Name: reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification (rt-lamp) assay for zika virus and housekeeping genes in urine, serum, and mosquito samples
Uploaded: 2018-09-14T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification RT-LAMP Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples at JoVE

Este trabalho foi financiado pelo Instituto de Neurociências de campo, St. Mary de Michigan e Maureen e Ronald Hirsch família contribuição filantrópica. Os financiadores não tinham qualquer papel no projeto de estudo, coleta de dados e análise, a decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Agradecemos também Dr. Bernadette Zwaans e Elijah Ward para sua revisão crítica do manuscrito.

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados por institucional Review Board (IRB) de saúde de Beaumont. Todos os experimentos foram realizados em conformidade com os regulamentos e orientações pertinentes.
Atenção: Todos os materiais potencialmente infecciosos devem ser manuseados de acordo com as normas de biossegurança nível 2, incluindo o uso de equipamentos de proteção individual. Quaisquer procedimentos que podem produzir aerossol devem ser executados em uma armário de bioss...

<ol>
	<li>Petersen, L. R., Jamieson, D. J., Powers, A. M., Honein, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus.">Zika Virus.</a> New England Journal of Medicine. 374 (16), 1552-1563 (2016).</li><li>Francois, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robustness+of+a+loop-mediated+isothermal+amplification+reaction+for+diagnostic+applications.">Robustness of a loop-mediated isothermal amplification reaction for diagnostic applications.</a> Federation of European Microbiological Societies Immunology and Medical Microbiology. 62 (1), 41-48 (2011).</li><li>Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP)+of+gene+sequences+and+simple+visual+detection+of+products.">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products.</a> Nature Protocols. 3 (5), 877-882 (2008).</li><li>Gandasegui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rapid-Heat+LAMPellet+Method:+A+Potential+Diagnostic+Method+for+Human+Urogenital+Schistosomiasis.">The Rapid-Heat LAMPellet Method: A Potential Diagnostic Method for Human Urogenital Schistosomiasis.</a> Public Library of Science Neglected Tropical Diseases. 9 (7), 0003963 (2015).</li><li>Barkway, C. P., Pocock, R. L., Vrba, V., Blake, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP)+assays+for+the+species-specific+detection+of+Eimeria+that+infect+chickens.">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays for the species-specific detection of Eimeria that infect chickens.</a> The Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).</li><li>Lamb, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Detection+of+Zika+Virus+in+Urine+Samples+and+Infected+Mosquitos+by+Reverse+Transcription-Loop-Mediated+Isothermal+Amplification.">Rapid Detection of Zika Virus in Urine Samples and Infected Mosquitos by Reverse Transcription-Loop-Mediated Isothermal Amplification.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3803 (2018).</li><li>Faye, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+RT-PCR+for+detection+of+Zika+virus.">One-step RT-PCR for detection of Zika virus.</a> Journal of Clinical Virology. 43 (1), 96-101 (2008).</li><li>Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+inhibitors+-+occurrence,+properties+and+removal.">PCR inhibitors - occurrence, properties and removal.</a> Journal of Applied Microbiology. 113 (5), 1014-1026 (2012).</li><li>Poole, C. B., Tanner, N. A., Zhang, Y., Evans, T. C., Carlow, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+brugian+filariasis+by+loop-mediated+isothermal+amplification.">Diagnosis of brugian filariasis by loop-mediated isothermal amplification.</a> Public Library of Science Neglected Tropical Diseases. 6 (12), 1948 (2012).</li><li>Tanner, N. A., Zhang, Y., Evans, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+multiple+target+detection+in+real-time+loop-mediated+isothermal+amplification.">Simultaneous multiple target detection in real-time loop-mediated isothermal amplification.</a> Biotechniques. 53 (2), 81-89 (2012).</li><li>Chan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+Affordable+and+Portable+Medium-Throughput+Molecular+Device+for+Zika+Virus.">Rapid, Affordable and Portable Medium-Throughput Molecular Device for Zika Virus.</a> Scientific Reports. 6, 38223 (2016).</li><li>Lee, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+Highly+Sensitive+Molecular+Diagnosis+of+Zika+Virus+by+Lateral+Flow+Assays.">Simple and Highly Sensitive Molecular Diagnosis of Zika Virus by Lateral Flow Assays.</a> Analytical Chemistry. 88 (24), 12272-12278 (2016).</li><li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-Cost+Detection+of+Zika+Virus+Using+Programmable+Biomolecular+Components.">Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components.</a> Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).</li><li>Song, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instrument-Free+Point-of-Care+Molecular+Detection+of+Zika+Virus.">Instrument-Free Point-of-Care Molecular Detection of Zika Virus.</a> Analytical Chemistry. 88 (14), 7289-7294 (2016).</li><li>Yaren, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Point+of+sampling+detection+of+Zika+virus+within+a+multiplexed+kit+capable+of+detecting+dengue+and+chikungunya.">Point of sampling detection of Zika virus within a multiplexed kit capable of detecting dengue and chikungunya.</a> BioMed Central Infectious Diseases. 17 (1), 293 (2017).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+sensitive+detection+of+Zika+virus+by+reverse+transcription+loop-mediated+isothermal+amplification.">Rapid and sensitive detection of Zika virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification.</a> Journal of Virological Methods. 238, 86-93 (2016).</li><li>Priye, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+smartphone-based+diagnostic+platform+for+rapid+detection+of+Zika,+chikungunya,+and+dengue+viruses.">A smartphone-based diagnostic platform for rapid detection of Zika, chikungunya, and dengue viruses.</a> Scientific Reports. 7, 44778 (2017).</li></ol>

