Name: generation of human 3d lung tissue cultures (3d-ltcs) for disease modeling
Uploaded: 2019-02-12T13:00:00
Duration: 5 min 47 s
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लेखक विशेषज्ञ तकनीकी सहायता के लिए Marisa न्यूमन के आभारी हैं. सभी फेफड़ों के ऊतकों कृपया सीपीसी-एम जैव-संग्रह द्वारा प्रदान की गई । इस काम को जर्मन फेफड़े अनुसंधान केंद्र (DZL), Helmholtz एसोसिएशन और सीपीसी अनुसंधान स्कूल अनुदान के द्वारा समर्थित किया गया था ।

मानव ऊतक के उपयोग को लुडविग-Maximillian विश्वविद्यालय [म्यूनिख, जर्मनी (परियोजना संख्या 455-12) की एथिक्स समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था]. ट्यूमर से मुक्त मानव फेफड़ों के चौराहों फेफड़ों के रोगों के लिए Asklepios बैंक द्वारा प्रदान की गई (Gauting, जर्मनी, परियोजना संख्या 333-10) ।
नोट: मानव PCLS उत्पादन की सभी प्रक्रियाओं (चित्रा 1) एक बाँझ लामिना प्रवाह हुड के तहत किया जाता है ।
1. उपकरणों और सामग्री की तैयारी
<ol><li>
agarose के साथ फेफड़ों के ऊतकों की मुद्रास्फीति के लिए सभी सामग्री के रूप में नीचे वर्णित तैयार करें ।
	<ol>
<li>खेती को तैयार मध्यम: Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) एफ-12 एल के साथ पूरक-Glutamine, HEPES, १०,००० ie पेनिसिलिन, १०,००० ie Streptomycin और ०.१% (वी/वी) भ्रूण गोजातीय सीरम । नोट: मध्यम ३७ डिग्री सेल्सियस पर प्रयोग किया जाता है ।</li>
		<li>एक बाँझ धातु टिशू पेपर के साथ कवर ट्रे तैयार करें । ट्रे पर एक बाँझ 15 सेमी सेल संस्कृति पकवान प्लेस ।</li>
		<li>खेती मध्यम के 15 मिलीलीटर के साथ सेल संस्कृति पकवान भरें ।</li>
		<li>एक 3% (डब्ल्यू/वी) agarose समाधान कम पिघलने बिंदु agarose की खेती मध्यम के 30 मिलीलीटर की एक ंयूनतम में उचित मात्रा को भंग करके तैयार करें ।</li>
		<li>एक माइक्रोवेव में उबलते तक समाधान गर्मी । एक जल स्नान में ४२ डिग्री सेल्सियस के लिए agarose समाधान ठंडा । तरल agarose समाधान पानी स्नान में संग्रहीत रखें ।</li>
		<li>तैयार कई ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूबों तरल agarose से भरा ।</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. संप्रदायिक फेफड़े के ऊतक
<ol><li>ताजा ट्यूमर मुक्त फेफड़े के ऊतकों lobectomy resectates के तुरंत DMEM एफ में लकीर के बाद-12 मध्यम 4 डिग्री सेल्सियस पर चरण 3 तक ।</li>
	<li>ठंड से अधिक नहीं 4-8 एच के ischemia समय से पहले प्रसंस्करण के लिए ।</li>
</ol>3. निरीक्षण और Agarose भरने से पहले संप्रदायिक ऊतक का चयन
<ol><li>मध्यम से चिमटी के साथ ऊतक उठा । आदेश में ऊतक को किसी भी नुकसान से बचने के लिए, विशेष रूप से फुफ्फुस के लिए, वायुमार्ग में चिमटी के साथ ऊतक संभाल ही ।</li>
