Name: reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification (rt-lamp) assay for zika virus and housekeeping genes in urine, serum, and mosquito samples
Uploaded: 2018-09-14T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification RT-LAMP Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples at JoVE

Dette arbeidet ble støttet av Maureen og Ronald Hirsch familie filantropiske bidrag og feltet Neurosciences Institute, St. Marys i Michigan. Fond ikke hadde noen rolle i studien design, innsamling og analyse, beslutningen om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet. Vi takker også Dr. Bernadette Zwaans og Elijah Ward for deres kritisk gjennomgang av manuskriptet.

Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av institusjonelle Review Board (IRB) av Beaumont helse. Alle eksperimentene ble utført i samsvar med relevante retningslinjer og regler.
Advarsel: Alle potensielt smittefarlig materiale skal håndteres i henhold til grad 2 standarder inkludert bruk av personlig verneutstyr. Alle prosedyrer som kan produsere aerosoler skal utføres i en biosafety kabinett. I tillegg skal arbeidet med live mygg utføres i passende leddyr Containment nivå 1-3 anle...

<ol>
	<li>Petersen, L. R., Jamieson, D. J., Powers, A. M., Honein, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus.">Zika Virus.</a> New England Journal of Medicine. 374 (16), 1552-1563 (2016).</li><li>Francois, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robustness+of+a+loop-mediated+isothermal+amplification+reaction+for+diagnostic+applications.">Robustness of a loop-mediated isothermal amplification reaction for diagnostic applications.</a> Federation of European Microbiological Societies Immunology and Medical Microbiology. 62 (1), 41-48 (2011).</li><li>Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP)+of+gene+sequences+and+simple+visual+detection+of+products.">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products.</a> Nature Protocols. 3 (5), 877-882 (2008).</li><li>Gandasegui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rapid-Heat+LAMPellet+Method:+A+Potential+Diagnostic+Method+for+Human+Urogenital+Schistosomiasis.">The Rapid-Heat LAMPellet Method: A Potential Diagnostic Method for Human Urogenital Schistosomiasis.</a> Public Library of Science Neglected Tropical Diseases. 9 (7), 0003963 (2015).</li><li>Barkway, C. P., Pocock, R. L., Vrba, V., Blake, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP)+assays+for+the+species-specific+detection+of+Eimeria+that+infect+chickens.">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays for the species-specific detection of Eimeria that infect chickens.</a> The Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).</li><li>Lamb, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Detection+of+Zika+Virus+in+Urine+Samples+and+Infected+Mosquitos+by+Reverse+Transcription-Loop-Mediated+Isothermal+Amplification.">Rapid Detection of Zika Virus in Urine Samples and Infected Mosquitos by Reverse Transcription-Loop-Mediated Isothermal Amplification.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3803 (2018).</li><li>Faye, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+RT-PCR+for+detection+of+Zika+virus.">One-step RT-PCR for detection of Zika virus.</a> Journal of Clinical Virology. 43 (1), 96-101 (2008).</li><li>Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+inhibitors+-+occurrence,+properties+and+removal.">PCR inhibitors - occurrence, properties and removal.</a> Journal of Applied Microbiology. 113 (5), 1014-1026 (2012).</li><li>Poole, C. B., Tanner, N. A., Zhang, Y., Evans, T. C., Carlow, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+brugian+filariasis+by+loop-mediated+isothermal+amplification.">Diagnosis of brugian filariasis by loop-mediated isothermal amplification.</a> Public Library of Science Neglected Tropical Diseases. 6 (12), 1948 (2012).</li><li>Tanner, N. A., Zhang, Y., Evans, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+multiple+target+detection+in+real-time+loop-mediated+isothermal+amplification.">Simultaneous multiple target detection in real-time loop-mediated isothermal amplification.</a> Biotechniques. 53 (2), 81-89 (2012).</li><li>Chan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+Affordable+and+Portable+Medium-Throughput+Molecular+Device+for+Zika+Virus.">Rapid, Affordable and Portable Medium-Throughput Molecular Device for Zika Virus.</a> Scientific Reports. 6, 38223 (2016).</li><li>Lee, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+Highly+Sensitive+Molecular+Diagnosis+of+Zika+Virus+by+Lateral+Flow+Assays.">Simple and Highly Sensitive Molecular Diagnosis of Zika Virus by Lateral Flow Assays.</a> Analytical Chemistry. 88 (24), 12272-12278 (2016).</li><li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-Cost+Detection+of+Zika+Virus+Using+Programmable+Biomolecular+Components.">Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components.</a> Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).</li><li>Song, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instrument-Free+Point-of-Care+Molecular+Detection+of+Zika+Virus.">Instrument-Free Point-of-Care Molecular Detection of Zika Virus.</a> Analytical Chemistry. 88 (14), 7289-7294 (2016).</li><li>Yaren, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Point+of+sampling+detection+of+Zika+virus+within+a+multiplexed+kit+capable+of+detecting+dengue+and+chikungunya.">Point of sampling detection of Zika virus within a multiplexed kit capable of detecting dengue and chikungunya.</a> BioMed Central Infectious Diseases. 17 (1), 293 (2017).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+sensitive+detection+of+Zika+virus+by+reverse+transcription+loop-mediated+isothermal+amplification.">Rapid and sensitive detection of Zika virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification.</a> Journal of Virological Methods. 238, 86-93 (2016).</li><li>Priye, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+smartphone-based+diagnostic+platform+for+rapid+detection+of+Zika,+chikungunya,+and+dengue+viruses.">A smartphone-based diagnostic platform for rapid detection of Zika, chikungunya, and dengue viruses.</a> Scientific Reports. 7, 44778 (2017).</li></ol>

