Name: reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification (rt-lamp) assay for zika virus and housekeeping genes in urine, serum, and mosquito samples
Uploaded: 2018-09-14T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification RT-LAMP Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples at JoVE

Dette arbejde blev støttet af Maureen og Ronald Hirsch familie filantropiske bidrag og felt neurovidenskab Institute, St. Marys i Michigan. Finansieringskilderne spillede ingen rolle i undersøgelse design, dataindsamling og analyse, beslutningen om at offentliggøre eller forberedelse af manuskriptet. Vi takker også Dr. Bernadette Zwaans og Elijah Ward for deres kritiske gennemgang af håndskriftet.

Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af institutionelle Review Board (IRB) af Beaumont sundhed. Alle eksperimenter blev udført i overensstemmelse med relevante retningslinjer og forordninger.
Advarsel: Alle potentielt smittefarlige materialer behandles efter biosikkerhedsniveau 2 som standarder, herunder brugen af personlige værnemidler. Procedurer, som kan producere aerosol bør udføres i en biosikkerhed kabinet. Derudover bør arbejde med levende myg udføres i passende leddyr in...

<ol>
	<li>Petersen, L. R., Jamieson, D. J., Powers, A. M., Honein, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus.">Zika Virus.</a> New England Journal of Medicine. 374 (16), 1552-1563 (2016).</li><li>Francois, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robustness+of+a+loop-mediated+isothermal+amplification+reaction+for+diagnostic+applications.">Robustness of a loop-mediated isothermal amplification reaction for diagnostic applications.</a> Federation of European Microbiological Societies Immunology and Medical Microbiology. 62 (1), 41-48 (2011).</li><li>Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP)+of+gene+sequences+and+simple+visual+detection+of+products.">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products.</a> Nature Protocols. 3 (5), 877-882 (2008).</li><li>Gandasegui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rapid-Heat+LAMPellet+Method:+A+Potential+Diagnostic+Method+for+Human+Urogenital+Schistosomiasis.">The Rapid-Heat LAMPellet Method: A Potential Diagnostic Method for Human Urogenital Schistosomiasis.</a> Public Library of Science Neglected Tropical Diseases. 9 (7), 0003963 (2015).</li><li>Barkway, C. P., Pocock, R. L., Vrba, V., Blake, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP)+assays+for+the+species-specific+detection+of+Eimeria+that+infect+chickens.">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays for the species-specific detection of Eimeria that infect chickens.</a> The Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).</li><li>Lamb, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Detection+of+Zika+Virus+in+Urine+Samples+and+Infected+Mosquitos+by+Reverse+Transcription-Loop-Mediated+Isothermal+Amplification.">Rapid Detection of Zika Virus in Urine Samples and Infected Mosquitos by Reverse Transcription-Loop-Mediated Isothermal Amplification.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3803 (2018).</li><li>Faye, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+RT-PCR+for+detection+of+Zika+virus.">One-step RT-PCR for detection of Zika virus.</a> Journal of Clinical Virology. 43 (1), 96-101 (2008).</li><li>Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+inhibitors+-+occurrence,+properties+and+removal.">PCR inhibitors - occurrence, properties and removal.</a> Journal of Applied Microbiology. 113 (5), 1014-1026 (2012).</li><li>Poole, C. B., Tanner, N. A., Zhang, Y., Evans, T. C., Carlow, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+brugian+filariasis+by+loop-mediated+isothermal+amplification.">Diagnosis of brugian filariasis by loop-mediated isothermal amplification.</a> Public Library of Science Neglected Tropical Diseases. 6 (12), 1948 (2012).</li><li>Tanner, N. A., Zhang, Y., Evans, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+multiple+target+detection+in+real-time+loop-mediated+isothermal+amplification.">Simultaneous multiple target detection in real-time loop-mediated isothermal amplification.</a> Biotechniques. 53 (2), 81-89 (2012).</li><li>Chan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+Affordable+and+Portable+Medium-Throughput+Molecular+Device+for+Zika+Virus.">Rapid, Affordable and Portable Medium-Throughput Molecular Device for Zika Virus.</a> Scientific Reports. 6, 38223 (2016).</li><li>Lee, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+Highly+Sensitive+Molecular+Diagnosis+of+Zika+Virus+by+Lateral+Flow+Assays.">Simple and Highly Sensitive Molecular Diagnosis of Zika Virus by Lateral Flow Assays.</a> Analytical Chemistry. 88 (24), 12272-12278 (2016).</li><li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-Cost+Detection+of+Zika+Virus+Using+Programmable+Biomolecular+Components.">Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components.</a> Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).</li><li>Song, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instrument-Free+Point-of-Care+Molecular+Detection+of+Zika+Virus.">Instrument-Free Point-of-Care Molecular Detection of Zika Virus.</a> Analytical Chemistry. 88 (14), 7289-7294 (2016).</li><li>Yaren, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Point+of+sampling+detection+of+Zika+virus+within+a+multiplexed+kit+capable+of+detecting+dengue+and+chikungunya.">Point of sampling detection of Zika virus within a multiplexed kit capable of detecting dengue and chikungunya.</a> BioMed Central Infectious Diseases. 17 (1), 293 (2017).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+sensitive+detection+of+Zika+virus+by+reverse+transcription+loop-mediated+isothermal+amplification.">Rapid and sensitive detection of Zika virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification.</a> Journal of Virological Methods. 238, 86-93 (2016).</li><li>Priye, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+smartphone-based+diagnostic+platform+for+rapid+detection+of+Zika,+chikungunya,+and+dengue+viruses.">A smartphone-based diagnostic platform for rapid detection of Zika, chikungunya, and dengue viruses.</a> Scientific Reports. 7, 44778 (2017).</li></ol>

