Name: reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification (rt-lamp) assay for zika virus and housekeeping genes in urine, serum, and mosquito samples
Uploaded: 2018-09-14T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification RT-LAMP Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples at JoVE

עבודה זו נתמכה על ידי תרומה פילנתרופית משפחה מורין, רונלד הירש שדה מכון מדעי המח, כנסיית מריה הקדושה של מישיגן. התורמים שחיים היה אין תפקיד תכנון המחקר, איסוף נתונים, ניתוח, ההחלטה לפרסם או אופן ההכנה של כתב היד. אנו מודים גם ד ר ברנדט Zwaans, אליהו וורד עבור שלהם סקירה ביקורתית של כתב היד.

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי המוסדיים סקירה לוח (IRB) של בריאות בומונט. כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות הרלוונטיים ולתקנות.
התראה: כל חומר העלול זיהומיות צריך להיות מטופל על פי תקני אבטחה ברמה 2 כולל השימוש של ציוד מגן אישי. כל הנהלים, אשר עשויה לייצר תרסיס צריכה להתבצע ב...

<ol>
	<li>Petersen, L. R., Jamieson, D. J., Powers, A. M., Honein, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus.">Zika Virus.</a> New England Journal of Medicine. 374 (16), 1552-1563 (2016).</li><li>Francois, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robustness+of+a+loop-mediated+isothermal+amplification+reaction+for+diagnostic+applications.">Robustness of a loop-mediated isothermal amplification reaction for diagnostic applications.</a> Federation of European Microbiological Societies Immunology and Medical Microbiology. 62 (1), 41-48 (2011).</li><li>Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP)+of+gene+sequences+and+simple+visual+detection+of+products.">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products.</a> Nature Protocols. 3 (5), 877-882 (2008).</li><li>Gandasegui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rapid-Heat+LAMPellet+Method:+A+Potential+Diagnostic+Method+for+Human+Urogenital+Schistosomiasis.">The Rapid-Heat LAMPellet Method: A Potential Diagnostic Method for Human Urogenital Schistosomiasis.</a> Public Library of Science Neglected Tropical Diseases. 9 (7), 0003963 (2015).</li><li>Barkway, C. P., Pocock, R. L., Vrba, V., Blake, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP)+assays+for+the+species-specific+detection+of+Eimeria+that+infect+chickens.">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays for the species-specific detection of Eimeria that infect chickens.</a> The Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).</li><li>Lamb, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Detection+of+Zika+Virus+in+Urine+Samples+and+Infected+Mosquitos+by+Reverse+Transcription-Loop-Mediated+Isothermal+Amplification.">Rapid Detection of Zika Virus in Urine Samples and Infected Mosquitos by Reverse Transcription-Loop-Mediated Isothermal Amplification.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3803 (2018).</li><li>Faye, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+RT-PCR+for+detection+of+Zika+virus.">One-step RT-PCR for detection of Zika virus.</a> Journal of Clinical Virology. 43 (1), 96-101 (2008).</li><li>Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+inhibitors+-+occurrence,+properties+and+removal.">PCR inhibitors - occurrence, properties and removal.</a> Journal of Applied Microbiology. 113 (5), 1014-1026 (2012).</li><li>Poole, C. B., Tanner, N. A., Zhang, Y., Evans, T. C., Carlow, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+brugian+filariasis+by+loop-mediated+isothermal+amplification.">Diagnosis of brugian filariasis by loop-mediated isothermal amplification.</a> Public Library of Science Neglected Tropical Diseases. 6 (12), 1948 (2012).</li><li>Tanner, N. A., Zhang, Y., Evans, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+multiple+target+detection+in+real-time+loop-mediated+isothermal+amplification.">Simultaneous multiple target detection in real-time loop-mediated isothermal amplification.</a> Biotechniques. 53 (2), 81-89 (2012).</li><li>Chan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+Affordable+and+Portable+Medium-Throughput+Molecular+Device+for+Zika+Virus.">Rapid, Affordable and Portable Medium-Throughput Molecular Device for Zika Virus.</a> Scientific Reports. 6, 38223 (2016).</li><li>Lee, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+Highly+Sensitive+Molecular+Diagnosis+of+Zika+Virus+by+Lateral+Flow+Assays.">Simple and Highly Sensitive Molecular Diagnosis of Zika Virus by Lateral Flow Assays.</a> Analytical Chemistry. 88 (24), 12272-12278 (2016).</li><li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-Cost+Detection+of+Zika+Virus+Using+Programmable+Biomolecular+Components.">Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components.</a> Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).</li><li>Song, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instrument-Free+Point-of-Care+Molecular+Detection+of+Zika+Virus.">Instrument-Free Point-of-Care Molecular Detection of Zika Virus.</a> Analytical Chemistry. 88 (14), 7289-7294 (2016).</li><li>Yaren, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Point+of+sampling+detection+of+Zika+virus+within+a+multiplexed+kit+capable+of+detecting+dengue+and+chikungunya.">Point of sampling detection of Zika virus within a multiplexed kit capable of detecting dengue and chikungunya.</a> BioMed Central Infectious Diseases. 17 (1), 293 (2017).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+sensitive+detection+of+Zika+virus+by+reverse+transcription+loop-mediated+isothermal+amplification.">Rapid and sensitive detection of Zika virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification.</a> Journal of Virological Methods. 238, 86-93 (2016).</li><li>Priye, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+smartphone-based+diagnostic+platform+for+rapid+detection+of+Zika,+chikungunya,+and+dengue+viruses.">A smartphone-based diagnostic platform for rapid detection of Zika, chikungunya, and dengue viruses.</a> Scientific Reports. 7, 44778 (2017).</li></ol>

