Name: reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification (rt-lamp) assay for zika virus and housekeeping genes in urine, serum, and mosquito samples
Uploaded: 2018-09-14T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification RT-LAMP Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples at JoVE

Эта работа была поддержана Морин и Рональд Хирш семейный благотворительный вклад и области нейронаук институт, Святой Марии штата Мичиган. Спонсоры имел никакой роли в дизайн исследования, сбор данных и анализ, решение опубликовать или подготовка рукописи. Мы также благодарим д-р Бернадетт Zwaans и Илия Уорд за их критического обзора рукописи.

Все методы, описанные здесь были одобрены организационного обзора (КИБ) Beaumont здоровья. Все эксперименты проводились в соответствии с соответствующих руководящих принципов и правил.
Предупреждение: Все потенциально инфекционные материалы должны обрабатываться согласн?...

<ol>
	<li>Petersen, L. R., Jamieson, D. J., Powers, A. M., Honein, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus.">Zika Virus.</a> New England Journal of Medicine. 374 (16), 1552-1563 (2016).</li><li>Francois, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robustness+of+a+loop-mediated+isothermal+amplification+reaction+for+diagnostic+applications.">Robustness of a loop-mediated isothermal amplification reaction for diagnostic applications.</a> Federation of European Microbiological Societies Immunology and Medical Microbiology. 62 (1), 41-48 (2011).</li><li>Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP)+of+gene+sequences+and+simple+visual+detection+of+products.">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products.</a> Nature Protocols. 3 (5), 877-882 (2008).</li><li>Gandasegui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rapid-Heat+LAMPellet+Method:+A+Potential+Diagnostic+Method+for+Human+Urogenital+Schistosomiasis.">The Rapid-Heat LAMPellet Method: A Potential Diagnostic Method for Human Urogenital Schistosomiasis.</a> Public Library of Science Neglected Tropical Diseases. 9 (7), 0003963 (2015).</li><li>Barkway, C. P., Pocock, R. L., Vrba, V., Blake, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP)+assays+for+the+species-specific+detection+of+Eimeria+that+infect+chickens.">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays for the species-specific detection of Eimeria that infect chickens.</a> The Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).</li><li>Lamb, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Detection+of+Zika+Virus+in+Urine+Samples+and+Infected+Mosquitos+by+Reverse+Transcription-Loop-Mediated+Isothermal+Amplification.">Rapid Detection of Zika Virus in Urine Samples and Infected Mosquitos by Reverse Transcription-Loop-Mediated Isothermal Amplification.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3803 (2018).</li><li>Faye, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+RT-PCR+for+detection+of+Zika+virus.">One-step RT-PCR for detection of Zika virus.</a> Journal of Clinical Virology. 43 (1), 96-101 (2008).</li><li>Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+inhibitors+-+occurrence,+properties+and+removal.">PCR inhibitors - occurrence, properties and removal.</a> Journal of Applied Microbiology. 113 (5), 1014-1026 (2012).</li><li>Poole, C. B., Tanner, N. A., Zhang, Y., Evans, T. C., Carlow, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+brugian+filariasis+by+loop-mediated+isothermal+amplification.">Diagnosis of brugian filariasis by loop-mediated isothermal amplification.</a> Public Library of Science Neglected Tropical Diseases. 6 (12), 1948 (2012).</li><li>Tanner, N. A., Zhang, Y., Evans, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+multiple+target+detection+in+real-time+loop-mediated+isothermal+amplification.">Simultaneous multiple target detection in real-time loop-mediated isothermal amplification.</a> Biotechniques. 53 (2), 81-89 (2012).</li><li>Chan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+Affordable+and+Portable+Medium-Throughput+Molecular+Device+for+Zika+Virus.">Rapid, Affordable and Portable Medium-Throughput Molecular Device for Zika Virus.</a> Scientific Reports. 6, 38223 (2016).</li><li>Lee, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+Highly+Sensitive+Molecular+Diagnosis+of+Zika+Virus+by+Lateral+Flow+Assays.">Simple and Highly Sensitive Molecular Diagnosis of Zika Virus by Lateral Flow Assays.</a> Analytical Chemistry. 88 (24), 12272-12278 (2016).</li><li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-Cost+Detection+of+Zika+Virus+Using+Programmable+Biomolecular+Components.">Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components.</a> Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).</li><li>Song, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instrument-Free+Point-of-Care+Molecular+Detection+of+Zika+Virus.">Instrument-Free Point-of-Care Molecular Detection of Zika Virus.</a> Analytical Chemistry. 88 (14), 7289-7294 (2016).</li><li>Yaren, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Point+of+sampling+detection+of+Zika+virus+within+a+multiplexed+kit+capable+of+detecting+dengue+and+chikungunya.">Point of sampling detection of Zika virus within a multiplexed kit capable of detecting dengue and chikungunya.</a> BioMed Central Infectious Diseases. 17 (1), 293 (2017).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+sensitive+detection+of+Zika+virus+by+reverse+transcription+loop-mediated+isothermal+amplification.">Rapid and sensitive detection of Zika virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification.</a> Journal of Virological Methods. 238, 86-93 (2016).</li><li>Priye, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+smartphone-based+diagnostic+platform+for+rapid+detection+of+Zika,+chikungunya,+and+dengue+viruses.">A smartphone-based diagnostic platform for rapid detection of Zika, chikungunya, and dengue viruses.</a> Scientific Reports. 7, 44778 (2017).</li></ol>

