream+signaling+to+PKCtheta.">PD-1 inhibits T-cell receptor induced phosphorylation of the ZAP70/CD3zeta signalosome and downstream signaling to PKCtheta.</a> FEBS Letters. 574 (1-3), 37-41 (2004).</li><li>Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+immunoreceptor+inhibits+B+cell+receptor-mediated+signaling+by+recruiting+src+homology+2-domain-containing+tyrosine+phosphatase+2+to+phosphotyrosine.">PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (24), 13866-13871 (2001).</li><li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonism+between+binding+site+affinity+and+conformational+dynamics+tunes+alternative+cis-interactions+within+Shp2.">Antagonism between binding site affinity and conformational dynamics tunes alternative cis-interactions within Shp2.</a> Nature Communications. 4, 2037 (2013).</li><li>Peled, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+purification+mass+spectrometry+analysis+of+PD-1+uncovers+SAP+as+a+new+checkpoint+inhibitor.">Affinity purification mass spectrometry analysis of PD-1 uncovers SAP as a new checkpoint inhibitor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), E468-E477 (2018).</li><li>Jang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protein+tyrosine+phosphatase+inhibitor,+pervanadate,+inhibits+angiotensin+II-Induced+beta-arrestin+cleavage.">A protein tyrosine phosphatase inhibitor, pervanadate, inhibits angiotensin II-Induced beta-arrestin cleavage.</a> Molecules and Cells. 28 (1), 25-30 (2009).</li><li>Pluskey, S., Wandless, T. J., Walsh, C. T., Shoelson, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+stimulation+of+SH-PTP2+phosphatase+activity+by+simultaneous+occupancy+of+both+SH2+domains.">Potent stimulation of SH-PTP2 phosphatase activity by simultaneous occupancy of both SH2 domains.</a> The Journal of Biological Chemistry. 270 (7), 2897-2900 (1995).</li><li>McAvoy, T., Nairn, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serine/threonine+protein+phosphatase+assays.">Serine/threonine protein phosphatase assays.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).</li><li>Shlapatska, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD150+association+with+either+the+SH2-containing+inositol+phosphatase+or+the+SH2-containing+protein+tyrosine+phosphatase+is+regulated+by+the+adaptor+protein+SH2D1A.">CD150 association with either the SH2-containing inositol phosphatase or the SH2-containing protein tyrosine phosphatase is regulated by the adaptor protein SH2D1A.</a> The Journal of Immunology. 166 (9), 5480-5487 (2001).</li></ol>

Reseptör-enzim etkileşimleri hücre içi sinyal için büyük önem taşımaktadır. Birçok enzim reseptörleri SH2 etki alanları aynı reseptörlerinin kuyrukları süslemeleri fosforile tyrosines bağlama aracılığıyla işe. Ancak, enzimler kez kapalı etkin olmayan biçimler katlanmış ve diğer etki alanlarının aynı reseptör aracılı konformasyonal değişim11 istemek harekete geçirmek. Tahlil reseptörleri ve enzimler gibi faaliyet arasındaki etkileşimler bu etkileşimler tara...