ZIKV RT-lampe analysen beskrives i dette papir værker ved hjælp af både menneskelige og myg prøver6. Detektionsgrænsen var ca 1 genom tilsvarende6, som bør være tilstrækkeligt, da den typiske viral belastning af en symptomatisk ZIKV inficeret patient er 103 til 106 PFU/mL7. Derudover kan denne metode registrerer ZIKV i prøver uden første isolere RNA og uden virus forstærkning i cellekultur. Dette mindsker ...

I 2015 fik Zika virus (ZIKV) fremtrædende global opmærksomhed som en smitsom sygdom giver anledning til bekymring for infektion under graviditet var forbundet med abort, dødfødsel, alvorlige neurologiske fødselsdefekter herunder mikrocefali, såvel som andre medfødte fødselsdefekter1. I sjældne tilfælde, har ZIKV været forbundet med Guillain-Barre syndrom. ZIKV er primært overføres af Aedes myg; Det kan dog også spredes gennem seksuel kontakt1. Betragtning af, at infektion med ZIKV er asymptomatisk hos de fleste mennesker eller præsenterer med milde influenza-lignende symptomer som overlapper med symptomer på infektion af andre arborviruses1, var der behov for forbedrede metoder til hurtig og omkostningseffektiv påvisning af ZIKV til skærmen såvel mennesker som lokale mosquito befolkninger.
Kvantitative reverse transkription PCR (qRT-PCR) er en pålidelig analyse til registrering af ZIKV; denne teknik kræver dog dyrt specialudstyr, uddannet personale og RNA isolering fra prøven af interesse. Reverse transkription loop-medieret isotermisk forstærkning (RT-lampe) er en et-trins nukleinsyre amplifikation metode baseret på PCR-teknologi, der kun kræver én inkubation temperatur på grund af brugen af en termofile DNA polymerase med strand forskydning egenskaber. Det omgår behovet for en thermocycler og nedsætter længden af tid, det tager at fuldføre analysen. Yderligere fordele ved RT-lampe omfatter høj specificitet og følsomhed, robusthed på en række pH-niveauer og temperaturer og modstand mod mange PCR-hæmmere2. Det har en relativt lav pris og reagenser er stabile ved stuetemperatur. I betragtning af disse karakteristika, kan RT-lampe være indsat i et laboratorium eller i feltet. Som sådan, har lampe reaktioner udviklet til at opdage en række patogener og andre former for infektion3,4,5. Målet med RT-lampe protokollen beskrevet i denne hvidbog er at opdage ZIKV uden RNA isolering i human serum og urin prøver så godt som en enkelt inficerede myg indenfor 30 min via RT-lampe. Denne metode kan bruges til at erstatte qRT-PCR, da det er en følsom, hurtig diagnostisk værktøj, der fungerer hurtigt og i indstillinger uden for laboratoriet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:901px;" width="902">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Bst 2.0 WarmStart DNA polymerase</td>
			<td style="width:223px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:223px;">M0537S</td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isothermal Amplification Buffer&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:223px;">B0537S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">WarmStart RTx Reverse Transcriptase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:223px;">M0380S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antarctic Thermolabile UDG</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:223px;">M0372S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgSO4</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:223px;">B1003S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100mM dATP Solution</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:223px;">N0440S</td>
			<td>Deoxynucleotide Set N0446S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100mM dCTP Solution</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:223px;">N0441S</td>
			<td>Deoxynucleotide Set N0446S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100mM dTTP Solution</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:223px;">N0443S</td>
			<td>Deoxynucleotide Set N0446S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100mM dGTP Solution</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:223px;">N0442S</td>
			<td>Deoxynucleotide Set N0446S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100mM dUTP Solution</td>
			<td style="width:223px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:223px;">R0133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td style="width:223px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:223px;">S7563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nancy-520</td>
			<td style="width:223px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:223px;">01494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Low DNA Mass Ladder</td>
			<td style="width:223px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:223px;">10-068-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Zika Postive Control</td>
			<td style="width:223px;">Robert Koch Institute, Germany</td>
			<td style="width:223px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Agarose</td>
			<td style="width:223px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:223px;">BP1600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">BlueJuice Gel Loading Buffer</td>
			<td style="width:223px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:223px;">10816015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Primers</td>
			<td style="width:223px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:223px;">Custom Oligo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Nuclease-Free Water</td>
			<td style="width:223px;">Ambion</td>
			<td style="width:223px;">AM9938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Urine Preservative</td>
			<td style="width:223px;">Norgen Biotek</td>
			<td style="width:223px;">18126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">ZIKV PCR Standard</td>
			<td>Robert Koch Institute</td>
			<td style="width:223px;">N/A</td>
			<td>Vero E6 cell supernatants</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">DENV2 New Guinea C Control</td>
			<td style="width:223px;">Connecticut Agricultural Experiment Station</td>
			<td style="width:223px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification (rt-lamp) assay for zika virus and housekeeping genes in urine, serum, and mosquito samples