וזמינותו ZIKV RT-המנורה המתוארת בעלון זה עבודות נייר באמצעות דגימות של האדם והן יתושים-6. המגבלה של זיהוי היה כ 1 גנום שוות ערך6, אשר אמורה להספיק מאז המטען הנגיפי טיפוסי של חולה סימפטומטי ZIKV נגוע הוא 103 כדי 6 10 PFU/mL7. בנוסף, שיטה זו יכול לזה?...

בשנת 2015, Zika וירוס (ZIKV) צבר תשומת הלב העולמית בולטים כמו מחלה זיהומית של דאגה מפני זיהום במהלך ההריון היה קשור להפלה, לידות, חמור נוירולוגיות מומים מולדים כולל microcephaly, כמו גם אחרים מולדת מומים מולדים1. במקרים נדירים, ZIKV נמצא קשור תסמונת גיליאן. ZIKV מועבר בעיקר על ידי יתושי אאדס; עם זאת, זה יכול גם להיות להתפשט באמצעות מגע מיני1. בהתחשב בכך הזיהום עם ZIKV ללא תסמינים אצל רוב האנשים, או מציג עם מתון תסמינים דמויי שפעת חופפים עם הסימפטומים של זיהום של אחרים arborviruses1, היה צורך עבור שיפור שיטות גילוי מהירה וחסכונית של ZIKV למסך גם אנשים, כמו גם אוכלוסיות יתוש מקומיים.
שעתוק במהופך כמותיים PCR (לרביעיית-PCR) הוא assay אמין לצורך זיהוי ZIKV; עם זאת, טכניקה זו דורש ציוד מיוחד יקר, צוות מיומן, ובידוד RNA מדגם של ריבית. שעתוק במהופך בתיווך לולאה איזותרמי הגברה (RT-המנורה) היא שיטה הגברה חומצת גרעין בשלב אחד מבוסס על טכנולוגיית ה-PCR הדורש רק בטמפרטורת דגירה אחת עקב השימוש לרום DNA פולימראז עם סטרנד מאפייני העקירה. זה עוקף את הצורך thermocycler, מקטין את משך הזמן הדרוש כדי להשלים את הבדיקה. יתרונות נוספים של RT-המנורה כוללים שלה ירידה לפרטים גבוהה, רגישות, חוסן במגוון של רמות ה-pH, טמפרטורות, והתנגדות PCR רבים מעכבי2. יש יחסית נמוכים, ריאגנטים יציבים בטמפרטורת החדר. לאור מאפיינים אלה, RT-המנורה ניתן לפרוס במעבדה או בשטח. ככזה, המנורה תגובות פותחו כדי לזהות מגוון של פתוגנים וסוגים אחרים של זיהום3,4,5. המטרה של פרוטוקול RT-המנורה המתוארת במאמר זה היא לזהות את ZIKV ללא בידוד RNA בדגימות האנושי סרום ושתן באותה מידה כמו יתוש הנגוע יחיד בתוך 30 דקות באמצעות RT-המנורה. בשיטה זו ניתן להחליף לרביעיית-PCR כפי שהוא כלי אבחון רגיש, מהירה שפועל במהירות ובאופן בהגדרות מחוץ למעבדה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:901px;" width="902">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Bst 2.0 WarmStart DNA polymerase</td>
			<td style="width:223px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:223px;">M0537S</td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isothermal Amplification Buffer&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:223px;">B0537S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">WarmStart RTx Reverse Transcriptase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:223px;">M0380S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antarctic Thermolabile UDG</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:223px;">M0372S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgSO4</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:223px;">B1003S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100mM dATP Solution</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:223px;">N0440S</td>
			<td>Deoxynucleotide Set N0446S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100mM dCTP Solution</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:223px;">N0441S</td>
			<td>Deoxynucleotide Set N0446S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100mM dTTP Solution</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:223px;">N0443S</td>
			<td>Deoxynucleotide Set N0446S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100mM dGTP Solution</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:223px;">N0442S</td>
			<td>Deoxynucleotide Set N0446S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100mM dUTP Solution</td>
			<td style="width:223px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:223px;">R0133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td style="width:223px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:223px;">S7563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nancy-520</td>
			<td style="width:223px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:223px;">01494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Low DNA Mass Ladder</td>
			<td style="width:223px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:223px;">10-068-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Zika Postive Control</td>
			<td style="width:223px;">Robert Koch Institute, Germany</td>
			<td style="width:223px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Agarose</td>
			<td style="width:223px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:223px;">BP1600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">BlueJuice Gel Loading Buffer</td>
			<td style="width:223px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:223px;">10816015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Primers</td>
			<td style="width:223px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:223px;">Custom Oligo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Nuclease-Free Water</td>
			<td style="width:223px;">Ambion</td>
			<td style="width:223px;">AM9938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Urine Preservative</td>
			<td style="width:223px;">Norgen Biotek</td>
			<td style="width:223px;">18126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">ZIKV PCR Standard</td>
			<td>Robert Koch Institute</td>
			<td style="width:223px;">N/A</td>
			<td>Vero E6 cell supernatants</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">DENV2 New Guinea C Control</td>
			<td style="width:223px;">Connecticut Agricultural Experiment Station</td>
			<td style="width:223px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification (rt-lamp) assay for zika virus and housekeeping genes in urine, serum, and mosquito samples

זיהום בנגיף Zika (ZIKV) יכול להיות אסימפטומטיים במבוגרים, לעומת זאת, זיהום במהלך ההריון יכול לגרום להפלה מולדים נוירולוגיות חמורות. המטרה של פרוטוקול זה היא לזהות במהירות ZIKV בדגימות האדם והן יתושים. תקן הזהב הנוכחי לגילוי ZIKV הוא שעתוק במהופך כמותיים PCR (לרביעיית-PCR); שעתוק במהופך בתיווך לולאה איזותרמי הגברה (RT-המנורה) עשוי לאפשר לבדיקה יותר יעיל, בעלות נמוכה ללא צורך ציוד יקר. במחקר זה, RT-המנורה שימוש לצורך זיהוי ZIKV בדגימות ביולוגיות שונות בתוך 30 דקות, ללא הראשונה לבודד את הרנ א מדגם. טכניקה זו הוכח שימוש ZIKV נגוע סרום ושתן המטופל ולאחר נגוע דגימות יתושים. חומצה ריבונוקלאית ribosomal 18S אקטין משמשים כפקדי בדגימות האדם וכילה נגד יתושים, בהתאמה.