Katalitik reseptörleri ve reseptör Tirozin kinaz transmembran proteinler neden olan bir hücre dışı ligand bağlayıcı enzimatik aktivite hücre içi yan1' dir. Diğerleri belirli enzimler kinaz ve fosfatazlar sitoplazmik onların kuyrukları için gibi işe iken bazı reseptörleri reseptörü ve enzimatik işlevler, sahip. İşe bir enzim reseptör'ın kuyruğu ve bu enzim sonraki katalitik eylem için her zaman aynı protein etki alanları2tarafından düzenlenir değil iki ayrı işlemler vardır. Ne yazık ki, etkileşim ve enzimatik aktivite aynı anda değerlendirmek için belirli bir aracı vardır. Burada açıklanan fonksiyonel co-immunoprecipitation tahlil bir enzim alımı bir reseptör kuyruğuna onun aktivasyon incelemek için kullanışlı bir yöntemdir. Bu tahlil immunoprecipitation tagged reseptörlerinin antikor kaplı boncuk tarafından kullanır. Daha sonra bir enzim etkinliği tahlil ve western blot Analizi boncuk üzerinde gerçekleştirilir. Hangi protein etki alanlarının reseptörleri ve enzimler (western blot analizi ile değerlendirilmesi) arasındaki etkileşimler için gerekli olduğunu ortaya çıkarmak için bu yöntem genel amacı olduğunu ve hangi etki alanlarının (boncuk üzerinde ölçülen enzimlerin tam harekete geçirmek için zorunlu olduğunu enzimatik aktivite assay). İnsan hastalıkları patogenezinde onların katılımı nedeniyle reseptör ilişkili enzimlerin ayrı işlevleri eğitim araçları geliştirmek önemlidir. Ayrıca, daha fazla bu proteinlerin mekanizmaları anlama roman tedavi müdahaleler tasarım yardımcı olabilir.
Programlanmış ölüm-1 (PD-1) T hücrelerinin yüzeyinde bir inhibitör reseptörü ve aşırı T hücre yanıt-e doğru sınırlamak için gereklidir. Son yıllarda, birden çok maligniteler1,2tedavisinde anti-PD-1 antikorlar karıştığı olmuştur. PD-1 tüp ligasyonu yayılması, yapışma ve salgı birden çok sitokinler3,4,5gibi çok sayıda T hücre işlevi kısıtlayan. PD-1 immünolojik sinaps, T hücreleri ve antijen sunan hücreler6arasında nerede T hücre reseptör (TCR)7ile colocalizes arayüz için yerelleştirilmiştir. Daha sonra Tirozin fosfataz SHP2 [Src Homoloji 2 (SH2) Tirozin fosfataz 2 içeren etki alanını] PD-1 anahtar Tirozin kalıntıları karmaşık TCR ve onun ilişkili içinde proksimal dephosphorylation önde gelen, sitoplazmik kuyruk için oluşturulmuştur sinyal molekülleri3,4,5,8,9. PD-1 sitoplazmik kuyruk iki Tirozin motifleri, bir immunoreceptor Tirozin tabanlı inhibitör motifi (ITIM) ve bir immunoreceptor Tirozin dayalı-anahtar motifi (ITSM)10içerir. Her iki motifleri PD-1 tüp ligasyonu9,10fosforile. Mutagenesis çalışmalar bir birincil rolü için SHP2 işe alım, ITIM rolünü PD-1 sinyal ve fonksiyon açık değildir, aksine4ITSM ortaya çıkardı.
SHP2 ya da kapalı bir (katlanmış) benimser, uyum veya açık bir etkin uyum11(genişletilmiş), inhibe. PD-1 her kuyruk etki alanı SHP2 bağlama ya da harekete geçirmek için katkısını henüz aydınlatılmamıştır değil. Bu soruyu cevaplamak için biz SHP2 istihdamı PD-1 ve onun etkinlik12kuyruk için paralel test sağlar bir tahlil geliştirilmiştir. Co-immunoprecipitation ve etkileşim ve enzimatik aktivite paralel olarak test etmek için bir boncuk üzerinde fosfataz etkinliği tahlil çalıştırmaya başladık. Bu tahlil kullanarak, PD-1 ITSM ITIM PD-1 tam olarak genişletmek ve enzim harekete geçirmek için gerekli süre SHP2 PD-1, kuyruk için işe almak için yeterli olduğunu göstereceğiz.
Çeşitli bitişik etki alanlarına sitoplazmik onların kuyrukları birçok reseptörleri vardır. Fonksiyonel co-immunoprecipitation tahlil protein alımı ya da enzimatik harekete geçirmek için gerekli olan belirli etki alanları rolünü ortaya çıkarmak.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-516F</td>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424-R</td>
			<td>1.5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated FBS</td>
			<td>Denville</td>
			<td>FB5001-H</td>
			<td>Fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin / Streptomycin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP295950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose without L-glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-614F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFect Transfection Reagent</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>301305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SHP2</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti&#8211;GFP-agarose</td>
			<td>MBL</td>
			<td>D153-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>118144600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Actin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-1616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK-293 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orthovanadate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>216763</td>
			<td>30%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td>EDTA-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC2676</td>
			<td>Modified Laemmli buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% Tris-Glycine Mini Gels</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>XP04205BOX</td>
			<td>15-well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membranes</td>
			<td>General Electric</td>
			<td>10600004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td>N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1532</td>
			<td>Dithiothreitol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pNPP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>20-106</td>
			<td>p-Nitrophenyl Phosphate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td>Sodium hydroxide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>23225</td>
			<td>Bi Cinchoninic Acid assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

co-immunoprecipitation assay for studying functional interactions between receptors and enzymes