	<li>तालिका 1में परिभाषित फेफड़ों Agarose भरने के स्कोर के मानदंडों के आधार पर ऊतक की गुणवत्ता स्कोर ।</li>
	<li>यदि ऊतक गुणवत्ता के ऊपर या ७२ के बराबर है रन 4 कदम के लिए आगे बढ़ें । यदि ऊतक की गुणवत्ता ६० के नीचे बनाए रखा है, agarose भरने के साथ आगे जारी नहीं है । नोट: यदि ऊतक स्कोर ६० और ६८ के बीच है, agarose भरने और ऊतक टुकड़ा करने की क्रिया अभी भी उचित परिणाम हो सकता है, और प्रयोग की लालसा के लिए एक अंतिम निर्णय के मामले को मामला बना दिया है । हालांकि, फेफड़ों के ऊतकों कि उपर्युक्त आवश्यकताओं को पूरा नहीं किया, ज्यादातर agarose भरने में विफल रहता है ।</li>
</ol>4. Agarose भरने के द्वारा फेफड़े के ऊतकों मुद्रास्फीति
<ol><li>भंडारण माध्यम से ऊतक लिफ्ट और ऊतक से अतिरिक्त मीडिया नाली । 15 सेमी संस्कृति 1.1.2 में तैयार पकवान में फेफड़ों के ऊतकों स्थानांतरण ।</li>
	<li>1.1.3 से कम पिघलने बिंदु agarose के साथ एक 30 मिलीलीटर सिरिंज भरें ।</li>
	<li>obturator को हटाने और यह एक 30 मिलीलीटर सिरिंज के लिए संलग्न द्वारा एक परिधीय शिरापरक कैथेटर तैयार</li>
	<li>ऊतक है कि ऊतक के एक बरकरार अनुभाग हवादार है में एक श्वसनी (0.5-3 मिमी व्यास) की पहचान ( चित्रा 2देखें) ।</li>
	<li>चयनित श्वसनी (0.5-3 मिमी व्यास) में प्रवेशनी डालें ।</li>
	<li>धीरे प्रवेशनी धक्का धीरे आगे के रूप में जहां तक संभव हो ।</li>
	<li>संदंश के साथ प्रवेशनी के चारों ओर दमा की दीवार सेक द्वारा प्रवेशनी के आसपास श्वसनी सील, आदर्श रूप में एक ही समय में किसी भी आसंन फुफ्फुसीय धमनी clamping ।</li>
	<li>बंद करना इन एयरवेज के माध्यम से agarose लीक रोकने के लिए एक शल्य क्लैंप के साथ अन्य अतिरिक्त एयरवेज ।</li>
	<li>संस्कृति पकवान से संदंश के साथ ऊतक उठा ।</li>
	<li>मैंयुअल रूप से कोई तेजी से ०.३ मिलीलीटर से सिरिंज के साथ agarose डालना/ agarose भरने की गति लगभग ०.०५ और ०.३ मिलीलीटर के बीच भिंन हो सकता है/एयरवेज और/या atelectasis के विषम प्रतिरोध के कारण ।</li>
	<li>
यदि उच्च प्रतिरोध भरते समय या ऊतक से टपक agarose मनाया जाता है, तो चरण ४.४ से एक अलग श्वसनी के साथ पूरी प्रक्रिया का पुनर्प्रयास करें । नीचे बताए अनुसार समस्या निवारण करें । नोट: agarose भरने की डिग्री ऊतक और क्षेत्रों की तरह छोटे शंकु के agarose भरने में कैथेटर के परिणामों के गहरी पैठ में कैथेटर की स्थिति पर अत्यधिक निर्भर है (*) फेफड़ों के ऊतकों (चित्रा 2c) ।<ol>
<li>उच्च प्रतिरोध के मामले में, कैथेटर की स्थिति की कोशिश ऊतक (#) (चित्रा 2d) के अधिकांश क्षेत्रों के उचित भरने की ओर जाता है ।</li>
		<li>समीपस्थ ब्रांकाई या अन्य airway अवरोधों में जल्दी जम agarose के प्लग के रूप में (तीर) ऊतक के एक अधूरा भरने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं (चित्रा 2E), इस भरे क्षेत्र में दोषों को जन्म दे सकता है के रूप में agarose भरने मजबूर नहीं है, लेकिन के एक भरने में नहीं बाधित ऊतक भागों ।</li>