O ensaio de ZIKV RT-lâmpada descrito neste papel de trabalhos usando tanto humanos como mosquito amostras6. O limite de detecção foi de aproximadamente 1 genoma equivalente6, que devem ser suficientes, desde que a carga viral típica de um paciente ZIKV infectado sintomático é 103 a 106 PFU/mL7. Além disso, este método pode detectar ZIKV em amostras sem primeiro isolamento de RNA e sem amplificação do vírus...

Em 2015, vírus Zika (ZIKV) ganharam atenção mundial proeminente como uma doença infecciosa de preocupação porque infecção durante a gravidez estava ligada ao aborto, morte fetal, graves defeitos congênitos neurológicos incluindo microcefalia, bem como outras doenças congênitas defeitos de nascimento1. Em casos raros, ZIKV tem sido associado com a síndrome de Guillain-Barré. ZIKV é transmitida principalmente pelo Aedes mosquitos; no entanto, ele também pode ser transmitido através de de contato sexual1. Dado que a infecção com ZIKV é assintomática na maioria das pessoas ou apresenta com gripe-como sintomas leves que se sobrepõem com os sintomas da infecção de outros arborviruses1, havia uma necessidade de métodos aperfeiçoados de detecção rápida e econômica de ZIKV para as pessoas, bem como populações locais mosquito da tela.
A transcrição reversa quantitativa PCR (qRT-PCR) é um ensaio confiável para a deteção de ZIKV; no entanto, esta técnica requer equipamento especializado caro, pessoal treinado e isolamento de RNA da amostra de interesse. Transcrição reversa mediada por laço amplificação isotérmica (RT-lâmpada) é um método de amplificação do ácido nucleico de uma etapa baseado na tecnologia PCR que apenas requer uma temperatura de incubação devido ao uso de uma DNA-polimerase termofílicas com vertente Propriedades de deslocamento. Isso evita a necessidade de um thermocycler e diminui o comprimento de tempo necessário para completar o ensaio. Vantagens adicionais da RT-lâmpada incluem sua alta especificidade e sensibilidade, robustez em uma variedade de níveis de pH e temperatura e resistência a muitos inibidores PCR2. Tem um custo relativamente baixo e os reagentes são estáveis à temperatura ambiente. Tendo em conta estas características, RT-lâmpada pode ser implantada em um laboratório ou no campo. Como tal, as reações de luz foram desenvolvidas para detectar uma gama de patógenos e outros tipos de infecção3,4,5. O objetivo do protocolo de RT-lâmpada descrito neste documento é detectar ZIKV sem isolamento de RNA no soro e urina amostras humanas, bem como em um único mosquito infectado dentro de 30 min por meio de RT-lâmpada. Esse método pode ser usado para substituir o qRT-PCR, que é uma ferramenta de diagnóstico sensível e rápida que funciona rapidamente e em configurações fora do laboratório.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:901px;" width="902">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Bst 2.0 WarmStart DNA polymerase</td>
			<td style="width:223px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:223px;">M0537S</td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isothermal Amplification Buffer&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:223px;">B0537S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">WarmStart RTx Reverse Transcriptase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:223px;">M0380S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antarctic Thermolabile UDG</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:223px;">M0372S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgSO4</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:223px;">B1003S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100mM dATP Solution</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:223px;">N0440S</td>
			<td>Deoxynucleotide Set N0446S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100mM dCTP Solution</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:223px;">N0441S</td>
			<td>Deoxynucleotide Set N0446S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100mM dTTP Solution</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:223px;">N0443S</td>
			<td>Deoxynucleotide Set N0446S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100mM dGTP Solution</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:223px;">N0442S</td>
