Name: reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification (rt-lamp) assay for zika virus and housekeeping genes in urine, serum, and mosquito samples
Uploaded: 2018-09-14T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification RT-LAMP Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples at JoVE

この作品は、モーリーンとロナルド ・ ハーシュ家族の慈善的貢献とフィールド神経科学研究所、ミシガン州の聖マリアによって支持されました。資金提供者には、研究デザイン、データ収集と分析、意思決定を発行し、または原稿の準備の役割はなかった。我々 はまた、彼らの重要な原稿のレビュー博士ベルナデット Zwaans とエリヤ病棟をありがとうございます。

ここで説明したすべてのメソッドは、ボーモント厚生制度レビュー委員会 (IRB) によって承認されています。関連するガイドラインと規制に従ってすべての実験を行った。
注意: 個人用保護具の使用を含むバイオ セーフティ レベル 2 標準によるとすべての可能性のある感染性物質を処理必要があります。バイオ セーフティ キャビネットにおけるエアロゾルを作り出すか?...

<ol>
	<li>Petersen, L. R., Jamieson, D. J., Powers, A. M., Honein, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus.">Zika Virus.</a> New England Journal of Medicine. 374 (16), 1552-1563 (2016).</li><li>Francois, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robustness+of+a+loop-mediated+isothermal+amplification+reaction+for+diagnostic+applications.">Robustness of a loop-mediated isothermal amplification reaction for diagnostic applications.</a> Federation of European Microbiological Societies Immunology and Medical Microbiology. 62 (1), 41-48 (2011).</li><li>Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP)+of+gene+sequences+and+simple+visual+detection+of+products.">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products.</a> Nature Protocols. 3 (5), 877-882 (2008).</li><li>Gandasegui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rapid-Heat+LAMPellet+Method:+A+Potential+Diagnostic+Method+for+Human+Urogenital+Schistosomiasis.">The Rapid-Heat LAMPellet Method: A Potential Diagnostic Method for Human Urogenital Schistosomiasis.</a> Public Library of Science Neglected Tropical Diseases. 9 (7), 0003963 (2015).</li><li>Barkway, C. 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人間と蚊の両方のサンプル6を使用してこの紙の作品で説明している ZIKV RT ランプの試金。検出限界は約 1 ゲノム等価6、症候性 ZIKV 感染患者の典型的なウイルス負荷は 10 なので十分なする必要があります3  106 Pfu/ml7。さらに、このメソッドは最初の分離する RNA と細胞培養におけるウイルスの増幅なしのサンプル Z...