ZIKV RT-lampe analysen beskrevet i dette papir fungerer med både menneskelig og mygg prøver6. Grensen for deteksjon var ca 1 genomet tilsvarende6, som bør være tilstrekkelig, siden den typiske viral belastningen for en symptomatisk ZIKV infiserte pasient er 103  106 PFU/mL7. I tillegg finner denne metoden ZIKV i prøver uten første skille RNA og uten virus forsterkning i cellekultur. Dette reduserer betydelig ti...

I 2015 fikk Zika virus (ZIKV) fremtredende global oppmerksomhet som en smittsom sykdom bekymring fordi smitte under svangerskapet var knyttet til spontanabort, dødfødsel, alvorlig nevrologisk fødselsskader inkludert microcephaly, samt andre medfødt fødselsskader1. I sjeldne tilfeller har ZIKV vært forbundet med Guillain-Barrés syndrom. ZIKV overføres primært av Aedes mygg; men kan det også spres gjennom seksuell kontakt1. Gitt at infeksjonen med ZIKV er asymptomatisk i fleste eller presenterer med mild influensalignende symptomer som overlapper med symptomer på infeksjon av andre arborviruses1, var det behov for bedre metoder for rask og kostnadseffektiv påvisning av ZIKV til skjermen både personer samt lokale mygg populasjoner.
Kvantitativ omvendt transkripsjon PCR (qRT-PCR) er en pålitelig analysen til ZIKV oppdagelse. men krever denne teknikken dyre spesialisert utstyr og opplært personale RNA isolasjon fra utvalget av interesse. Omvendt transkripsjon loop-mediert isotermiske forsterkning (RT-lampe) er en ettrinns nukleinsyre forsterkning metode basert på PCR teknologi som bare krever en inkubasjon temperatur skyldes bruk av en varmekjære DNA polymerase med tråd Forskyvning egenskaper. Dette omgår behovet for en thermocycler og reduserer tiden som kreves for å fullføre analysen. Ekstra fordeler av RT-lampe inkluderer dens høy spesifisitet og følsomhet, robusthet på et spekter av pH nivåer og temperaturer og motstand mot mange PCR hemmere2. Den har en relativt lav kostnad og reagenser er stabile ved romtemperatur. Gitt disse egenskapene, kan RT-lampe distribueres i et laboratorium eller i feltet. Som sådan, er lampe reaksjoner utviklet for å oppdage en rekke patogener og andre typer infeksjon3,4,5. Målet med RT-lampe protokollen beskrevet i denne hvitboken er å oppdage ZIKV uten RNA isolasjon i serum og urin prøver fra mennesker så vel som en enkelt infiserte mygg innen 30 min gjennom RT-lampe. Denne metoden kan brukes til å erstatte qRT PCR som det er en følsom, rask diagnostiske verktøy som fungerer raskt og i innstillinger utenfor laboratoriet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:901px;" width="902">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Bst 2.0 WarmStart DNA polymerase</td>
			<td style="width:223px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:223px;">M0537S</td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isothermal Amplification Buffer&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:223px;">B0537S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">WarmStart RTx Reverse Transcriptase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:223px;">M0380S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antarctic Thermolabile UDG</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:223px;">M0372S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgSO4</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:223px;">B1003S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100mM dATP Solution</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:223px;">N0440S</td>
			<td>Deoxynucleotide Set N0446S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100mM dCTP Solution</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:223px;">N0441S</td>
			<td>Deoxynucleotide Set N0446S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100mM dTTP Solution</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:223px;">N0443S</td>
			<td>Deoxynucleotide Set N0446S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100mM dGTP Solution</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:223px;">N0442S</td>
			<td>Deoxynucleotide Set N0446S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100mM dUTP Solution</td>
			<td style="width:223px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:223px;">R0133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td style="width:223px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:223px;">S7563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nancy-520</td>
			<td style="width:223px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:223px;">01494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Low DNA Mass Ladder</td>
			<td style="width:223px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:223px;">10-068-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Zika Postive Control</td>
			<td style="width:223px;">Robert Koch Institute, Germany</td>
			<td style="width:223px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Agarose</td>
			<td style="width:223px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:223px;">BP1600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">BlueJuice Gel Loading Buffer</td>
			<td style="width:223px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:223px;">10816015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Primers</td>
			<td style="width:223px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:223px;">Custom Oligo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Nuclease-Free Water</td>
			<td style="width:223px;">Ambion</td>
			<td style="width:223px;">AM9938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Urine Preservative</td>
			<td style="width:223px;">Norgen Biotek</td>
			<td style="width:223px;">18126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">ZIKV PCR Standard</td>
			<td>Robert Koch Institute</td>
			<td style="width:223px;">N/A</td>
			<td>Vero E6 cell supernatants</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">DENV2 New Guinea C Control</td>
			<td style="width:223px;">Connecticut Agricultural Experiment Station</td>
			<td style="width:223px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification (rt-lamp) assay for zika virus and housekeeping genes in urine, serum, and mosquito samples