			<td>Deoxynucleotide Set N0446S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100mM dUTP Solution</td>
			<td style="width:223px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:223px;">R0133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td style="width:223px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:223px;">S7563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nancy-520</td>
			<td style="width:223px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:223px;">01494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Low DNA Mass Ladder</td>
			<td style="width:223px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:223px;">10-068-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Zika Postive Control</td>
			<td style="width:223px;">Robert Koch Institute, Germany</td>
			<td style="width:223px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Agarose</td>
			<td style="width:223px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:223px;">BP1600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">BlueJuice Gel Loading Buffer</td>
			<td style="width:223px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:223px;">10816015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Primers</td>
			<td style="width:223px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:223px;">Custom Oligo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Nuclease-Free Water</td>
			<td style="width:223px;">Ambion</td>
			<td style="width:223px;">AM9938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Urine Preservative</td>
			<td style="width:223px;">Norgen Biotek</td>
			<td style="width:223px;">18126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">ZIKV PCR Standard</td>
			<td>Robert Koch Institute</td>
			<td style="width:223px;">N/A</td>
			<td>Vero E6 cell supernatants</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">DENV2 New Guinea C Control</td>
			<td style="width:223px;">Connecticut Agricultural Experiment Station</td>
			<td style="width:223px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification (rt-lamp) assay for zika virus and housekeeping genes in urine, serum, and mosquito samples

Infecção com vírus Zika (ZIKV) pode ser assintomática em adultos, no entanto, a infecção durante a gravidez pode levar a aborto e neurológicos graves defeitos de nascimento. O objetivo do presente protocolo é rapidamente detectar ZIKV em amostras de ambos humanos e mosquito. O atual padrão-ouro para a deteção de ZIKV é quantitativa transcrição reversa PCR (qRT-PCR); amplificação isotérmica transcrição reversa mediada por laço (RT-lâmpada) pode permitir um teste mais eficiente e de baixo custo sem a necessidade de equipamento caro. Neste estudo, RT-lâmpada é utilizada para detecção de ZIKV em diversas amostras biológicas dentro de 30 min, sem primeiro a isolar o RNA da amostra. Esta técnica é demonstrada usando ZIKV infectados, soro e urina de paciente e infectado amostras de mosquito. O ácido ribonucleico ribossomal 18s e actina são usados como controles em amostras de humanos e mosquito, respectivamente.

Reações de RT-lâmpada podem ser analisadas usando três métodos diferentes. Primeiro, com a adição de um corante fluorescente de ácidos nucleicos, reações positivas será na cor verde/amarelo onde reações negativas aparecerão laranja na cor a olho nu. Em segundo lugar, a adição do corante para reação de RT-lâmpada fluorescente de ácidos nucleicos resulta em um sinal fluorescente quando as amostras são excitadas pela luz UV. Reações negativas não terá um sinal fluore...

Watch this Scientific Journal Video about Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification RT-LAMP Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples at JoVE

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification RT-LAMP Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

Reverter a transcrição Loop-mediada por amplificação isotérmica (RT-lâmpada) ensaio para vírus Zika e Housekeeping Genes em amostras de Mosquito, soro e urina

Este protocolo fornece um método eficiente e de baixo custo para detectar vírus Zika ou controlar alvos em amostras de urina e soro humanas ou em mosquitos por amplificação isotérmica transcrição reversa mediada por laço (RT-lâmpada). Este método não requer isolamento de RNA e pode ser feito dentro de 30 min.