Infektion med Zika virus (ZIKV) kan være asymptomatisk hos voksne, men infektion under graviditet kan føre til abort og alvorlige neurologiske fødselsdefekter. Målet med denne protokol er at hurtigt opdage ZIKV i både menneskelige og myg prøver. Den nuværende guld standard for ZIKV påvisning er kvantitative reverse transkription PCR (qRT-PCR); reverse transkription loop-medieret isotermisk forstærkning (RT-lampe) kan give mulighed for en mere effektiv og billig test uden behov for dyrt udstyr. I denne undersøgelse bruges RT-LAMPEN til påvisning af ZIKV i forskellige biologiske prøver inden for 30 min, uden første isolering af RNA fra prøven. Denne teknik er påvist ved hjælp af ZIKV inficerede patient urin og serum, og inficerede myg prøver. 18s ribosomale ribonukleinsyre og actin er brugt som kontrolelementer i menneskelige og myg prøver, henholdsvis.

RT-lampe reaktioner kan analyseres ved hjælp af tre forskellige metoder. Først, med tilsætning af en fluorescerende nukleinsyre farvestof, positive reaktioner vil være gul/grøn farve hvor negative reaktioner vises orange farve med det blotte øje. Andet, tilsætning af fluorescerende nukleinsyre farvestof til RT-lampe reaktion resulterer i et fluorescerende signal når prøverne er ophidset af UV-lys. Negative reaktioner vil ikke have en påviselig fluorescerende signal over enhver b...

Watch this Scientific Journal Video about Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification RT-LAMP Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples at JoVE

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification RT-LAMP Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

Reverse transkription-Loop-medieret isotermisk forstærkning (RT-lampe) Assay for Zika Virus og husholdning gener i urin, Serum og myg prøver

Denne protokol giver en effektiv og billig metode til at registrere Zika virus eller styre mål i human urin og serum prøver eller myg ved reverse transkription loop-medieret isotermisk forstærkning (RT-lampe). Denne metode kræver ikke RNA isolering og kan ske inden for 30 min.

Infection with Zika virus (ZIKV) can be asymptomatic in adults, however, infection during pregnancy can lead to miscarriage and severe neurological birth ...