RT-המנורה תגובות ניתן לנתח באמצעות שלוש שיטות שונות. ראשית, עם התוספת של צבע פלורסנט חומצת גרעין, תגובות חיוביות יהיה צהוב/ירוק צבע היכן תגובות שליליות. תופיע כתום בעין בלתי מזוינת. שנית, התוספת של חומצת גרעין פלורסנט לצבוע את התגובה RT-המנורה תוצאות ב אות ניאון כאשר הדגימות...

Watch this Scientific Journal Video about Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification RT-LAMP Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples at JoVE

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification RT-LAMP Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

הפוך שעתוק לולאה-בתיווך איזותרמי הגברה (RT-המנורה) Assay Zika וירוס, ניקיון בגנים שתן, סרום, ודוגמאות יתוש

פרוטוקול זה מספק שיטה יעילה, בעלות נמוכה לזהות וירוס Zika או שליטה מטרות בדגימות שתן וסרום אנושי או יתושים על ידי שעתוק במהופך בתיווך לולאה איזותרמי הגברה (RT-המנורה). שיטה זו אינה דורשת בידוד RNA והוא יכול להיעשות תוך 30 דקות.

Infection with Zika virus (ZIKV) can be asymptomatic in adults, however, infection during pregnancy can lead to miscarriage and severe neurological birth ...