Reseptör ilişkili hücresel harekete geçirmek büyük arabulucu enzimlerdir. Bu enzimler, en azından kısmen, reseptörleri sitoplazmik kuyrukları ile fiziksel etkileşimleri tarafından düzenlenmektedir. Etkileşimleri kez aracılığıyla belirli protein etki oluşur ve enzimler harekete geçirmek içinde neden. Proteinler arasındaki etkileşimler incelemek için birkaç yöntem vardır. Co-immunoprecipitation protein-protein etkileşimleri için gerekli olan etki alanları incelemek için yaygın olarak kullanılır iken, bu belge işe enzimlerin etkinliğini belirli etki alanlarına katkı aynı anda hiçbir deneyleri vardır. Buna göre burada açıklanan yöntemi co-immunoprecipitation ve bir boncuk üzerinde enzimatik aktivite tahlil proteinler ve ilişkili enzimatik harekete geçirmek arasındaki etkileşimler aynı anda değerlendirilmesi için birleştirir. Bu iletişim kuralı bir protein ve enzim ve enzim tam harekete geçirmek için zorunlu olan etki alanları arasında fiziksel etkileşimleri için kritik olan etki alanları tanımlamak için hedeftir. Bu testin önemi gösterdi, diğer etki alanlarındaki aynı enzim fonksiyonu düzenlenmesi için gerekli olmakla birlikte bazı reseptör enzim reseptör, sitoplazmik kuyruk için bağlayıcı protein etki katkıda.

Katkı, ITSM PD-1'in SHP2 bağlama için kurulan iken, rol ITIM PD-1, daha az açıktır. SHP2 iki sıralı phosphotyrosines PD-1 (ITSM içinde bir Tirozin) ve ITIM diğerinde bağlayabilirsiniz iki SH2 etki alanı olduğundan, PD-1 ITIM SHP2 aktivite sabitleme ile kolaylaştırır süre ITSM PD-1 PD-1, SHP2 tutturur onaylanmadığına karar onun konformasyon devlet11,14' ü aç. Bu test etmek için bir kombine co-immunoprecipitat...

Watch this Scientific Journal Video about Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes at JoVE.com

Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes

Reseptörleri ve enzimler arasındaki işlevsel etkileşimler çalışmak için Co-immunoprecipitation tahlil

Burada, co-immunoprecipitation ve plazma membran reseptörleri enzim işe alım ve enzim aktivitesi belirli protein etki katkısını aynı anda çalışmaya bir boncuk üzerinde enzimatik aktivite tahlil için bir iletişim kuralı mevcut.