		<li>cannulated श्वसनी से व्युत्पंन श्वसन पेड़ लकीर के दौरान क्षतिग्रस्त है और तरल agarose की एक निरंतर लीक में agarose भरने परिणाम ( चित्रा 2Fमें तीर), airway प्रणाली के एक अधिक परिधीय भाग में कैथेटर डालने के लिए ऊतक (*) (चित्रा 2g) का एक छोटा सा हिस्सा भरें । साथ ही, क्षतिग्रस्त पेरिफेरल airway को सर्जिकल क्लैंप (arrow) (figure2H) के साथ सील करें ।</li>
	</ol>
</li>
	<li>फेफड़ों के ऊतकों को पूरी तरह से भर जाता है जब तक agarose लागू करें । अधिक नहीं ऊतक फुलाना के रूप में इस ऊतक संरचना और उसकी कोशिकाओं को अपरिवर्तनीय नुकसान का कारण हो सकता है ।</li>
	<li>श्वसनी कि भरने के लिए इस्तेमाल किया गया था तुरंत दबाना । clamping करने से पहले प्रवेशनी निकालें ।</li>
	<li>agarose solidification सुनिश्चित करने के लिए 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति माध्यम में ऊतक की मशीन ।</li>
	<li>यदि resected ऊतक एकाधिक दमा प्रविष्टियों है, दोहराने चरण ४.२ करने के लिए ४.१३ जब तक ऊतक के सभी भागों agarose से भर रहे हैं ।</li>
	<li>टुकड़ा करने की क्रिया जब तक 4 ° c ठंड मध्यम में agarose भरा फेफड़ों के ऊतकों की दुकान ।</li>
</ol>5. परिशुद्धता-काट फेफड़ों टुकड़ा करने की क्रिया
<ol><li>
फेफड़ों के ऊतकों है कि ठोस agarose से भर रहे है क्षेत्रों की पहचान । वे धीरे सेल संस्कृति पकवान के नीचे के खिलाफ चिमटी के साथ दबाया जाता है जब ठोस रूप से भरा क्षेत्रों पतन नहीं होगा ।
	<ol>
<li>५.१ में वर्णित क्षेत्रों के 1-1.5 सेमी3 ब्लॉक एक्साइज, जबकि एक तरफ अभी भी फुफ्फुस के साथ कवर किया जाना चाहिए ।</li>
	</ol>
</li>
	<li>एक cyanoacrylate गोंद का उपयोग करके vibratome के धारक से संपर्क फुफ्फुस पक्ष के साथ प्रत्येक व्यक्ति के ऊतकों ब्लॉक देते हैं । नोट: फुफ्फुस थोड़ा लोचदार है और इसलिए vibratome ब्लेड के साथ काटने में बाधा उत्पंन । ऊतक धारक पर रखा, फुफ्फुस काटने के साथ हस्तक्षेप नहीं होगा और, महत्वपूर्ण बात, cyanoacrylate गोंद और ऊतक पैरेन्काइमा गोंद के ंयूनतम प्रसार के लिए अनुमति के बीच एक प्राकृतिक बाधा रूपों ।</li>
	<li>निंनलिखित सेटिंग्स के साथ vibratome के साथ फेफड़ों के ऊतकों स्लाइस: मोटाई: ५०० µm, आवृत्ति: १०० हर्ट्ज, चाकू के आयाम: १.२ मिमी, 3-12 µm के ब्लेड के आगे की गति/एस, जो ऊतक कठोरता पर निर्भर करता है । अगर टुकड़ा ठीक से कटौती नहीं है, या अगर ऊतक ब्लॉक ही कांपना शुरू होता है ब्लेड की दखलंदाजी-गति को कम करें ।</li>
	<li>धीरे vibratome ट्रे से संदंश के साथ एक 12 की अच्छी तरह से खेती मध्यम से भरी थाली के एक कुआं में उठाने से टुकड़ा हस्तांतरण । अंत में, मानक सेल संस्कृति की स्थिति के तहत एक मशीन में फेफड़ों स्लाइसें मशीन ।</li>