Пробирная ZIKV RT-лампа, описанные в этой бумаге работ с использованием как человека, так и комаров образцы6. Предел обнаружения был примерно 1 генома эквивалент6, которое должно быть достаточно, поскольку типичная вирусная нагрузка симптоматическим ZIKV инфицирова...

В 2015 году Зика вирус (ZIKV) получил видные глобального внимания как инфекционное заболевание озабоченность, поскольку инфекции во время беременности был связан с выкидыш, мертворождение, тяжелые неврологические врожденных дефектов, включая микроцефалия, а также другие врожденные врожденные дефекты1. В редких случаях ZIKV был связан с синдром Гийена-Барре. ZIKV преимущественно передается комарами Aedes ; Однако он также может распространяться через половой контакт1. Учитывая, что инфекции с ZIKV протекает бессимптомно у большинства людей или подарки с мягким гриппоподобные симптомы, которые совпадают с симптомами инфекции других arborviruses1, существует необходимость совершенствования методов для быстрого и экономически обнаружения ZIKV на экран как людей, так и местных комаров населения.
Количественная обратная транскрипция ПЦР (qRT ПЦР) является надежным методом для обнаружения ZIKV; Однако этот метод требует дорогостоящее специализированное оборудование, квалифицированного персонала и изоляции РНК из образца интерес. Обратная транскрипция цикла опосредованной изотермической амплификация (RT-лампа) является одношаговый метод амплификации нуклеиновых кислот, основанный на технологии PCR, которая требует только одной температуры инкубации за счет использовании теплолюбивых ДНК-полимеразы с нити Перемещение свойств. Это обходит необходимость Термоциклер и уменьшает продолжительность времени, необходимого для завершения анализа. Дополнительные преимущества RT-Лампа высокая специфичность и чувствительность, надежность в диапазоне рН и температуры и сопротивление многих ПЦР ингибиторы2. Он имеет сравнительно низкую стоимость и реагенты стабильны при комнатной температуре. Учитывая эти характеристики, RT-лампа может быть развернут в лаборатории или в поле. Таким образом лампа реакции были разработаны для обнаружить широкий спектр патогенов и других видов инфекции3,4,5. Цель протокола RT-лампа, описанных в данном документе является обнаружить ZIKV без изоляции РНК в человеческой сыворотки и мочи образцов, а также как единый инфицированных комаров в течение 30 мин через RT-лампа. Этот метод может использоваться для замены qRT-PCR как это чувствительной, быстрое диагностический инструмент, который работает быстро и в настройках вне лаборатории.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:901px;" width="902">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Bst 2.0 WarmStart DNA polymerase</td>
			<td style="width:223px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:223px;">M0537S</td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isothermal Amplification Buffer&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:223px;">B0537S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">WarmStart RTx Reverse Transcriptase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:223px;">M0380S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antarctic Thermolabile UDG</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:223px;">M0372S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgSO4</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:223px;">B1003S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100mM dATP Solution</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:223px;">N0440S</td>
			<td>Deoxynucleotide Set N0446S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100mM dCTP Solution</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:223px;">N0441S</td>
			<td>Deoxynucleotide Set N0446S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100mM dTTP Solution</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:223px;">N0443S</td>
			<td>Deoxynucleotide Set N0446S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100mM dGTP Solution</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td style="width:223px;">N0442S</td>
			<td>Deoxynucleotide Set N0446S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100mM dUTP Solution</td>
			<td style="width:223px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:223px;">R0133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td style="width:223px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:223px;">S7563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nancy-520</td>
			<td style="width:223px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:223px;">01494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Low DNA Mass Ladder</td>
			<td style="width:223px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:223px;">10-068-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Zika Postive Control</td>
			<td style="width:223px;">Robert Koch Institute, Germany</td>
			<td style="width:223px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Agarose</td>
			<td style="width:223px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:223px;">BP1600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">BlueJuice Gel Loading Buffer</td>
			<td style="width:223px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:223px;">10816015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Primers</td>
			<td style="width:223px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:223px;">Custom Oligo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Nuclease-Free Water</td>
			<td style="width:223px;">Ambion</td>
			<td style="width:223px;">AM9938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Urine Preservative</td>
			<td style="width:223px;">Norgen Biotek</td>
			<td style="width:223px;">18126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">ZIKV PCR Standard</td>
			<td>Robert Koch Institute</td>
			<td style="width:223px;">N/A</td>
			<td>Vero E6 cell supernatants</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">DENV2 New Guinea C Control</td>
			<td style="width:223px;">Connecticut Agricultural Experiment Station</td>
			<td style="width:223px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification (rt-lamp) assay for zika virus and housekeeping genes in urine, serum, and mosquito samples