2015 年にジカ (ZIKV) 注目を集めて著名なグローバル懸念の伝染病として妊娠中の感染は、流産、死産、重篤な神経学的な出生時欠損など小頭症、その他先天性にリンクされていたので先天性欠損症1。まれに、ZIKV は、ギランバレー症候群に関連付けられています。ZIKV は主にネッタイシマカ蚊; によって送信されます。しかし、それ1性的接触を通して広げることができます。迅速かつコスト効果の高い検出法の改良の必要性があったことを考えると ZIKV 感染は、ほとんどの人に無症候性または他アルボ1の感染症の症状と重なっている軽度のインフルエンザのような症状を呈する、ローカル蚊の個体数と同様、両方の人々 を画面に ZIKV。
定量的逆転写 PCR (qRT PCR) は ZIKV 検出; のための信頼性の高いアッセイです。ただし、この手法には、高価な特殊な装置、訓練された人員および興味のサンプルからの RNA の隔離が必要です。逆のトランスクリプション ループ lamp 法 (RT ランプ) は鎖と耐熱性 DNA ポリメラーゼの使用により 1 つの孵化の温度を必要なだけ PCR 技術に基づくワンステップ核酸増幅法変位プロパティ。これをたちの必要性を回避して試験を完了に必要な時間の長さを減少させます。RT ランプの付加的な利点は、高い特異性と感度、多くの PCR 阻害剤2への抵抗と温度、pH のレベルの範囲で堅牢性を含めます。比較的低コスト、試薬は室温で安定しています。これらの特徴を考えると、実験室やフィールドで RT ランプが展開できます。そのため、病原体や感染3,4、5の他の種類の範囲を検出するランプ反応が開発されています。本稿で記述されている RT ランプ プロトコルの目的は、ひと血清および尿中サンプルでも RT ランプ経由 30 分以内単一感染した蚊のように RNA の隔離なし ZIKV を検出するためです。実験室外側迅速かつ設定で動作する高感度、迅速な診断ツールである qRT PCR を交換するこのメソッドを使用できます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:901px;" width="902">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Bst 2.0 WarmStart DNA polymerase</td>
			<td style="width:223px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:223px;">M0537S</td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isothermal Amplification Buffer&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:223px;">B0537S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">WarmStart RTx Reverse Transcriptase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:223px;">M0380S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antarctic Thermolabile UDG</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:223px;">M0372S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgSO4</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:223px;">B1003S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100mM dATP Solution</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:223px;">N0440S</td>
			<td>Deoxynucleotide Set N0446S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100mM dCTP Solution</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:223px;">N0441S</td>
			<td>Deoxynucleotide Set N0446S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100mM dTTP Solution</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:223px;">N0443S</td>
			<td>Deoxynucleotide Set N0446S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100mM dGTP Solution</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:223px;">N0442S</td>
			<td>Deoxynucleotide Set N0446S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100mM dUTP Solution</td>
			<td style="width:223px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:223px;">R0133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td style="width:223px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:223px;">S7563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nancy-520</td>
			<td style="width:223px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:223px;">01494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Low DNA Mass Ladder</td>
			<td style="width:223px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:223px;">10-068-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Zika Postive Control</td>
			<td style="width:223px;">Robert Koch Institute, Germany</td>
			<td style="width:223px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Agarose</td>
			<td style="width:223px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:223px;">BP1600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">BlueJuice Gel Loading Buffer</td>
			<td style="width:223px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:223px;">10816015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Primers</td>
			<td style="width:223px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:223px;">Custom Oligo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Nuclease-Free Water</td>
			<td style="width:223px;">Ambion</td>
			<td style="width:223px;">AM9938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Urine Preservative</td>
			<td style="width:223px;">Norgen Biotek</td>
			<td style="width:223px;">18126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">ZIKV PCR Standard</td>
			<td>Robert Koch Institute</td>
			<td style="width:223px;">N/A</td>
			<td>Vero E6 cell supernatants</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">DENV2 New Guinea C Control</td>
			<td style="width:223px;">Connecticut Agricultural Experiment Station</td>
			<td style="width:223px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification (rt-lamp) assay for zika virus and housekeeping genes in urine, serum, and mosquito samples

ジカ ウイルス (ZIKV) の感染は成人の無症候性することができます、ただし、妊娠中の感染は流産と重度の神経学的な先天性欠損症に 。このプロトコルの目的は、人間と蚊のサンプルで ZIKV を迅速に検出することです。ZIKV 検出のための現在のゴールド スタンダードは定量的逆転写 PCR (qRT PCR);逆のトランスクリプション ループ lamp 法 (RT ランプ) 高価な機器を必要とせずより効率的かつ低コストにテストのため可能性があります。本研究では RT ランプは最初のサンプルから RNA を隔離することがなく 30 分以内のさまざまな生体試料中の ZIKV 検出に使用されます。この手法は、患者の尿、血清、感染し、感染蚊のサンプル ZIKV を使用して示されています。18 s リボソーム リボ核酸とアクチンは、それぞれ人間と蚊のサンプル内のコントロールとして使用されます。

RT ランプ反応は、3 つの異なる方法を使用して分析できます。まず、蛍光核酸色素の添加、肯定的な反応になりますイエロー/グリーン色で否定的な反応が肉眼で見える色はオレンジが表示されます。第二に、RT ランプ反応を蛍光核酸色素添加結果蛍光信号サンプルが紫外線によって興奮しているとき。否定的な反応は、陰性対照に少量存在する背景の蛍光性の検出可?...

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Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification RT-LAMP Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

逆にジカと尿、血清、蚊のサンプルでハウスキーピング遺伝子の転写-ループ - Lamp 法 (RT ランプ) アッセイ

このプロトコルは、効率的かつ低コスト ジカのウイルスを検出または逆のトランスクリプション ループ lamp 法 (RT ランプ) で人間の尿や血清のサンプルや蚊のターゲットを制御するメソッドを提供します。このメソッドは、RNA の隔離を必要としないし、30 分以内に行うことができます。

Infection with Zika virus (ZIKV) can be asymptomatic in adults, however, infection during pregnancy can lead to miscarriage and severe neurological birth ...