Zika viruset (ZIKV) kan være asymptomatisk i voksne, men smitte under svangerskapet kan føre til spontanabort og alvorlig nevrologisk fødselsskader. Målet med denne protokollen er å raskt oppdage ZIKV i både menneskelige og mygg. Gjeldende gullstandarden for ZIKV påvisning er kvantitative omvendt transkripsjon PCR (qRT-PCR); omvendt transkripsjon loop-mediert isotermiske forsterkning (RT-lampe) tillate en mer effektiv og rimelig testing uten behov for dyrt utstyr. I denne studien er RT-lampe brukt til ZIKV gjenkjenning i ulike biologiske prøver innen 30 min, uten første isolere RNA fra utvalget. Denne teknikken er demonstrert bruker ZIKV infiserte pasient urin og serum og infisert mygg prøver. 18s ribosomal ribonukleinsyre og utgangen blir brukt som kontroller i menneskelige og mygg prøver, henholdsvis.

RT-lampe reaksjoner kan analyseres bruke tre forskjellige metoder. Først med tillegg av en fluorescerende nukleinsyre fargestoff, vil positive reaksjoner være grønn farge hvor negative reaksjoner vises oransje i farge for det blotte øye. Andre tillegg av fluorescerende nukleinsyre fargestoff til RT-lampe reaksjon resulterer i et fluorescerende signal når prøvene er begeistret av UV-lyset. Negative reaksjoner vil ikke ha en detectable fluorescerende signal over noen bakgrunn fluoresc...

Watch this Scientific Journal Video about Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification RT-LAMP Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples at JoVE

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification RT-LAMP Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

Omvendt transkripsjon-Loop-mediert isotermiske forsterkning (RT-lampe) analysen for Zika Virus og Housekeeping gener i urin, Serum og mygg prøver

Denne protokollen gir en effektiv og rimelig metode for å oppdage Zika virus eller kontrollere mål i prøver fra mennesker urin og serum eller mygg av omvendt transkripsjon loop-mediert isotermiske forsterkning (RT-lampe). Denne metoden krever ikke RNA isolasjon og kan gjøres innen 30 min.

Infection with Zika virus (ZIKV) can be asymptomatic in adults, however, infection during pregnancy can lead to miscarriage and severe neurological birth ...