Заражение вирусом Зика (ZIKV) может быть бессимптомным у взрослых, однако, инфекции во время беременности может привести к выкидышу и тяжелых неврологических врожденных дефектов. Цель настоящего Протокола заключается в быстро обнаружить ZIKV в образцах человека и комаров. Текущий золотой стандарт для обнаружения ZIKV является количественная обратная транскрипция ПЦР (qRT ПЦР); Обратная транскрипция цикла опосредованной изотермической амплификация (RT-лампа) может позволить для более эффективных и недорогостоящих тестирования без необходимости дорогостоящего оборудования. В этом исследовании RT-лампа используется для обнаружения ZIKV в различных биологических образцов в течение 30 мин, без первой изолировать РНК из образца. Этот метод показан с помощью ZIKV инфицированных пациентов мочи и сыворотки и инфицированных комаров образцы. 18s рибосомных рибонуклеиновой кислоты и актина используются в качестве элементов в образцах человека и комаров, соответственно.

RT-лампа реакции могут быть проанализированы с использованием трех различных методов. Во-первых с добавлением краски флуоресцентные нуклеиновых кислот, позитивные реакций будет желтый/зеленый цвет где негативной реакции будут отображаться оранжевый цвет невооружен?...

Watch this Scientific Journal Video about Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification RT-LAMP Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples at JoVE

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification RT-LAMP Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

Обратный Assay транскрипции петля опосредованной изотермической амплификация (RT-лампа) для Зика вирус и уборки генов в моче, сыворотки и пробы москитная

Этот протокол обеспечивает эффективный и недорогой способ обнаружить вирус Зика или контролировать цели в образцах мочи и сыворотки или комаров, обратная транскрипция цикла опосредованной изотермической амплификация (RT-лампа). Этот метод не требует РНК изоляции и может быть сделано в течение 30 мин.

Infection with Zika virus (ZIKV) can be asymptomatic in adults, however, infection during pregnancy can lead to miscarriage and severe neurological birth ...