	<li>टुकड़ा करने की क्रिया बंद जब ऊतक ब्लॉक के 2-3 mm unslice गोंद इस क्षेत्र की ऊतक अखंडता समझौता हो सकता है के बाद से काट दिया जाता है ।</li>
</ol>6. PCLS घूंसे की जनरेशन
<ol><li>एक खाली 10 सेमी डिश के लिए एक अच्छी तरह से फेफड़ों के स्लाइस स्थानांतरण ।</li>
	<li>एक PCLS की ऊपरी सतह के लिए एक 4 मिमी बायोप्सी पंच orthogonally प्लेस और दक्षिणावर्त और उल्टी घुमाव में पंच ले जाने के लिए शुरू करते हैं ।</li>
	<li>एक ९६-अच्छी तरह से थाली के कुओं में सेल संस्कृति माध्यम भरें । संदंश के साथ ऊतक घूंसे लिफ्ट और एक ९६-अच्छी तरह से थाली के कुओं में घूंसे हस्तांतरण । अंत में, 1.1.1 में तैयार माध्यम में डूब फेफड़ों घूंसे मशीन । मानक शर्तों के तहत एक सेल संस्कृति मशीन में (21% (वी/वी) ऑक्सीजन, 5% (वी/वी) कार्बन डाइऑक्साइड और ९५% आर्द्रता, ३७ डिग्री सेल्सियस पर) ।</li>
</ol>7. टिशू कल्चर और सैंपल हार्वेस्टिंग
<ol><li>संस्कृति PCLS और मानक सेल संस्कृति की स्थिति के तहत एक मशीन में रातोंरात घूंसे ।</li>
	<li>संस्कृति PCLS और १२० घंटे की एक अधिकतम के लिए उल्लिखित शर्त के तहत घूंसे उनकी पीढ़ी के लिए सेलुलर व्यवहार्यता और कार्य सुनिश्चित करने के लिए ।</li>
	<li>कटाई के लिए प्रोटीन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से आरएनए, PCLS धोने और फास्फेट में तीन बार मुक्का मारा खारा (पंजाब), उंहें cryovials और स्नैप-फ्रीज में तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरण ।</li>
	<li>
स्रावित प्रोटीन के विश्लेषण के लिए कल्चर्ड PCLS घूंसे का नमूना मध्यम supernatant.
	<ol>
<li>ऊतकवैज्ञानिक विश्लेषण के लिए, PCLS को धो लें और पंजाबियों के साथ तीन बार घूंसे और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए मशीन द्वारा उंहें 4% paraformaldehyde के साथ ठीक । अंत में, आगे की बहाव धुंधला के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पंजाब में PCLS की दुकान ।</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+Synthesis+of+an+Artificial+Pulmonary+Pleura+for+High+Throughput+Studies+in+Acellular+Human+Lungs.">Design and Synthesis of an Artificial Pulmonary Pleura for High Throughput Studies in Acellular Human Lungs.</a> Cellular and Molecular Bioengineering. 7 (2), 184-195 (2014).</li></ol>

सभी लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा ।