Denne metoden kan raskt avgjøre om prøver inneholder Zika-virus. Dette er nyttig for gravide kvinner, par som prøver å bli gravid, eller overvåking av lokale myggpopulasjoner som er i fare sonen for Zika-infeksjon. Den største fordelen med denne teknikken er at den er rask, enkel, krever ikke dyrt utstyr, og kan gjøres uten et RNA-isolasjonstrinn.Implikasjonene av denne teknikken strekker seg mot diagnose av Zika-infeksjon, fordi infeksjon under graviditet er knyttet til abort, dødfødsel og andre alvorlige medfødte, nevrologiske fødselsskader. Selv om denne metoden kan gi innsikt i Zika, kan den også brukes på andre smittsomme sykdommer som dengue, chikungunya eller West Nile-virus ved hjelp av virusspesifikke primere. Til å begynne med rekonstituer hver RT-LAMP primer i molekylært vann til en endelig konsentrasjon på 100 mikromos.Virvle kort primerløsningen for å sikre at løsningen er homogen. Sentrifuge i omtrent fem sekunder ved maksimal hastighet for å samle primerløsningen. Deretter klargjør du en 10x RT-LAMP primer blanding som beskrevet i tabell to av teknologiens protokoll.Vortex kort for å sikre homogenitet. Og sentrifuge kort ved maksimal hastighet for å unngå tap. Oppbevar primerne ved minus 20 grader Celsius, mellom bruksområder, unngår frysing-tine sykluser.For menneskelige urinprøver, bruk enten frisk urin, frossen urin eller urin i konserveringsmiddel. Tin eventuelle frosne prøver på is før bruk. Humane serumprøver bør enten være ferske eller frosne, mens ZIKV-infiserte cellelinjer skal inneholde enten bes tilstandsmedier eller cellelylater.Til slutt, for Aedes aegypti mygg, bruk hele, enten friske eller frosne. Tin noen frosne myggskrotter på is. Plasser en individuell mygg i 100 mikroliter pbs.Bruk en P10 pipettespiss knuse myggen 10 ganger, og homogenisere den for å skape en rå mygglylat. Sentrifuger rålysatet kort for å pellet eventuelle rusk og bruke supernatanten til nedstrøms RT-LAMP-analyse. Til å begynne med kan du forberede en RT-LAMP master mix reaksjon på is for hvert primer sett som skal brukes, som omrisset av tabell tre i teknologiens protokoll.Vortex hver prøve for å sikre at den er godt blandet. Deretter spinner du dem kort ned for å forhindre volumtap. For hver reaksjon blandes pipette 23,0 mikroliter av RT-LAMP-hovedblandingen i et 200 mikroliter PCR-rør.Deretter legger du til to mikroliter med prøve for å bringe det totale volumet til 25,0 mikroliter. Bruk molekylært vann for negativ kontroll, og sørg for å inkludere en positiv kontroll. Eventuelt inkludere en spesifisitetskontrollreaksjon av et relatert arbovirus som denguevirus, som beskrevet i teknologiens protokoll.Ved hjelp av en varmeblokk, vannbad eller en termocycler, varme prøvene ved 61 grader Celsius i 30 minutter. Etter dette øker du varmen til 80 grader Celsius i 10 minutter for å varme deaktivere polymerasen. Utfør RT-LAMP-analysen i et eget lukket rom.Fortynn det fluorescerende nukleinsyrefargestoffet en til ti i TAE-buffer. Tilsett to mikorliter av den fluorescerende nukleinsyrefargestoffoppløsningen til 12 mikorliter av RT-LAMP-reaksjonen. Vurder RT-LAMP-reaksjonene visuelt ved å se etter tilstedeværelsen av en fargeendring.Du kan eventuelt bruke et kamera til å ta bilder av RT-LAMP-reaksjoner på hvit bakgrunn. Deretter plasserer du prøvene under et 302 nanometer UV-lys for å bekrefte tilstedeværelsen av RT-LAMP-produkter ved fluorescens. Bruk et kamera til å ta et bilde av resultatet.For å begynne å utføre elektroforese hell 2% agarose gel i 1x TAE buffer med en nukleinsyre flekk for visualisering. Legg til fem mikroliter av en DNA-stige i første kjørefelt for å sammenligne molekylvektene. For hver RT-LAMP-reaksjon, bland 13 mikroliter RT-LAMP reaksjonsblanding med to mikroliter dna-lastfargestoff.Legg i denne 15 mikroliterblandingen. Kjør gelen på 90 volt i 90 minutter eller til båndene er separert. Et bilde med 302 nanometer UV-lys.Når du er ferdig, kast RT-LAMP reaksjoner i doble forseglede poser. I denne studien benyttes tre forskjellige metoder for å analysere RT-LAMP-reaksjoner. Ved bruk av fluorescerende nukleinsyre fargestoff positive reaksjoner blir gul-grønn i fargen, mens negative reaksjoner vises oransje.Dette fargestoffet resulterer også i et fluorescerende signal når prøvene er begeistret av UV-lys. Til slutt kan RT-LAMP reaksjoner bli kjørt ut på en agarose gel. Positive RT-LAMP reaksjoner vil ha et banding mønster, mens negative reaksjoner vil ha ingen DNA-bånd.Disse metodene brukes til å demonstrere spesifisiteten til ZIKV RT-LAMP-reaksjonen. Bare ZIKV molekylær kontroll har en positiv RT-LAMP reaksjon. Videre, mens ZIKV oppdages i både urin og serum hos en pasient med kjent ZIKV-infeksjon, ses det ikke hos asymptomatisk kontrollpasient uten ZIKV-infeksjon.Prøvene testes deretter for human 18S rRNA. Bare prøvene tatt fra pasienter anses å være positive for 18S rRNA. Myggprøver kan testes på samme måte for ZIKV eller RT-LAMP kvalitetskontroll AEDAE.Bare den positive molekylære kontrollen for ZIKV og myggen smittet med ZIKV anses å være positiv for ZIKV. Men alle myggene er positive for AEDAE av RT-LAMP. Når mestret, kan denne teknikken gjøres på under 30 minutter hvis den utføres riktig.Det er viktig å huske at RT-LAMP reaksjoner er utsatt for falske positive reaksjoner. Forebyggende trinn inkluderer å bruke en termolabile uracil DNA glycosylase i reaksjoner, ved hjelp av en lateral arbeidsflyt, utføre analyse i et eget rom, og redusere tid etter forsterkning rør er åpne. Etter denne prosedyren kan andre metoder som QPCR utføres for å svare på flere spørsmål, for eksempel hvor mange kopier viruset, eller andre mål, finnes i prøven.Etter å ha sett denne videoen, bør du ha en god forståelse av hvordan du bruker RT-LAMP til å oppdage Zika-virus og målkontroller i menneskelig urin og serum, samt mygg. Ikke glem at arbeid med Zika-virus og nukleinsyreflekk kan være ekstremt farlig, og forholdsregler som bruk av hansker bør alltid tas mens du utfører denne prosedyren. Gitt foreningen av Zika-virusinfeksjon med medfødte abnormiteter, bør kvinner som er gravide, prøver å bli gravid eller partnere av disse kvinnene, betydelig minimere laboratorieeksponeringen for Zika-virus.