Denne metode kan hurtigt afgøre, om prøver indeholder Zika virus. Dette er nyttigt for gravide kvinder, par forsøger at blive gravide, eller overvågning af lokale myg befolkninger, der er i risiko for Zika infektion. Den største fordel ved denne teknik er, at det er hurtigt, nemt, ikke kræver dyrt udstyr, og kan gøres uden en RNA isolation trin.Konsekvenserne af denne teknik strækker sig i retning af diagnosticering af Zika infektion, fordi infektion under graviditet er knyttet til abort, dødfødsel, og andre alvorlige medfødte, neurologiske fødselsdefekter. Selv om denne metode kan give indsigt i Zika, det kan også anvendes til andre smitsomme sygdomme såsom denguefeber, chikungunya, eller West Nile virus ved hjælp af virus-specifikke primere. Til at begynde, rekonstituere hver RT-LAMP primer i molekylær kvalitet vand til en endelig koncentration på 100 mikromolar.Kort vortex primer løsning for at sikre, at opløsningen er homogen. Centrifuge i ca. fem sekunder ved maksimal hastighed for at samle primeropløsningen. Derefter forberede en 10x RT-LAMP primer mix som skitseret i tabel to af tech's protokol.Vortex kort for at sikre homogenitet. Og centrifuge kort ved maksimal hastighed for at undgå tab. Opbevar primere på minus 20 grader Celsius, mellem anvendelser, undgå enhver fryse-tø cykler.For humane urinprøver, bruge enten frisk urin, frossen urin eller urin i konserveringsmiddel. Tø frosne prøver op på is før brug. Humane serumprøver skal enten være friske eller frosne, mens ZIKV-inficerede cellelinjer skal indeholde enten konditionerede medier eller cellelysater.Endelig, for Aedes aegypti myg, bruge hele kroppe, enten friske eller frosne. Tø eventuelle frosne myg kroppe på is. Placer en individuel myg i 100 mikroliter af PBS.Ved hjælp af en P10 pipette spids knuse myg 10 gange, og homogenisere det til at skabe en rå myg lysate. Kortvarigt centrifuger rå lysatet til pellet eventuelle rester og bruge supernatant til downstream RT-LAMP analyse. Til at begynde, forberede en RT-LAMP master mix reaktion på is for hver primer sæt, der skal anvendes, som skitse ved tabel tre i tech's protokol.Vortex hver prøve for at sikre, at det er godt blandet. Derefter kort dreje dem ned for at forhindre volumen tab. For hver reaktion blandes 23,0 mikroliter af RT-LAMP-masteren i et 200 mikroliter-PCR-rør.Derefter tilsættes to mikroliter af prøve for at bringe det samlede volumen til 25,0 mikroliter. Brug molekylærkvalitet vand til den negative kontrol, og sørg for at medtage en positiv kontrol. Eventuelt, omfatte en specificitet kontrol reaktion af en relateret arbovirus såsom dengue virus, som skitseret i tech's protokol.Ved hjælp af en varmeblok, vandbad, eller en termocykstyring, varme prøverne ved 61 grader Celsius i 30 minutter. Efter dette, øge varmen til 80 grader Celsius i 10 minutter for at opvarme deaktivere polymerase. Udfør RT-LAMP-analysen i et separat lukket rum.Fortyndes fluorescerende nukleinsyre farvestof en til ti i TAE buffer. Der tilsættes to micorliters af fluorescerende nukleinsyrefarvopløsning til 12 micorliters af RT-LAMP-reaktionen. Vurder RT-LAMP-reaktionerne visuelt ved at lede efter tilstedeværelsen af en farveændring.Du kan eventuelt bruge et kamera til at tage billeder af RT-LAMP-reaktioner på en hvid baggrund. Dernæst placere prøverne under en 302 nanometer UV-lys for at bekræfte tilstedeværelsen af RT-LAMP produkter ved fluorescens. Brug et kamera til at tage et billede af resultatet.At begynde at udføre elektroforese hæld 2% agarose gel i 1x TAE buffer med en nukleinsyre plet til visualisering. Tilføj fem mikroliter af en DNA-stige i den første vognbane for at sammenligne molekylære vægte. For hver RT-LAMP reaktion blandes 13 mikroliter RT-LAMP reaktionsblanding med to mikroliter DNA-belastningsfarvestof.Læg denne 15 mikroliterblanding. Kør gelen ved 90 volt i 90 minutter, eller indtil båndene er adskilt. Et billede med 302 nanometer UV-lys.Når du er færdig, bortskaffes RT-LAMP-reaktioner i dobbeltforseglede poser. I denne undersøgelse anvendes tre forskellige metoder til at analysere RT-LAMP reaktioner. Når du bruger fluorescerende nukleinsyre farvestof positive reaktioner bliver gul-grøn i farven, mens negative reaktioner vises orange.Dette farvestof resulterer også i et fluorescerende signal, når prøverne er ophidset af UV-lys. Endelig kan RT-LAMP reaktioner køres ud på en agarose gel. Positive RT-LAMP reaktioner vil have et banding mønster, mens negative reaktioner vil have nogen DNA-bands.Disse metoder anvendes til at påvise specificiteten af ZIKV RT-LAMP-reaktionen. Kun ZIKV molekylære kontrol har en positiv RT-LAMP reaktion. Mens ZIKV påvises i både urin og serum hos en patient med kendt ZIKV-infektion, ses det desuden ikke hos den asymptomatiske kontrolpatient uden ZIKV-infektion.Prøverne testes derefter for human 18S rRNA. Kun de prøver, der er taget fra patienterne, ses at være positive for 18S rRNA. Myggeprøver kan testes på samme måde for ZIKV eller RT-LAMP-kvalitetskontrol AEDAE.Kun den positive molekylære kontrol for ZIKV og myg inficeret med ZIKV ses at være positiv for ZIKV. Men alle myg er positive for AEDAE af RT-LAMP. Når behersket, kan denne teknik gøres på under 30 minutter, hvis det udføres korrekt.Det er vigtigt at huske, at RT-LAMP reaktioner er tilbøjelige til falske positive reaktioner. Forebyggelsestrin omfatter brug af en termolabile uracil DNA glycosylase i reaktioner, ved hjælp af en lateral arbejdsgang, udfører analyse i et separat rum, og reducere tid efter forstærkning rør er åbne. Efter denne procedure andre metoder som QPCR kan udføres for at besvare yderligere spørgsmål, ligesom hvor mange kopier virus, eller andre mål, er til stede i prøven.Efter at have set denne video, bør du have en god forståelse af, hvordan du bruger RT-LAMP til at opdage Zika virus og målrette kontrol i human urin og serum, samt myg. Glem ikke, at arbejde med Zika virus og nukleinsyre plet kan være yderst farligt, og forholdsregler såsom iført handsker bør altid tages, mens du udfører denne procedure. I betragtning af sammenslutningen af Zika virus infektion med medfødte abnormiteter, kvinder, der er gravide, forsøger at blive gravide, eller partnere af disse kvinder, bør minimere deres laboratorieeksponering for Zika virus.