שיטה זו יכולה לקבוע במהירות אם דגימות מכילות וירוס זיקה. זה שימושי עבור נשים בהריון, זוגות מנסים להרות, או מעקב אחר אוכלוסיות יתושים מקומיות בסיכון לזיהום זיקה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שזה מהיר, קל, אינו דורש ציוד יקר, והוא יכול להיעשות ללא צעד בידוד RNA.ההשלכות של טכניקה זו להרחיב לקראת אבחון של זיהום זיקה, כי זיהום במהלך ההריון קשורה הפלה, לידה שקטה, ומומים מולדים חמורים אחרים, מומים מולדים נוירולוגיים מולדים. למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה לתוך זיקה, זה יכול להיות מיושם גם על מחלות זיהומיות אחרות כגון דנגי, chikungunya, או וירוס הנילוס המערבי באמצעות פריימרים ספציפיים לנגיף. כדי להתחיל, reconstitute כל פריימר RT-LAMP במים כיתה מולקולרית לריכוז סופי של 100 micromolar.בקצרה מערבולת הפתרון פריימר כדי להבטיח את הפתרון הוא הומוגני. צנטריפוגה במשך כחמש שניות במהירות המרבית כדי לאסוף את הפתרון פריימר. לאחר מכן הכינו תערובת פריימר RT-LAMP 10x כמתואר בטבלה 2 של פרוטוקול הטכנולוגיה.וורטקס בקצרה כדי להבטיח הומוגניות. וצנטריפוגה לזמן קצר במהירות מקסימלית כדי למנוע כל אובדן. לאחסן את פריימרים במינוס 20 מעלות צלזיוס, בין שימושים, הימנעות כל מחזורי הפשרה הקפאה.לדגימות שתן אנושיות, יש להשתמש בשתן טרי, שתן קפוא או שתן בחומר משמר. להפשיר דגימות קפואות על קרח לפני השימוש. דגימות סרום אנושיות צריכות להיות טריות או קפואות, בעוד שקווי תאים נגועים ב- ZIKV צריכים להכיל lysates מדיה או תאים מותנים.לבסוף, עבור יתושים Aedes aegypti, להשתמש פקות שלמות, טרי או קפוא. להפשיר כל אוכלוסיות יתושים קפואות על קרח. מניחים יתוש בודד ב 100 microliters של PBS.באמצעות טיפ P10 פיפטה למחוץ את היתוש 10 פעמים, הומוגניזציה אותו כדי ליצור ליזאט יתוש גס. בקצרה צנטריפוגה lysate הגולמי כדי גלולה כל פסולת ולהשתמש supernatant לניתוח RT-LAMP במורד הזרם. כדי להתחיל, הכן תגובת ערבוב מאסטר RT-LAMP על קרח עבור כל פריימר להגדיר לשמש, כמו חלוקה לרמות על ידי טבלה שלוש בפרוטוקול של טק.Vortex כל מדגם כדי להבטיח שהוא מעורבב היטב. ואז לסובב אותם בקצרה למטה כדי למנוע אובדן נפח. עבור כל תגובה, פיפטה 23.0 microliters של RT-LAMP מאסטר לערבב לתוך צינור PCR 200 מיקרוליטר.לאחר מכן, הוסף שני מיקרוליטרים של מדגם כדי להביא את הנפח הכולל ל 25.0 microliters. השתמש במים כיתה מולקולרית עבור שליטה שלילית, וודא לכלול שליטה חיובית. באופן אופציונלי, כלול תגובת בקרת ספציפיות של arbovirus הקשורים כגון וירוס דנגי, כמתואר בפרוטוקול של טק.באמצעות בלוק חום, אמבט מים, או תרמוצ'ילר, מחממים את הדגימות ב 61 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לאחר מכן, להגדיל את החום ל 80 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי לחמם לנטרל את הפולימראז. בצע את ניתוח RT-LAMP בשטח סגור נפרד.