この方法は、サンプルにジカウイルスが含まれているかどうかを迅速に判断できます。これは、妊娠中の女性、妊娠しようとしているカップル、またはジカ感染の危険にさらされている地元の蚊集団の監視に役立ちます。この技術の主な利点は、高速で簡単で、高価な機器を必要とせず、RNA分離ステップなしで行うことができることです。妊娠中の感染は流産、死産、その他の重度の先天性神経学的出生時欠損に関連しているため、この技術の意味合いはジカ感染の診断にまで及ぶ。この方法はジカに関する洞察を提供することができますが、ウイルス特異的プライマーを使用してデング熱、チクングニア、またはウェストナイルウイルスなどの他の感染症にも適用できます。まず、各RT-LAMPプライマーを分子グレード水に再構成し、最終濃度の100マイクロモルにします。溶液が均一であることを保証するためにプライマー溶液を簡単に渦液。遠心分離機は、プライマー溶液を収集するために最高速度で約5秒間。その後、技術のプロトコルの表2に概説されているように、10倍のRT-LAMPプライマーミックスを準備します。均質性を確保するために簡単に渦を起分。そして、任意の損失を避けるために、最高速度で一時的に遠心分離機。使用の間にマイナス20度でプライマーを保管し、フリーズ解凍サイクルを避けます。ヒトの尿サンプルの場合、新鮮な尿、凍結した尿または尿を防腐剤に使用してください。使用前に氷上の凍結サンプルを解凍してください。ヒト血清サンプルは新鮮または凍結する必要があり、ZIKV感染細胞株には条件付き培地または細胞ライセートのいずれかが含まれている必要があります。最後に、Aedes aegypti蚊のために、新鮮または凍結のいずれか、全体の死体を使用してください。氷の上の凍った蚊の死骸を解凍します。PBSの100マイクロリットルに個々の蚊を置きます。P10ピペットチップを使用して蚊を10回粉砕し、均質化して粗い蚊のライゼートを作ります。粗なライゼートを簡単に遠心分離して、残骸をペレット化し、上清を下流のRT-LAMP分析に使用します。まず、技術のプロトコルの表3の概要として、使用されるプライマーセットごとに氷上でRT-LAMPマスターミックス反応を準備します。各サンプルが十分に混合されていることを確認するために渦を巻く。その後、ボリュームの損失を防ぐためにそれらを簡単に回転させます。各反応に対して、200マイクロリットルのPCRチューブに200マイクロリットルのPCRチューブに混合するRT-LAMPマスターのピペット23.0マイクロリットル。次に、サンプルを2マイクロリットル加え、総容積を25.0マイクロリットルにします。負のコントロールには分子グレードの水を使用し、正のコントロールを含むようにしてください。必要に応じて、技術のプロトコルで概説されているように、デング熱ウイルスなどの関連するアルボウイルスの特異性制御反応を含める。ヒートブロック、水浴、またはサーモサイクラーを使用して、サンプルを摂氏61度で30分間加熱します。この後、ポリメラーゼを加熱非活性化するために10分間80°Cに加熱します。RT-LAMP 解析を別の密閉空間で実行します。TAEバッファーで蛍光核酸染料を1~10個希釈します。RT-LAMP反応の12ミコルリットルに蛍光核酸色素溶液の2つのミコーリットルを加えます。色の変化の存在を探すことによって目視でRT-LAMP反応を評価する。オプションでカメラを使用して、白い背景にRT-LAMP反応の写真を撮ります。次に、302ナノメートルのUV光下にサンプルを置き、蛍光によるRT-LAMP製品の存在を確認します。カメラを使用して結果を撮影します。電気泳動の実施を開始するには、可視化のための核酸染色を用いて1x TAEバッファーに2%アガロースゲルを注ぎます。最初のレーンにDNAラダーを5マイクロリットル加えて分子量を比較します。RT-LAMP反応ごとに、RT-LAMP反応混合物の13マイクロリットルを2マイクロリットルのDNAローディング色素と混合します。この15マイクロリットルの混合物をロードします。90ボルトで90分、またはバンドが分離されるまでゲルを実行します。302ナノメートルのUV光を持つ画像。終了したら、RT-LAMP反応を二重密閉袋に入れなさい。本研究では、RT-LAMP反応を分析するために3つの異なる方法が利用される。蛍光核酸色素を使用すると、正の反応は黄色緑色になり、ネガティブ反応はオレンジ色に見えます。この色素は、サンプルがUV光によって励起されると蛍光シグナルを生じます。最後に、RT-LAMP反応はアガロースゲルで使い果たすことができます。正のRT-LAMP反応はバンディングパターンを持ち、否定的な反応はDNAバンドを持たない。これらの方法は、ZIKV RT-LAMP反応の特異性を実証するために使用される。ZIKV分子制御のみが正のRT-LAMP反応を有する。さらに、公知のZIKV感染を有する患者の尿および血清の両方でZIKVが検出される一方で、ZIKV感染のない無症候性対照患者では見られない。その後、サンプルをヒト18S rRNAについて試験する。患者から採取したサンプルのみが18S rRNAに対して陽性であることが分かる。蚊のサンプルはZIKVまたはRT-LAMP品質管理AEDAEのために同様にテストすることができる。ZIKVとZIKVに感染した蚊の陽性分子制御のみがZIKVに陽性であると見られる。しかし、すべての蚊はRT-LAMPによってAEDAEにとって陽性です。一度習得すると、この技術は、それが正常に実行されている場合、30分以内に行うことができます。RT-LAMP反応は偽陽性反応を起こしやすいことを覚えておくことが重要です。予防手順には、熱labileウラシルDNAグリコシラーゼを反応に使用すること、横型ワークフローを使用する、別の空間で分析を行う、および増幅後のチューブが開いている時間を短縮するが含まれる。この手順に従って、サンプルに存在するウイルスや他のターゲットのコピーの数など、追加の質問に答えるために QPCR のような他の方法を実行できます。このビデオを見た後、あなたはジカウイルスを検出し、人間の尿や血清だけでなく、蚊のコントロールを標的にするRT-LAMPを使用する方法をよく理解する必要があります。ジカウイルスや核酸汚れで作業することは非常に危険であり、手袋を着用するなどの予防措置は、常にこの手順を実行している間に取られるべきであることを忘れないでください。ジカウイルス感染と先天性異常との関連を考えると、妊娠している女性、妊娠しようとしている女性、またはこれらの女性のパートナーは、ジカウイルスへの実験室への暴露を大幅に最小限に抑えるべきである。