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

Bu yöntem, reseptör enzim etkileşimi ve enzimaktivasyonunda farklı protein alanlarının önemi gibi hücre sinyalizasyon alanındaki anahtar soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, reseptör enzim etkileşimlerinin ve bu etkileşimin enzim aktivitesi üzerindeki fonksiyonel sonuçlarının birlikte test edilmesine olanak sağlamasıdır. Her plaka için 10 mililitre DMEM kullanın ve %10 FBS ve %1 penisilin ve streptomisin ile tamamlanır.Transfeksiyondan bir gün önce, insan embriyonik böbrek 293-T hücrelerini 12 10 santimetrelik plakalara hemositometre kullanarak hücreleri saymak için tohum. %5 C02'de 37 derecede kuluçkaya yat. Hücreler %80 ila %90 oranında konfluent olduktan sonra, plakaların beşini transfect etmek için lipid bazlı transfeksiyon ajanı kullanın.10 santimetrelik plakalarda yapışma hücreleri için üreticinin talimatları aşağıdaki transfection gerçekleştirin. Daha sonra, immünopresimadan önce ifade edilen protein miktarının ölçümü için transfected olmayan bir kontrol görevi veren ek bir plaka ile birlikte beş plakadan oluşan aynı ikinci seti transfect. Bir doku kültürü kuluçka makinesinde transfected plakaları 48 saat boyunca %5 CO2'de 37 derecede kuluçkaya yatırın.GFP ekspresyonu için hücreleri incelemek ve transfeksiyonun başarıyla meydana geldiğinden emin olmak için floresan mikroskop kullanın. Taze bir pervanaat karışımı hazırlamak için 15 mikrolitre 100 milimolar sodyum ortoovanadate ile %30 hidrojen peroksit 50 mikrolitre karıştırın. PD-1'in etiketli sürümlerini fosforilasyona çıkarmak için, ortamı PD-1-GFP transfected hücrelerden çıkarın.Her plakaya 10 mililitre düz DMEM ve 10 mikrolitre pervanat ekleyin. 15 dakika oda sıcaklığında karanlıkta kuluçka. Bundan sonra, yıkama başına beş mililitre PBS kullanarak hücreleri buz gibi PBS'de üç kez yıkayın.İmmünoenaz yapılırken tüm adımlar buzüzerinde veya dört santigrat derecede yapılmalıdır. 10 mililitre tampon inhibitörleri bir tablet eriterek proteaz inhibitörleri ile lysis tampon tamam. Ayrıca PD-1-GFP-transfected plakalar kullanılacak tampon sodyum orthovanadate bir milimolar ekleyin.Hücrelere 500 mikrolitre buz gibi lisis tamponu ekleyin, sodyum orthovanadate içeren lysis tamponunun sadece PD-1-GFP-transfected hücreleri içeren plakalara eklenmesini sağlamak. Hemen kaldırmak ve plakalardan hücreleri toplamak için bir hücre kazıyıcı kullanın. Lysatları 1,5 mililitrelik soğuk tüplere aktarın ve 0,005 kat yerçekiminde ve 4 derecede 30 dakika döndürün.Lysates'ten çekirdek sonrası süpernatant'ı toplamak için, 10,000 kat yerçekimi ve 4 santigrat derece 10 dakika boyunca aşağı çevirin. Supernatants yeni tüpler halinde aktarın ve pelet atın. Daha sonra WCL analizi için buz üzerinde altı plaka ikinci seti için supernatants saklayın.Anti-GFP boncuklar hazırlamaya başlamak için, yavaşça yerleşmeönlemek için açmadan önce boncuk içeren şişe sallayın. Her koşulda bulamaç tan anti-GFP boncuk 40 mikrolitre çıkarın. 500 kat yerçekiminde santrifüj ve üç dakika boyunca dört santigrat derece.Kaybı önlemek için pipet ve boncuk arasındaki teması en aza indirmek için emin olun, boncuk yıkamak için supernatant çıkarın. Örnek başına 80 mikrolitre likis tamponu boncukları yeniden askıya alın. Yıkanmış boncukları doğrudan dört plakalı ilk setin PD-1-GFP ifade eden hücrelerinden hücre lysate'sine ekleyin.GFP etiketli proteinleri immünopprepititate etmek için 4 santigrat derecede 30 dakika boyunca 0.005 kez yerçekimi nde döndürün. Her yıkama için ortovanadate içermeyen bir mililitre soğuk lysis tampon kullanarak boncukları üç kez yıkayın. Sonra 10 saniye boyunca 2,500 kat daha fazla yer çekiminde santrifüj.Aktif SHP2'nin ilk plaka setinden üç eşit bölüme bölün ve yıkanmış PD-1-GFP içeren boncukları içeren üç tüpün her birine bir porsiyon ekleyin. Nontransfected hücrelerden yabani tip, PD-1-GFP boncukikinci tüp için lysate hacminin 1/3 ekleyin. Kalan 2/3'ü atın.0.005 kez yerçekimi nazik rotasyon ile dört derece santigrat dört saat boyunca boncuk kuluçka. Bundan sonra, her yıkama için soğuk lysis tampon bir mililitre kullanarak iki kez boncuk yıkayın. Her numuneye 80 mikrolitre likis tamponu ekleyerek her tüpteki toplam hacmin 100 mikrolitre olmasını sağlar.Bir kesme pipet ucu kullanarak, pipet yavaşça yukarı ve aşağı karıştırmak için. Daha sonra her tüpten 50 mikrolitreyi iki, taze, 1,5 mililitrelik tüplere aktarın. Fosfataz yıkama tampon ile bir kez boncuk yıkayın.Sonra tamamen supernatant çıkarın. Boncuklara 100 mikrolitre arbede tamponu ekleyin ve nazik ajitasyon altında 30 dakika boyunca 30 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Tampon sarıya döndüğünde, sodyum hidroksit bir molar çözeltisi 50 mikrolitre ekleyerek reaksiyonu sona erdirin.10 saniye boyunca 2, 500 kat yerçekiminde santrifüj. Bundan sonra, 96-iyi plaka yarım alanda iki kuyu içine supernatant aktarın. Emicileri 405 nanometrede okuyun ve pd-1-GFP'nin kontrol vahşi tipi sürümü üzerinde göreceli optik yoğunluk olarak sonuçları ifade edin.Önce boncukları 2,000 kat yerçekiminde ve 4 santigrat derecede 30 saniye boyunca aşağı çevirin ve süpernatantı çıkarın. Iki kez Laemmli tampon 20 mikrolitre ekleyin ve beş dakika boyunca 95 santigrat derecede kaynatın. BCA kiti kullanarak, giriş kontrollerinin protein konsantrasyonu ölçün.En seyreltilmiş numunenin 30 mikrolitresini yeni bir tüpe aktarın. Giriş kontrollerinin geri kalanını en seyreltilmiş numuneyle aynı konsantrasyonda seyreltmek için lysis tamponu kullanın. Daha sonra seyreltilmiş giriş kontrollerinin her birinin 30 mikrolitresini yeni bir tüpe aktarın.Lysates iki kez Laemmli tampon eşit hacimlerde ekleyin ve beş dakika boyunca 95 derece santigrat kaynatın. Bundan sonra, metin protokolünde belirtildiği gibi Western Blot analizi yapmadan önce boncukları 2,000 kat yerçekimi ve 4 santigrat derece ile 30 saniye boyunca aşağı çevirin. Bu çalışmada, reseptör enzim etkileşimlerinin ve aktivasyonunun paralel değerlendirilmesi için kombine ko-immünopreksiyon ve enzimaktivitesi teşrisi geliştirilmiştir.Beklendiği gibi, ITSM mutasyona uğratıldığında SHP2 PD-1'e bağlanmayı başaramadı. Dikkat çekici bir şekilde, ITIM'nin mutant versiyonu SHP2'nin sadece sınırlı bir ölçüde bağlanmasını engelledi. Bununla birlikte, SHP2-fosfataz aktivitesi titretisi, ITIM ve ITSM'nin enzimatik aktivite için eşit derecede vazgeçilmez olduğunu ortaya koymaktadır.Bu, SHP2'nin dinlenme koşullarında otomatik olarak konformasyona katlandığı iki aşamalı bir aktivasyon modelini ortaya çıkarır. PD-1 aktivasyonu üzerine, SHP2 fosforile ITSM için işe alındı. Ancak, ITIM de aktif koformasyon içine SHP2 açığa fosforilted olmalıdır.Gelişiminden sonra, bu teknik reseptör-enzim etkileşimlerinde protein etki fonksiyonlarının işlevini keşfetmek için hücre sinyalalanında araştırmacılar için önünü açabilir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