Infection with Zika virus (ZIKV) can be asymptomatic in adults, however, infection during pregnancy can lead to miscarriage and severe neurological birth ...

Este método pode determinar rapidamente se as amostras contêm zika vírus. Isso é útil para mulheres grávidas, casais que tentam engravidar ou vigilância de populações locais de mosquitos que estão em risco de infecção pelo Zika. A principal vantagem dessa técnica é que ela é rápida, fácil, não requer equipamentos caros, e pode ser feita sem uma etapa de isolamento de RNA.As implicações dessa técnica se estendem para o diagnóstico da infecção pelo Zika, pois a infecção durante a gravidez está ligada ao aborto, natimorto e outros defeitos congênitos e neurológicos graves. Embora este método possa fornecer informações sobre o Zika, ele também pode ser aplicado a outras doenças infecciosas, como dengue, chikungunya ou vírus do Nilo Ocidental usando primers específicos do vírus. Para começar, reconstitua cada primer RT-LAMP em água de grau molecular para uma concentração final de 100 micromolar.Brevemente vórtice a solução primer para garantir que a solução seja homogênea. Centrifugar por cerca de cinco segundos em velocidade máxima para coletar a solução primer. Em seguida, prepare um mix de primer RT-LAMP de 10x, conforme descrito na tabela dois do protocolo da tecnologia.Vórtice brevemente para garantir a homogeneidade. E centrífuga brevemente em velocidade máxima para evitar qualquer perda. Armazene os primers a menos 20 graus Celsius, entre os usos, evitando quaisquer ciclos de congelamento.Para amostras de urina humana, use urina fresca, urina congelada ou urina em conservantes. Descongele todas as amostras congeladas no gelo antes de usar. As amostras de soro humano devem ser frescas ou congeladas, enquanto as linhas de células infectadas pelo ZIKV devem conter mídias condicionadas ou lises celulares.Finalmente, para mosquitos Aedes aegypti, use carcaças inteiras, frescas ou congeladas. Descongele qualquer carcaça de mosquito congelado no gelo. Coloque um mosquito individual em 100 microliters de PBS.Usando uma ponta de pipeta P10, esmague o mosquito 10 vezes e homogeneize-o para criar um mosquito cru. Centrifufique brevemente o lise bruto para pelotar qualquer detrito e use o sobrenatante para análise rt-lamp a jusante. Para começar, prepare uma reação de mistura mestre RT-LAMP no gelo para cada primer definido a ser usado, como esboço por tabela três no protocolo da tecnologia.Vórtice cada amostra para garantir que ele esteja bem misturado. Em seguida, gire-os brevemente para baixo para evitar perda de volume. Para cada reação, a pipeta 23.0 microliters do mestre RT-LAMP se mistura em um tubo PCR de 200 microliteres.Em seguida, adicione dois microliters de amostra para trazer o volume total para 25,0 microliters. Use água de grau molecular para o controle negativo, e certifique-se de incluir um controle positivo. Opcionalmente, inclua uma reação de controle de especificidade de um arbovirose relacionado, como o vírus da dengue, conforme descrito no protocolo da tecnologia.Usando um bloco de calor, banho de água ou um termociclador, aqueça as amostras a 61 graus Celsius por 30 minutos. Depois disso, aumente o calor para 80 graus Celsius por 10 minutos para desativar a polimerase. Realize a análise RT-LAMP em um espaço fechado separado.Diluir o corante de ácido nucleico fluorescente de um a dez em tampão TAE. Adicione dois micorliters da solução de corante ácido nucleico fluorescente a 12 micorliters da reação RT-LAMP. Avalie as reações RT-LAMP visualmente procurando a presença de uma mudança de cor.Opcionalmente use uma câmera para tirar fotos de reações RT-LAMP em um fundo branco. Em seguida, coloque as amostras sob uma luz UV de 302 nanômetros para confirmar a presença de produtos RT-LAMP por fluorescência. Use uma câmera para tirar uma foto do resultado.Para começar a realizar a eletroforese despeje gel de 2%agarose em 1x tampão TAE com uma mancha de ácido nucleico para visualização. Adicione cinco microliters de uma escada de DNA na primeira pista para comparar os pesos moleculares. Para cada reação RT-LAMP, misture 13 microliters de mistura de reação RT-LAMP com dois microliters de corante de carregamento de DNA.Carregue esta mistura de 15 microliter. Execute o gel a 90 volts por 90 minutos ou até que as bandas estejam separadas. Uma imagem com 302 