מדללים את צבע חומצת הגרעין הפלואורסצנטית 1 עד 10 במאגר TAE. הוסף שני micorliters של פתרון צבע חומצת גרעין פלואורסצנטי 12 micorliters של תגובת RT-LAMP. להעריך את התגובות RT-LAMP חזותית על ידי חיפוש נוכחות של שינוי צבע.באופן אופציונלי, השתמש במצלמה כדי לצלם תמונות של תגובות RT-LAMP על רקע לבן. לאחר מכן, למקם את הדגימות תחת 302 ננומטר אור UV כדי לאשר את נוכחותם של מוצרי RT-LAMP על ידי פלואורסצנטיות. השתמש במצלמה כדי לצלם תמונה של התוצאה.כדי להתחיל לבצע אלקטרופורזה לשפוך 2% ג'ל agarose במאגר 1x TAE עם כתם חומצת גרעין להדמיה. הוסף חמישה מיקרוליטרים של סולם דנ"א בנתיב הראשון כדי להשוות את המשקולות המולקולריות. עבור כל תגובת RT-LAMP, יש לערבב 13 מיקרוליטרים של תערובת תגובת RT-LAMP עם שני מיקרוליטרים של צבע טעינת דנ"א.טען את תערובת ה-15 מיקרוליטר הזו. מפעילים את הג'ל ב-90 וולט במשך 90 דקות או עד שהרצועות מופרדות. תמונה עם 302 ננומטר אור UV.בסיום, יש להיפטר מתגובות RT-LAMP בשקיות אטומות כפולות. במחקר זה, שלוש שיטות שונות מנוצלות כדי לנתח תגובות RT-LAMP. בעת שימוש חומצת גרעין פלואורסצנטית צבע תגובות חיוביות להיות צהוב-ירוק בצבע, בעוד תגובות שליליות מופיעות כתום.צבע זה גם תוצאות אות פלואורסצנטי כאשר דגימות נרגשים על ידי אור UV. לבסוף, תגובות RT-LAMP ניתן לרוץ על ג'ל אגרוז. לתגובות חיוביות של RT-LAMP יהיה דפוס פסים, בעוד שלתגובות שליליות לא יהיו להקות דנ"א.שיטות אלה משמשות להדגים את הספציפיות של תגובת ZIKV RT-LAMP. רק לשליטה המולקולרית של ZIKV יש תגובת RT-LAMP חיובית. יתר על כן, בעוד ZIKV מזוהה הן בשתן והן בסרום של חולה עם זיהום ZIKV ידוע, זה לא נראה בחולה שליטה אסימפטומטית ללא זיהום ZIKV.הדגימות נבדקות לאחר מכן עבור rRNA 18S אנושי. רק הדגימות שנלקחו מחולים נראים חיוביים עבור 18S rRNA. דגימות יתושים ניתן לבדוק באופן דומה עבור ZIKV או בקרת איכות RT-LAMP AEDAE.רק השליטה המולקולרית החיובית עבור ZIKV והיתוש הנגוע ב- ZIKV נראים חיוביים עבור ZIKV. עם זאת כל היתושים חיוביים עבור AEDAE על ידי RT-LAMP. לאחר השליטה, טכניקה זו יכולה להיעשות בתוך פחות מ -30 דקות אם היא מבוצעת כראוי.חשוב לזכור שתגובות RT-LAMP נוטות לתגובות חיוביות שגויות. שלבי מניעה כוללים שימוש ב- DNA תרמולאבילי uracil בתגובות, שימוש בזרימת עבודה מצדדים, ביצוע ניתוח בחלל נפרד, והפחתת צינורות הגברה פוסט זמן פתוחים. בעקבות הליך זה ניתן לבצע שיטות אחרות כמו QPCR על מנת לענות על שאלות נוספות, כמו כמה עותקים הנגיף, או מטרות אחרות, נמצאים המדגם.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך הבנה טובה של איך להשתמש RT-LAMP כדי לזהות וירוס זיקה ובקרות היעד בשתן האנושי בסרום, כמו גם יתושים. אל תשכח כי עבודה עם וירוס זיקה וכתם חומצת גרעין יכול להיות מסוכן מאוד, אמצעי זהירות כגון לבישת כפפות תמיד צריך לנקוט בעת ביצוע הליך זה. בהתחשב הקשר של זיהום וירוס זיקה עם מומים מולדים, נשים בהריון, מנסה להרות, או שותפים של נשים אלה, צריך למזער באופן משמעותי את החשיפה למעבדה שלהם וירוס זיקה.