Sivrisinek Fonksiyonel Analiz için Kalsiyum Biyoparlaklık Testi ( Aedes aegypti) Ve Tick ( Rhipicephalus Microplus) G Protein-çiftli Reseptörler

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes.  The ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Kullanarak İzleme Dendritik Hücre Göç<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H Manyetik Rezonans Görüntüleme

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

Etkileşimi incelenmesi<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Akım Sitometri ve Time Lapse Mikroskopi tarafından Nötrofiller ile

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

A Novel<em&gt; In vitro</em&gt; İnsan Tüm Kan ve Endotelyumunun Arasındaki Etkileşimler incelenmesi için Model

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Periyodik Asit Schiff Boyama ile periferik kan mononükleer hücreleri glikojen algılama

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

İnfluenza A virüsü nükleoproteini Fare MX1 Protein Co-immunopresipitasyonu

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Dinamik yapışma tahlil için anti-yapışma tedaviler iltihabi bağırsak hastalığı fonksiyonel analiz

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

Kripokus-Amoeba etkileşimlerinde mikroskobik teknikler ve floresans okuma tamamlayıcı kullanımı

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Patojenler, Commensals ve ana bilgisayar bağırsak epitel arasındaki etkileşimler çalışmaya insan Colonoid Monolayers

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...

Analysis of Interactions between Endobiotics and Human Gut Microbiota Using In Vitro Bath Fermentation Systems

In Vitro Bath Fermantasyon Sistemleri Kullanılarak Endobiyotikler ve İnsan Bağırsak Mikrobiyotları Arasındaki Etkileşimlerin Analizi

Human intestinal microorganisms have recently become an important target of research in promoting human health and preventing diseases. Consequently, ...