nanômetros de luz UV.Quando terminar, descarte reações RT-LAMP em sacos selados duplos. Neste estudo, são utilizados três métodos diferentes para analisar as reações RT-LAMP. Ao usar corante ácido nucleico fluorescente, as reações positivas tornam-se de cor verde-amarela, enquanto as reações negativas aparecem laranja.Este corante também resulta em um sinal fluorescente quando as amostras são animadas pela luz UV. Por fim, as reações RT-LAMP podem ser esgotadas em um gel de agarose. Reações positivas rt-LAMP terão um padrão de banda, enquanto reações negativas não terão faixas de DNA.Estes métodos são usados para demonstrar a especificidade da reação ZIKV RT-LAMP. Apenas o controle molecular ZIKV tem uma reação RT-LAMP positiva. Além disso, enquanto zikv é detectado tanto na urina quanto no soro de um paciente com infecção zikv conhecida, ele não é visto no paciente de controle assintomático sem infecção por ZIKV.As amostras são então testadas para rRNA humano 18S. Apenas as amostras colhidas dos pacientes são consideradas positivas para rRNA 18S. As amostras de mosquitos podem ser testadas da mesma forma para ZIKV ou para o controle de qualidade RT-LAMP AEDAE.Apenas o controle molecular positivo para ZIKV e o mosquito infectado com ZIKV são vistos como positivos para ZIKV. No entanto, todos os mosquitos são positivos para AEDAE por RT-LAMP. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em menos de 30 minutos se for executada corretamente.É importante lembrar que as reações RT-LAMP são propensas a reações falsas positivas. As etapas de prevenção incluem o uso de um glicoscil de DNA uracil termolabile em reações, usando um fluxo de trabalho lateral, realizando análises em um espaço separado e reduzindo o tempo de tempo que os tubos pós-amplificação estão abertos. Após este procedimento, outros métodos como qpcr podem ser realizados a fim de responder a perguntas adicionais, como quantas cópias o vírus, ou outros alvos, estão presentes na amostra.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar o RT-LAMP para detectar o vírus Zika e direcionar controles na urina humana e soro, bem como mosquitos. Não se esqueça que trabalhar com zika vírus e mancha de ácido nucleico pode ser extremamente perigoso, e precauções como o uso de luvas devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento. Dada a associação da infecção pelo zika vírus com anormalidades congênitas, as mulheres que estão grávidas, tentando engravidar ou parceiras dessas mulheres, devem minimizar significativamente sua exposição laboratorial ao vírus Zika.

Research

JoVE Journal

Genetics

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

The Use of Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

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O uso de Induced Somatic Análise Sector (ISSA) para estudar genes e promotores envolvidos na formação da madeira e Desenvolvimento secundária da haste

Secondary stem growth in trees and associated wood formation are significant both from biological and commercial perspectives. However, relatively little ...

Genética

Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

Peptídeo derivado Método para Transporte genes e proteínas Através Celular e Barreiras organelares em plantas

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

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Determinação da localização cromossômica ideal para um elemento de DNA em Escherichia coli usando uma nova abordagem mediada por Transposon

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

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Cromatina (ChIP) imunoprecipitação para baixo-abundância embrionárias amostras

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High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

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Alta resolução hibridação fluorescente In Situ em embriões da drosófila e tecidos usando amplificação de sinal Tyramide

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Avaliação de uma reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa universal aninhada para a detecção de lissavírus

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

Protocolo in vitro para avaliação de níveis de MicroRNA, funções e genes alvo associados em células tumorais

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...