Name: reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification (rt-lamp) assay for zika virus and housekeeping genes in urine, serum, and mosquito samples
Uploaded: 2018-09-14T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification RT-LAMP Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples at JoVE

Questo lavoro è stato supportato dal contributo filantropico famiglia Maureen e Ronald Hirsch e campo Neurosciences Institute, s. Maria del Michigan. I finanziatori non avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, raccolta dati e analisi, decisione di pubblicare o preparazione del manoscritto. Ringraziamo anche Dr. Bernadette Zwaans ed Elijah Ward per la loro revisione critica del manoscritto.

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati da istituzionale Review Board (IRB) della salute di Beaumont. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti conformemente alle norme e linee guida pertinenti.
Attenzione: Tutti i materiali potenzialmente infettivi devono essere manipolati secondo gli standard di livello 2 di biosicurezza compreso l'uso di dispositivi di protezione individuale. Eventuali procedure che possono produrre aerosol devono essere eseguite in una cappa di biosicurezza. Inol...

<ol>
	<li>Petersen, L. R., Jamieson, D. J., Powers, A. M., Honein, M. 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B., Tanner, N. A., Zhang, Y., Evans, T. C., Carlow, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+brugian+filariasis+by+loop-mediated+isothermal+amplification.">Diagnosis of brugian filariasis by loop-mediated isothermal amplification.</a> Public Library of Science Neglected Tropical Diseases. 6 (12), 1948 (2012).</li><li>Tanner, N. A., Zhang, Y., Evans, T. 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Il dosaggio di ZIKV RT-LAMP descritto in questa carta funziona utilizzando sia umani e zanzara campioni6. Il limite di rilevazione era circa 1 genoma equivalente6, che dovrebbe essere sufficiente, poiché il carico virale tipico di un paziente sintomatico ZIKV infettata è 103 a PFU/mL 106 7. Inoltre, questo metodo può rilevare ZIKV nei campioni senza primo isolamento di RNA e senza amplificazione di virus in coltur...