Этот метод позволяет быстро определить, содержат ли образцы вирус Зика. Это полезно для беременных женщин, пар, пытающихся забеременеть, или наблюдения за местными популяциями комаров, которые находятся в опасности заражения вирусом Зика. Основным преимуществом этой техники является то, что она быстрая, легкая, не требует дорогостоящего оборудования, а может быть выполнена без шага изоляции РНК.Последствия этого метода распространяются на диагностику инфекции Зика, поскольку инфекция во время беременности связана с выкидышем, мертворождением и другими тяжелыми врожденными неврологическими врожденными дефектами. Хотя этот метод может дать представление о вирусе Зика, он также может быть применен к другим инфекционным заболеваниям, таким как денге, чикунгунья или вирус Западного Нила с помощью специфических для вируса праймеров. Для начала, восстановить каждый RT-LAMP грунтовки в молекулярном классе воды до окончательной концентрации 100 микромоляров.Кратко вихрь грунтовка решение для обеспечения решения является однородным. Центрифуга в течение примерно пяти секунд на максимальной скорости, чтобы собрать грунтовки решения. Затем подготовьте 10x RT-LAMP грунтовка смесь, как указано в таблице два протокола технологий.Vortex кратко, чтобы обеспечить однородность. И центрифуга кратко на максимальной скорости, чтобы избежать каких-либо потерь. Храните грунтовки при температуре минус 20 градусов по Цельсию, между использованиями, избегая любых циклов замораживания-оттепели.Для образцов мочи человека, использовать либо свежую мочу, замороженную мочу или мочу в консерванте. Оттепель любые замороженные образцы на льду перед использованием. Образцы сыворотки человека должны быть либо свежими, либо замороженными, в то время как зараженные клеточные линии ЗИКВ должны содержать либо условные средства массовой информации, либо лизаты клеток.Наконец, для комаров Aedes aegypti используйте целые туши, как свежие, так и замороженные. Оттепель любых замороженных туш комаров на льду. Поместите отдельного комара в 100 микролитров PBS.Использование P10 пипетки отзыв раздавить комаров 10 раз, и гомогенизировать его, чтобы создать сырой комаров лизировать. Кратко центрифуга сырой лизировать гранулы любого мусора и использовать супернатант для вниз по течению RT-LAMP анализа. Для начала подготовьтесь к реакции смеси RT-LAMP на льду для каждого грунтовщика, который будет использоваться, как наброски по таблице три в протоколе технологий.Vortex каждый образец, чтобы убедиться, что он хорошо смешивается. Затем кратко спина их вниз, чтобы предотвратить потерю объема. Для каждой реакции пипетки 23,0 микролитров мастера RT-LAMP смешиваются в 200 микролитровую ПЦР-трубку.Затем добавьте два микролитров образца, чтобы довести общий объем до 25,0 микролитров. Используйте молекулярную воду класса для отрицательного контроля, и убедитесь, что включить положительный контроль. По желанию включите реакцию контроля специфики связанного с ним арбовируса, такого как вирус денге, как указано в протоколе технологий.Используя тепловой блок, водяную баню или термоциклер, нагревайте образцы при температуре 61 градус по Цельсию в течение 30 минут. После этого увеличьте температуру до 80 градусов по Цельсию в течение 10 минут, чтобы нагреть деактивазу полимеразы. Выполните анализ RT-LAMP в отдельном замкнутом пространстве.Разбавить флуоресцентной нуклеиновой кислоты красителя от одного до десяти в буфере TAE. Добавьте два микорлита раствора флуоресцентной нуклеиновой кислоты к 12 микорлитам реакции RT-LAMP. Оцените реакции RT-LAMP визуально, ищя наличие изменения цвета.Дополнительно используйте камеру для съемки реакций RT-LAMP на белом фоне. Затем поместите образцы под 302 нанометровый ультрафиолетовый свет, чтобы подтвердить наличие продуктов RT-LAMP при флуоресценции. Используйте камеру, чтобы сфотографировать результат.Для начала выполнения электрофорез залить 2%agarose гель в 1x TAE буфер с нуклеиновой кислоты пятно для визуализации. Добавьте пять микролитров лестницы ДНК в первую полосу для сравнения молекулярных весов. Для каждой реакции RT-LAMP смешайте 13 микролитров реакционной смеси RT-LAMP с двумя микролитров красителя для загрузки ДНК.Загрузите эту 15 микролитровую смесь. Вы запустите гель на 90 вольт в течение 90 минут или до тех пор, пока полосы разделены. Изображение с ультрафиолетовым светом 302 нанометров.После завершения, распоряжаться RT-LAMP реакций в двойных запечатанных мешках. В этом исследовании используются три различных метода для анализа реакций RT-LAMP. При использовании флуоресцентной нуклеиновой кислоты краситель положительные реакции становятся желто-зелеными по цвету, в то время как негативные реакции появляются оранжевые.Этот краситель также приводит к флуоресцентный сигнал, когда образцы возбуждаются ультрафиолетовым светом. Наконец, rt-LAMP реакции могут быть запущены на агарозный гель. Положительные реакции RT-LAMP будут иметь полосу картины, в то время как негативные реакции не будут иметь полос ДНК.Эти методы используются для демонстрации специфики реакции ЗИКВ РТ-ЛАМП. Только молекулярный контроль ЗИКВ имеет положительную реакцию RT-LAMP. Кроме того, в то время как ЗИКВ обнаруживается как в моче, так и в сыворотке крови пациента с известной инфекцией ЗИКА, он не наблюдается у пациентов с аимптомическим контролем без инфекции ЗИКВ.Образцы затем проверяются на 18S rRNA человека. Только образцы, взятые у пациентов, как видно, положительные для 18S rRNA. Образцы комаров могут быть аналогичным образом протестированы на ЗИКВ или контроль качества RT-LAMP AEDAE.Только положительный молекулярный контроль для ЗИКВ и комаров, инфицированных ЗИКВ, как видно, положительный для ЗИКВ. Однако все комары являются положительными для AEDAE по RT-LAMP. После освоения, этот метод может быть сделано в возрасте до 30 минут, если она выполняется должным образом.Важно помнить, что реакции RT-LAMP подвержены ложноположимым реакциям. Профилактические шаги включают использование термолабильной гликозилазы ДНК uracil в реакциях, использование бокового рабочего процесса, выполнение анализа в отдельном пространстве, и сокращение времени после усиления трубки открыты. Следуя этой процедуре, в выборке могут быть выполнены и другие методы, такие как ПЦР, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, сколько копий вируса или других целей.После просмотра этого видео, вы должны иметь хорошее понимание того, как использовать RT-LAMP для обнаружения вируса Зика и целевого контроля в моче человека и сыворотки, а также комаров. Не забывайте, что работа с вирусом Зика и пятна нуклеиновой кислоты может быть чрезвычайно опасным, и меры предосторожности, такие как ношение перчаток всегда должны быть приняты при выполнении этой процедуры. Учитывая связь вирусной инфекции Зика с врожденными аномалиями, беременные женщины, пытаюсь забеременеть, или партнеры этих женщин должны значительно свести к минимуму лабораторное воздействие вируса Зика.