Research

JoVE Journal

Genetics

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

The Use of Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

The Use of Induced Somatic Sector Analysis ISSA for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

Brug af induceret Somatisk Sector Analysis (ISSA) for at studere Gener og Initiativtagere involveret i Wood Formation og Sekundær Stem Development

Secondary stem growth in trees and associated wood formation are significant both from biological and commercial perspectives. However, relatively little ...

Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

Peptid-afledt metode til Transport gener og proteiner Across Cellular og Organellar Barrierer i Planter

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Bestemmelse af Optimal kromosomale placering for en DNA Element i Escherichia coli ved hjælp af en roman Transposon-medieret tilgang

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Kromatin Immunoprecipitation (ChIP) protokol for lav-overflod embryonale prøver

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Høj opløsning fluorescerende In Situ hybridisering i Drosophila fostre og væv ved hjælp af Tyramide Signal forstærkning

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells sf9 for Protein Functional Assay

Forbigående udtryk af fremmede gener i insekt celler (sf9) for Protein funktionel analyse

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell ...

Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer

Tilpasse 3' slutter hurtige forstærkning af CDNA for at kortlægge udskrifter i kræft

Maturation of eukaryotic mRNAs involves 3&#39; end formation, which involves the addition of a poly(A) tail. In order to map the 3&#39; end of a gene, the ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Forstærkning af nær fuld længde HIV-1 provirus for næste Generation Sequencing

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

Evaluering af en universel indlejret reverse transkription polymerase kædereaktion til påvisning af Lyssavira

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

En in vitro-protokol til evaluering af MicroRNA-niveauer, funktioner og tilknyttede Målgener i tumor celler

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...