इस पांडुलिपि में वर्णित प्रोटोकॉल तरल agarose और बाद vibratome टुकड़ा करने की क्रिया के साथ भरने के द्वारा मानव फेफड़े के ऊतकों resectates से PCLS की पीढ़ी को शामिल किया गया । ऊतक स्लाइस की पीढ़ी के अंगों के एक जोड़े के लिए पहले प्रदर्शन किया, जिगर और मस्तिष्क की तरह था, जबकि इन अंगों की अंतर्निहित कठोरता ऊतक के किसी भी संशोधन के बिना सीधे टुकड़ा करने की क्रिया की अनुमति दी । ध्यान दें, फेफड़ों के ऊतकों की प्रारंभिक उचित तैयारी PCLS पैदा करने में सबसे महत्वपूर्ण कदम है । फेफड़ों के Agarose भरने अपनी नरम और लोचदार प्रकृति को स्थिर करने के लिए पसंद की विधि है, और एक समरूप और reproducible PCLS पीढ़ी को सुनिश्चित करने के लिए । छोटे वायुमार्ग के लिए पहुंच प्रदान करने के लिए cannulated फेफड़ों के ऊतकों के बड़े एयरवेज, और साथ ही बरकरार फेफड़ों पैरेन्काइमा के लिए कर रहे हैं । एक बरकरार फुफ्फुस की कमी है, जो agarose लगभग असंभव भरने बनाता है, एक प्रमुख कारण है क्यों फेफड़ों ऊतक टुकड़ा करने की क्रिया के लिए ज्यादातर प्रयोग करने योग्य नहीं है । संभावित रूप से, एक सिंथेटिक फुफ्फुस मूल रूप से प्रताड़ित मचानों पर कार्यात्मक प्रयोगों के लिए डिज़ाइन संभावित explants के सफल agarose भरने कि एक बरकरार फुफ्फुस31कमी को प्राप्त करने के लिए लागू किया जा सकता है । फुफ्फुस बरकरार के साथ एक मानव फेफड़े के ऊतकों टुकड़ा में जिसके परिणामस्वरूप लकीर टुकड़ा करने की क्रिया के लिए ऊतक ब्लॉकों पैदा करने के लिए आवश्यक हैं । कीट ऊतक अधिक पूरी तरह से बरकरार पालियों से कैंसर लकीरें या पूरे फेफड़ों explants जो रोगियों के फेफड़ों प्रत्यारोपण किया गया से ट्यूमर मुक्त ऊतक के कारण उपलब्ध है ।
सामांयतः, दो प्रणालियों PCLS उत्पादन करने के लिए उपयोग किया जाता है: Krumdieck ऊतक स्लाइसर15 और थरथानेवाला microtomes (vibratomes) । ऊतक स्लाइसर एक धातु पोत है, जो इस पोत के अंत में ९० डिग्री पर PCLS में कटौती के माध्यम से एक ऊतक ब्लॉक गुजर द्वारा स्लाइसें उत्पंन करते हैं । Vibratomes ऊतक पर कम कतरनी बल डालती है जो एक शांत मध्यम स्नान, में जलमग्न हो जाता है कि एक कूल्ड मीडियम बाथ, में डूब जाता है के एक लंगर ब्लॉक पर क्षैतिज एक हिल चाकू ले जाकर PCLS उत्पन्न करते हैं । यह खेती से पहले ऊतक के कम कठोर उपचार में परिणाम है । दूसरी ओर, vibratome कटिंग अधिक समय और काम लेने वाली होती है । हमारे हाथ में, vibratome टुकड़ा करने की क्रिया एक दिन में १०० PCLS या ५०० PCLS घूंसे की एक अधिकतम के उत्पादन में सक्षम है, सबसे प्रयोगात्मक अध्ययन के लिए पर्याप्त है । PCLS विभिंन तरीकों से प्रसंस्कृत किया जा सकता है: (क) ट्रांस कुओं से जुड़ी, इस प्रकार एक एयर लिक्विड इंटरफेस (अली) प्रणाली, (ख) गतिशील अंग संस्कृति (डॉक्टर), या (ग) के रूप में सेल संस्कृति माध्यम में जलमग्न मानक सेल संस्कृति की स्थिति में पैदा । PCLS की खेती में विस्तार से पहले22,23,25वर्णित किया गया था; हालांकि, दुनिया भर में विभिंन प्रयोगशालाओं में उनके उपयोग के बीच खेती की स्थिति का एक सामांय मानक अभी भी याद आ रही है । विशेष रूप से, culture समय महत्वपूर्ण हो सकता है: के रूप में murine PCLS, SFTPC धनात्मक वायुकोशीय प्रकार 2 कक्षों की हानि १४४ h के बाद मनाया जाता है, लेकिन नहीं १२० h22के बाद । इसके अलावा, चयापचय गतिविधि के लिए murine में स्थिर रहने लगता है22 और मानव PCLS25 के लिए १२० ज ।