Nel 2015, virus di Zika (ZIKV) guadagnato l'attenzione globale prominente come una malattia infettiva di preoccupazione perché l'infezione durante la gravidanza è stato collegato a aborto spontaneo, morte endouterina, gravi difetti di nascita neurologici compreso microcefalia, come pure altri congenita difetti di nascita1. In rari casi, ZIKV è stato associato con la sindrome di Guillain-Barré. ZIKV principalmente è trasmessa dalle zanzare Aedes ; Tuttavia, può anche essere sparso attraverso il contatto sessuale1. Dato che l'infezione con ZIKV è asintomatica nella maggior parte delle persone o presenta con lievi sintomi simil-influenzali che si sovrappongono con i sintomi di infezione di altri arborviruses1, ci era un'esigenza di miglioramento dei metodi per la rilevazione rapida e conveniente di ZIKV a schermo persone nonché a popolazioni di zanzare locali.
Trascrizione d'inversione quantitativa PCR (qRT-PCR) è un test affidabile per la determinazione di ZIKV; Tuttavia, questa tecnica richiede costose attrezzature specializzate, personale addestrato e l'isolamento di RNA dal campione di interesse. Amplificazione isotermica mediata da loop trascrizione inversa (RT-LAMP) è un metodo di amplificazione dell'acido nucleico di One-Step basato su tecnologia PCR che richiede solo una temperatura di incubazione dovute all'uso di una DNA polimerasi termofila con filo Proprietà di scostamento. Questo aggira la necessità per un termociclatore e diminuisce la lunghezza del tempo necessario per completare il test. Ulteriori vantaggi del RT-LAMP includono la sua alta specificità e sensibilità, robustezza ad una gamma di temperature e livelli di pH, di resistenza a molti di inibitori della PCR2. Ha un costo relativamente basso e i reagenti sono stabili a temperatura ambiente. Date queste caratteristiche, RT-LAMP può essere distribuito in un laboratorio o sul campo. Come tale, reazioni di lampada sono state sviluppate per rilevare una gamma di agenti patogeni e altri tipi di infezione3,4,5. L'obiettivo del protocollo RT-LAMP descritto in questa carta è di rilevare ZIKV senza isolamento del RNA in umani campioni di siero e urina come pure come in una singola zanzara infetta entro 30 min attraverso RT-LAMP. Questo metodo può essere utilizzato per sostituire qRT-PCR, in quanto è uno strumento diagnostico rapido, sensibile che funziona rapidamente e in contesti di fuori del laboratorio.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:901px;" width="902">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Bst 2.0 WarmStart DNA polymerase</td>
			<td style="width:223px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:223px;">M0537S</td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isothermal Amplification Buffer&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:223px;">B0537S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">WarmStart RTx Reverse Transcriptase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:223px;">M0380S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antarctic Thermolabile UDG</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:223px;">M0372S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgSO4</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:223px;">B1003S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100mM dATP Solution</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:223px;">N0440S</td>
			<td>Deoxynucleotide Set N0446S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100mM dCTP Solution</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:223px;">N0441S</td>
			<td>Deoxynucleotide Set N0446S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100mM dTTP Solution</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:223px;">N0443S</td>
			<td>Deoxynucleotide Set N0446S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100mM dGTP Solution</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:223px;">N0442S</td>
			<td>Deoxynucleotide Set N0446S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100mM dUTP Solution</td>
			<td style="width:223px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:223px;">R0133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td style="width:223px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:223px;">S7563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nancy-520</td>
			<td style="width:223px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:223px;">01494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Low DNA Mass Ladder</td>
			<td style="width:223px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:223px;">10-068-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Zika Postive Control</td>
			<td style="width:223px;">Robert Koch Institute, Germany</td>
			<td style="width:223px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Agarose</td>
			<td style="width:223px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:223px;">BP1600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">BlueJuice Gel Loading Buffer</td>
			<td style="width:223px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:223px;">10816015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Primers</td>
			<td style="width:223px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:223px;">Custom Oligo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Nuclease-Free Water</td>
			<td style="width:223px;">Ambion</td>
			<td style="width:223px;">AM9938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Urine Preservative</td>
			<td style="width:223px;">Norgen Biotek</td>
			<td style="width:223px;">18126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">ZIKV PCR Standard</td>
			<td>Robert Koch Institute</td>
			<td style="width:223px;">N/A</td>
			<td>Vero E6 cell supernatants</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">DENV2 New Guinea C Control</td>
			<td style="width:223px;">Connecticut Agricultural Experiment Station</td>
			<td style="width:223px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification (rt-lamp) assay for zika virus and housekeeping genes in urine, serum, and mosquito samples

L'infezione con il virus di Zika (ZIKV) può essere asintomatico negli adulti, tuttavia, l'infezione durante la gravidanza può portare a aborto spontaneo e difetti di nascita neurologici severi. L'obiettivo del presente protocollo è quello di rilevare rapidamente ZIKV nei campioni umani e di zanzara. Il gold standard attuale per il rilevamento di ZIKV è quantitativa trascrizione d'inversione PCR (qRT-PCR); amplificazione isotermica mediata da loop trascrizione inversa (RT-LAMP) può consentire per un test più efficiente e a basso costo senza la necessità di costose attrezzature. In questo studio, RT-LAMP è utilizzato per il rilevamento di ZIKV in vari campioni biologici entro 30 min, senza prima isolare il RNA dal campione. Questa tecnica è dimostrata utilizzando ZIKV infettato il paziente urina e del siero e infettati campioni di zanzara. Acido ribonucleico ribosomiale 18s e actina sono utilizzati come controlli in campioni umani e zanzara, rispettivamente.

Reazioni di RT-lampada possono essere analizzate utilizzando tre metodi diversi. In primo luogo, con l'aggiunta di un colorante fluorescente dell'acido nucleico, reazioni positive sarà di colore giallo/verde dove reazioni negative apparirà arancione colore ad occhio nudo. In secondo luogo, l'aggiunta di coloranti fluorescenti dell'acido nucleico per reazione di RT-LAMP genera un segnale fluorescente quando i campioni sono eccitati da luce UV. Reazioni negative non avrà un segnale fluor...