Research

JoVE Journal

Genetics

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

The Use of Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

The Use of Induced Somatic Sector Analysis ISSA for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

Bruk av indusert Somatisk Sector Analysis (ISSA) for å studere gener og arrangører involvert i Wood Dannelse og Sekundær Stem Development

Secondary stem growth in trees and associated wood formation are significant both from biological and commercial perspectives. However, relatively little ...

Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

Peptide-avledet Metode for å transportere gener og proteiner Across Cellular og Organellar Barrierer i Plants

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Bestemmelse av den optimale Chromosomal plassering(er) gir et DNA i Escherichia coli bruker en ny Transposon-mediert tilnærming

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) protokollen for lav-overflod embryonale prøver

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Høy oppløsning fluorescerende In Situ hybridisering i Drosophila embryoer og vev med Tyramide Signal forsterkning

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells sf9 for Protein Functional Assay

Forbigående uttrykk av utenlandske gener i insekt celler (sf9) for Protein funksjonelle analysen

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell ...

Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer

Tilpasse 3 slutter raske forsterkning av CDNA å tilordne utskrifter i kreft

Maturation of eukaryotic mRNAs involves 3&#39; end formation, which involves the addition of a poly(A) tail. In order to map the 3&#39; end of a gene, the ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Forsterkning av nær full lengde HIV-1-Proviruses for neste generasjons sekvensering

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

Evaluering av en Universal nestet omvendt transkripsjon polymerase Kjedere reaksjon for påvisning av Lyssaviruses

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

En in vitro-protokoll for evaluering av MicroRNA nivåer, funksjoner og assosierte mål gener i tumor celler

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...