PCLS की पीढ़ी के लिए तकनीकी सीमाओं के एक जोड़े हैं: संख्या और resectates के आकार समय के साथ उतार चढ़ाव; agarose भरने की क्षमता है, जो प्राप्त ऊतक के भीतर बरकरार फुफ्फुस की उपस्थिति पर निर्भर करता है, PCLS पीढ़ी की अंतिम सफलता निर्धारित करता है; और ऊतक विनाश प्राप्त (रोगग्रस्त) फेफड़े के ऊतकों के भीतर रोग परिवर्तन की वजह से PCLS तैयारी के साथ हस्तक्षेप हो सकता है । Airway अवरोधों और fibrotic बरकरार वायुकोशीय अंतरिक्ष कमी ऊतक agarose भरने के साथ बाधा और इस तरह fibrotic ऊतक एक मांग कार्य की टुकड़ा करने की क्रिया करना । सीओपीडी या अल्फा-1-विरोधी trypsin की कमी के रूप में रोगों में पाया Emphysematous ऊतकों agarose भरने के दबाव का सामना नहीं कर सकता है, और alveoli और स्थापत्य कलाकृतियों का टूटना में परिणाम होगा । इन मामलों में, कम agarose एकाग्रता का उपयोग, उदाहरण के लिए , 1% (डब्ल्यू/वी), agarose भरने के दौरान दबाव और गति में कमी करने के लिए उपयोगी हो सकता है । कुल मिलाकर, ऊतक के रोग राज्य नाटकीय रूप से PCLS पीढ़ी के लिए ऊतक के उपयोग को सीमित कर सकते हैं । इन सभी मापदंडों PCLS की मात्रा है कि फेफड़ों के ऊतकों से उत्पन्न किया जा सकता है, और यह भी समय की मात्रा PCLS उत्पादन करने के लिए लेता है निर्धारित करते हैं । PCLS की आगे सीमाएं आकार या ऊतक सामग्री के संबंध में विभिन्न फेफड़ों के स्लाइस के बीच में विसंगतियां हैं, जिन्हें प्रयोगों के लिए आगे सामान्यीकरण चरणों की आवश्यकता होती है. इस पर काबू पाने के लिए, एक ही स्लाइस के समान क्षेत्रों के बायोप्सी घूंसे उत्पन्न किया जा सकता है । यह प्रक्रिया ऊतक परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए उपयुक्त है और, एक अतिरिक्त लाभ के रूप में, प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि PCLS नमूनों की संख्या में वृद्धि.
अंत में, मानव 3 डी agarose से फेफड़ों के ऊतकों संस्कृतियों फेफड़ों शरीर क्रिया विज्ञान और रोगों के अध्ययन के लिए एक जटिल मानव मॉडल प्रदान PCLS भर । प्रोटोकॉल resected फेफड़ों के ऊतकों और उनकी खेती से PCLS की तैयारी का एक विस्तृत वर्णन प्रदान करता है, और इसके अलावा मानव फेफड़ों के चौराहों के भरने agarose में चुनौतियों का पता है और कैसे उंहें दूर करने के लिए ।