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Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification RT-LAMP Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

Invertire l'amplificazione isotermica mediata da Loop-trascrizione (RT-LAMP) analisi per Virus di Zika e geni Housekeeping in urina, siero ed esempi di zanzara

Questo protocollo fornisce un metodo efficiente e a basso costo per rilevare virus di Zika o controllare obiettivi in campioni di urina e del siero umano o nelle zanzare di amplificazione isotermica mediata da loop trascrizione inversa (RT-LAMP). Questo metodo non richiede isolamento del RNA e può essere fatto entro 30 min.

Infection with Zika virus (ZIKV) can be asymptomatic in adults, however, infection during pregnancy can lead to miscarriage and severe neurological birth ...

Questo metodo può determinare rapidamente se i campioni contengono virus Zika. Questo è utile per le donne incinte, le coppie che cercano di concepire o la sorveglianza delle popolazioni di zanzare locali che sono a rischio di infezione da Zika. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è veloce, facile, non richiede attrezzature costose e può essere fatto senza un passaggio di isolamento dell'RNA.Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la diagnosi dell'infezione da Zika, perché l'infezione durante la gravidanza è legata a aborto spontaneo, parto morto e altri gravi difetti congeniti e neurologici alla nascita. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni su Zika, può anche essere applicato ad altre malattie infettive come dengue, chikungunya o virus del Nilo occidentale usando primer specifici del virus. Per iniziare, ricostituire ogni primer RT-LAMP in acqua di grado molecolare ad una concentrazione finale di 100 micromolari.Vortice brevemente la soluzione primer per garantire che la soluzione sia omogenea. Centrifugare per circa cinque secondi alla massima velocità per raccogliere la soluzione primer. Quindi preparare un mix di primer RT-LAMP 10x come delineato nella tabella due del protocollo tecnologico.Vortice brevemente per garantire omogeneità. E centrifugare brevemente alla massima velocità per evitare qualsiasi perdita. Conservare i primer a meno 20 gradi Celsius, tra un utilizzo e l'altro, evitando cicli di congelamento-scongelamento.Per campioni di urina umana, utilizzare urina fresca, urina congelata o urina nel conservante. Scongelare eventuali campioni congelati sul ghiaccio prima dell'uso. I campioni di siero umano devono essere freschi o congelati, mentre le linee cellulari infette da ZIKV devono contenere mezzi condizionati o lire cellulari.Infine, per le zanzare Aedes aegypti, utilizzare carcasse intere, fresche o congelate. Scongelare eventuali carcasse di zanzara congelate sul ghiaccio. Posizionare una zanzara individuale in 100 microlitri di PBS.L'uso di una punta di pipetta P10 schiaccia la zanzara 10 volte e omogeneizzala per creare un lisato di zanzara grezzo. Centrifugare brevemente il lisato grezzo per pelletare eventuali detriti e utilizzare il supernatante per l'analisi RT-LAMP a valle. Per iniziare, prepara una reazione di master mix RT-LAMP sul ghiaccio per ogni primer impostato per essere utilizzato, come schema per tabella tre nel protocollo della tecnologia.Vortice ogni campione per assicurarsi che sia ben miscelato. Quindi farli girare brevemente verso il basso per evitare perdite di volume. Per ogni reazione, pipettare 23,0 microlitri del master RT-LAMP in un tubo PCR da 200 microlitri.Quindi, aggiungere due microlitri di campione per portare il volume totale a 25,0 microlitri. Utilizzare acqua di grado molecolare per il controllo negativo e assicurarsi di includere un controllo positivo. Opzionalmente, includere una reazione di controllo della specificità di un arbovirus correlato come il virus dengue, come delineato nel protocollo tecnologico.Utilizzando un blocco di calore, un bagno d'acqua o un termociclo, riscaldare i campioni a 61 gradi Celsius per 30 minuti. Successivamente, aumentare il calore a 80 gradi Celsius per 10 minuti per disattivare termicamente la polimerasi. Eseguire l'analisi RT-LAMP in uno spazio chiuso separato.Diluire il colorante acido nucleico fluorescente da uno a dieci nel tampone TAE. Aggiungere due micorliter della soluzione di colorante acido nucleico fluorescente a 12 micorliter della reazione RT-LAMP. Valutare visivamente le reazioni RT-LAMP cercando la presenza di un cambiamento di colore.Facoltativamente, utilizzare una fotocamera per scattare foto delle