Research

JoVE Journal

Genetics

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

The Use of Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

The Use of Induced Somatic Sector Analysis ISSA for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

Использование Индуцированные анализа соматической сектора (ISSA) для изучения генов и промоутеров, участвующих в формировании древесины и вторичного развития Stem

Secondary stem growth in trees and associated wood formation are significant both from biological and commercial perspectives. However, relatively little ...

Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

Пептид происхождения Метод к транспорту генов и белков через клеточные и органелл барьеры в растений

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Определение оптимального расположения хромосомных ДНК элемента в Escherichia coli с помощью Роман Transposon опосредованный подход

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Протокол иммунопреципитации (чип) Chromatin для Low изобилие эмбриональных образцов

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

Высокое разрешение флуоресцентные в Situ гибридизация дрозофилы эмбрионов и тканей с помощью усиления сигнала Tyramide

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells sf9 for Protein Functional Assay

Переходных выражение иностранных генов в клетках насекомых (sf9) для функциональных Assay протеина

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell ...

Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer

Адаптация 3' Быстрая амплификация CDNA заканчивается для сопоставления стенограммы в раке

Maturation of eukaryotic mRNAs involves 3&#39; end formation, which involves the addition of a poly(A) tail. In order to map the 3&#39; end of a gene, the ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Усиление возле полнометражного ВИЧ-1 Proviruses для виртуализации нового поколения

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

Оценка универсального вложенного обратного транскрипционного цепной реакции для обнаружения Лисовивирусов

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

Протокол In Vitro для оценки уровней, функций и связанных с ними целевых генов в опухолевых клетках

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...