Research

JoVE Journal

Genetics

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

The Use of Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

The Use of Induced Somatic Sector Analysis ISSA for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

השימוש בניתוח מגזר סומטיים מושרה (ISSA) לימוד גנים ומקדמי המעורבים ביצירת עץ ופיתוח גזע משניים

Secondary stem growth in trees and associated wood formation are significant both from biological and commercial perspectives. However, relatively little ...

Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

פפטיד הנגזרות שיטה לתחבורה גנים וחלבונים מעבר נייד מחסומי Organellar בצמחים

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

קביעת Location(s) כרומוזומלית האופטימלית עבור רכיב ה-DNA ב- Escherichia coli באמצעות גישה מוזרה בתיווך Transposon

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

כרומטין פרוטוקול Immunoprecipitation (ChIP) עבור דגימות עובריים נמוך-שפע

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

ברזולוציה גבוהה פלורסנט בחיי עיר הכלאה של עוברי דרוזופילה ורקמות באמצעות הגברה Tyramide אות

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells sf9 for Protein Functional Assay

הביטוי ארעית של גנים זרים בתאי חרקים (sf9) עבור שיטת פונקציונלי

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell ...

Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer

התאמת 3' הגברה מהירה של CDNA מסתיים למפות תעתיקים של סרטן

Maturation of eukaryotic mRNAs involves 3&#39; end formation, which involves the addition of a poly(A) tail. In order to map the 3&#39; end of a gene, the ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

הגברה של יד באורך מלא הפרו-וירוס HIV-1 עבור הדור הבא רצפי

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

הערכה של מקונן אוניברסלי הפוכה תגובת שרשרת פולימראז לאיתור של Lyssaviruses

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

פרוטוקול מחוץ לגופית להערכת רמות מיקרוארנה, פונקציות, וגנים היעד הקשורים בתאי הגידול

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...