reazioni RT-LAMP su uno sfondo bianco. Quindi, posizionare i campioni sotto una luce UV di 302 nanometri per confermare la presenza di prodotti RT-LAMP per fluorescenza. Usa una fotocamera per scattare una foto del risultato.Per iniziare a eseguire l'elettroforesi versare il gel di agarosio del 2% in 1 tampone TAE con una macchia di acido nucleico per la visualizzazione. Aggiungere cinque microlitri di una scala del DNA nella prima corsia per confrontare i pesi molecolari. Per ogni reazione RT-LAMP, mescolare 13 microlitri di miscela di reazione RT-LAMP con due microlitri di colorante di carico del DNA.Caricare questa miscela di 15 microliter. Eseguire il gel a 90 volt per 90 minuti o fino a quando le bande non sono separate. Un'immagine con luce UV di 302 nanometri.Al termine, smaltire le reazioni RT-LAMP in sacchetti a doppia sigillatura. In questo studio, vengono utilizzati tre diversi metodi per analizzare le reazioni RT-LAMP. Quando si utilizza l'acido nucleico fluorescente, le reazioni positive diventano di colore giallo-verde, mentre le reazioni negative appaiono arancioni.Questo colorante si traduce anche in un segnale fluorescente quando i campioni sono eccitati dalla luce UV. Infine, le reazioni RT-LAMP possono esaurirsi su un gel di agarosio. Le reazioni positive di RT-LAMP avranno un modello di bande, mentre le reazioni negative non avranno bande di DNA.Questi metodi sono utilizzati per dimostrare la specificità della reazione ZIKV RT-LAMP. Solo il controllo molecolare ZIKV ha una reazione RT-LAMP positiva. Inoltre, mentre zikv viene rilevato sia nelle urine che nel siero di un paziente con infezione ZIKV nota, non è visto nel paziente di controllo asintomatico senza infezione da ZIKV.I campioni vengono quindi testati per l'rRNA umano 18S. Solo i campioni prelevati dai pazienti sono considerati positivi per l'rRNA 18S. I campioni di zanzara possono essere testati in modo simile per ZIKV o il controllo di qualità RT-LAMP AEDAE.Solo il controllo molecolare positivo per ZIKV e la zanzara infetta da ZIKV sono considerati positivi per ZIKV. Tuttavia tutte le zanzare sono positive per AEDAE di RT-LAMP. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di 30 minuti se viene eseguita correttamente.È importante ricordare che le reazioni RT-LAMP sono soggette a false reazioni positive. Le fasi di prevenzione includono l'uso di una glicosilasi del DNA uracile termolabile nelle reazioni, l'uso di un flusso di lavoro laterale, l'esecuzione di analisi in uno spazio separato e la riduzione dei tubi di post amplificazione del tempo sono aperti. Seguendo questa procedura è possibile eseguire altri metodi come QPCR per rispondere a domande aggiuntive, come quante copie il virus, o altri bersagli, sono presenti nel campione.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare RT-LAMP per rilevare il virus Zika e i controlli del bersaglio nelle urine e nel siero umani, nonché nelle zanzare. Non dimenticare che lavorare con il virus Zika e la macchia di acido nucleico può essere estremamente pericoloso e precauzioni come indossare guanti dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura. Data l'associazione dell'infezione da virus Zika con anomalie congenite, le donne che sono incinte, che cercano di concepire, o partner di queste donne, dovrebbero ridurre significativamente la loro esposizione in laboratorio al virus Zika.

Research

JoVE Journal

Genetics

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

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Ricerca

Genetica

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The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell ...

Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer

Adattamento 3' amplificazione veloce di CDNA finisce per mappare le trascrizioni in cancro

Maturation of eukaryotic mRNAs involves 3&#39; end formation, which involves the addition of a poly(A) tail. In order to map the 3&#39; end of a gene, the ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Amplificazione del vicino full-length provirus di HIV-1 per il sequenziamento di nuova generazione

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

Valutazione di una reazione a catena della polimerasi di trascrizione inversa nidificata universale per la rilevazione di Lyssaviruses

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

Un protocollo in vitro per la valutazione dei livelli, delle funzioni e dei geni target associati nelle cellule tumorali

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...