Research

JoVE Journal

Genetics

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

The Use of Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

The Use of Induced Somatic Sector Analysis ISSA for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

木部形成に関与する遺伝子およびプロモーターを研究するための誘導性体細胞セクター分析（ISSA）の使用とセカンダリステム開発

Secondary stem growth in trees and associated wood formation are significant both from biological and commercial perspectives. However, relatively little ...

Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

植物の細胞や細胞小器官の壁を越え遺伝子やタンパク質を輸送するために、ペプチド由来方法

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

新規トランスポゾンを介したアプローチを使用してエシェリヒア属大腸菌DNA 要素の最適な染色体の場所の決定

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

クロマチン免疫沈降 (チップ) プロトコル低豊富な胚サンプル

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

ショウジョウバエの胚とパスチラミドシグナル信号増幅を利用した生体表面の高解像度蛍光In Situハイブリダイゼーション

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells sf9 for Protein Functional Assay

昆虫細胞 (sf9) 蛋白質機能の試金のための外国遺伝子の一過性発現

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell ...

Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer

適応 3' CDNA の急速な拡大は、がんの成績証明書をマップする終了します。

Maturation of eukaryotic mRNAs involves 3&#39; end formation, which involves the addition of a poly(A) tail. In order to map the 3&#39; end of a gene, the ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

次世代シーケンシングのフルレングスの HIV-1 Proviruses 近くの増幅

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

Lyssaviruses の検出のための普遍的な入れ子逆転写ポリメラーゼ連鎖反応の評価

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

腫瘍細胞におけるマイクロRNAレベル、機能、および関連する標的遺伝子を評価するためのインビトロプロトコル

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...