जीर्ण और तीव्र फेफड़ों के रोगों1दुनिया भर में रुग्णता और मृत्यु का एक प्रमुख कारण हैं । प्रतिरोधी फुफ्फुसीय रोग (सीओपीडी)2, गंभीर अस्थमा3, फेफड़ों के कैंसर4 और फैलाना parenchymal फेफड़ों के रोगों की तरह पुरानी फेफड़ों के रोगों के साथ रोगियों के लिए5, उपचारात्मक चिकित्सा वर्तमान में उपलब्ध नहीं हैं । हालांकि फेफड़ों के रोगों के लिए पशु मॉडलों में अध्ययन रोग6 pathomechanisms की समझ गहरा है और संभावित उपंयास चिकित्सकीय लक्ष्य7,8,9की पहचान करने के लिए नेतृत्व किया है, इन मॉडलों को प्रासंगिक जैविक और शारीरिक मतभेद प्रदर्शित जब मनुष्यों की तुलना में10। murine और मानव जीव विज्ञान के बीच इन विसंगतियों को दूर करने के साथ ही शरीर रचना विज्ञान, मानव पूर्व vivo 3d फेफड़े के ऊतक संस्कृति (3d एलटीसी) सिस्टम जैव चिकित्सा अनुसंधान के विभिंन क्षेत्रों में उपयोग किया जाता है । ये 3d एलटीसी कल्चर सिस्टम परिशुद्धता-कट लंग स्लाइसेस (PCLS) पर आधारित होते हैं. PCLS पूर्व vivo की पीढ़ी के एक तिहाई स्थानिक आयामीता है, जो पूरे alveoli और11एयरवेज में कोशिकाओं के स्थानिक और कार्यात्मक संबंधों की जांच के लिए अनुमति देता है के विश्लेषण की अनुमति देता है, साथ ही साथ interstitium, vasculature और mesothelium. विशेष रूप से, PCLS पूर्व vivo मॉडल कोशिकीय हैं, जिसका अर्थ है कि वे सीटू के फेफड़ों में सबसे कार्यात्मक कोशिकाओं होते हैं, इस प्रकार बारीकी से ' कोशिकाओं देशी जैविक पर्यावरण का प्रतिनिधित्व करने और इस तरह सीमित सेल पर काबू पाने-सेल और सेल मैट्रिक्स सबसे 2d में बातचीत सेल संस्कृति दृष्टिकोण । अबतक, पूर्व vivo murine PCLS सीओपीडी12, फेफड़े फाइब्रोसिस13, फेफड़ों के कैंसर14, वायरल संक्रमण15,16, bronchopulmonary dysplasia17की तरह फुफ्फुसीय रोगों, मॉडल के लिए इस्तेमाल किया गया और दमा18. हालांकि, मानव फेफड़ों के रोगों में उपंयास दवा चिकित्सा के काफी अनुपात है कि नैदानिक परीक्षणों में जांच की गई प्रभावकारिता या सुरक्षा की उनकी कमी के कारण क्लिनिक में अनुवाद नहीं कर रहे हैं, संभालने के कारण मानव और के बीच अभी तक काफी मतभेद murine जीव विज्ञान और रोग19,20,21.
कई वर्षों में, मानव PCLS मोटे तौर पर रसायनों और दवाओं के फेफड़ों विषाक्तता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । हाल ही में, मानव फेफड़ों के ऊतकों सीओपीडी के साथ रोगियों से इस्तेमाल किया गया है22,23, अस्थमा24, और फेफड़ों फाइब्रोसिस25, pathophysiological और औषधीय अध्ययन को आगे बढ़ाने के लिए. प्रतिप्रदायिक रोगी अंग सामग्री का उपयोग करके और तत्संबंधी PCLS पैदा करके, एक एक जटिल 3 डी ऊतक पर्यावरण22 का प्रतिनिधित्व करने और अंग की देशी सेलुलर विविधता के सबसे बनाए रखने में दोहराऊंगा प्रमुख रोग की पहचान कर सकते हैं । इसके अलावा, रोगग्रस्त ऊतक प्रयोगात्मक setups की एक किस्म में लागू जिगर में परिवर्तन की तरह रोग की नकल करने के लिए दिखाया गया था, आंत और गुर्दे26,27,28,29.
हालांकि, फेफड़ों के ऊतकों की प्रोसेसिंग कई कारणों के लिए चुनौतीपूर्ण रहता है । ठोस ऊतक के विपरीत, देशी फेफड़े पैरेन्काइमा वेंटिलेशन के बिना पतन और कम ऊतक कठोरता दर्शाती है । इन गुणों ऊतक की टुकड़ा करने की क्रिया में बाधा । इस प्रकार, एयरवेज के भरने और कम-पिघलने बिंदु agarose के साथ वायुकोशीय अंतरिक्ष देशी फेफड़ों की संरचना को बरकरार रखता है और परिशुद्धता के लिए आवश्यक कठोरता-murine और मानव फेफड़ों की टुकड़ा करने की क्रिया कटौती30प्रदान करता है । मानव फेफड़े resectates अनुसंधान प्रयोजनों के लिए दान उनके स्वभाव anatomically द्वारा कर रहे हैं, आनुवंशिक रूप से और शारीरिक रूप से अत्यधिक विविध, इस प्रकार अक्सर एक उच्च अंतर रोगी परिवर्तनशीलता पेश जब25प्रयोग प्रदर्शन । पूरे पालि या पूरे फेफड़े के explants के विपरीत, फेफड़ों के नमूनों में वक्ष शल्य चिकित्सा के माध्यम से संप्रदाय जरूरी संरचनात्मक क्षेत्रों का पालन नहीं करते हैं और इसलिए विशेष तैयारी की आवश्यकता होती है । इस अनुच्छेद में, हम मानव PCLS की पीढ़ी के लिए एक विस्तृत और अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं जो कि फेफड़ों के ऊतकों और उनके बाद की खेती और मॉडल फेफड़े के रोग के लिए प्रयोगात्मक उपयोग से होता है ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vibratome Hyrax V50</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyrax CU 65</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vasofix Braun&#252;le 18G</td>
			<td>B. Braun Melsungen AG</td>
			<td>4268130B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30mL NORM-INJECT</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>4830001000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guarded disposable scalpels, sterile</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loctite 406</td>
			<td>Henkel</td>
			<td>LOCTITE 406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic Single Crystal Sapphire</td>
			<td>Delaware Diamond Knives</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium F-12 Nutreient Mixture (Ham) + L-Glutamine + 15mM HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31330-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Special process fetal bovine serum (Sera Plus)</td>
			<td>Pan Biotech</td>
			<td>P30-3702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Biopsy Punch</td>
			<td>pfm medical</td>
			<td>48401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well, Black/Clear, Tissue Culture Treated Plate, Flat Bottom with Lid, sterile</td>
			<td>Falcon / Corning</td>
			<td>353219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose, low geling temperature</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9414-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human 3d lung tissue cultures (3d-ltcs) for disease modeling

मानव रोग के लिए उपंयास खोजों के अनुवाद मानव ऊतक की उपलब्धता रोग के आधार पर आधारित मॉडल द्वारा सीमित है । प्रेसिजन-कट फेफड़ों के स्लाइस (PCLS) 3d फेफड़े के ऊतकों संस्कृतियों (3d LTCs) के रूप में इस्तेमाल एक सुरुचिपूर्ण और जैविक रूप से अत्यधिक प्रासंगिक 3 डी सेल संस्कृति मॉडल है , जो अपनी जटिलता, जैव यांत्रिकी और आणविक के कारण सीटू के ऊतकों में समान प्रतिनिधित्व करते हैं संरचना. ऊतक टुकड़ा करने की क्रिया व्यापक रूप से विभिंन पशु मॉडलों में लागू किया जाता है । 3 डी-मानव PCLS से व्युत्पंन LTCs उपंयास दवाओं, जो आगे बेहतर तंत्र और मानव ऊतक में दवाओं के कार्यात्मक प्रभाव को समझने में मदद कर सकता है के लिए प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण किया जा सकता है । शल्य चिकित्सा से PCLS की तैयारी फेफड़ों के ऊतकों के नमूने रोगियों, जो फेफड़े lobectomy अनुभवी, रोगग्रस्त और peritumoral ऊतक की पहुंच बढ़ जाती है । यहां, हम शल्य चिकित्सा नरम लोचदार रोगी फेफड़े के ऊतकों से मानव PCLS की पीढ़ी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन । Agarose resectates के bronchoalveolar अंतरिक्ष में पेश किया गया था, इस प्रकार फेफड़ों की संरचना के संरक्षण और ऊतक कठोरता, जो बाद में टुकड़ा करने की क्रिया के लिए महत्वपूर्ण है बढ़ रही है । vibratome के साथ टिशू ब्लॉक से ५०० µm मोटे स्लाइस तैयार किए गए । बायोप्सी PCLS से लिया घूंसे तुलनीय ऊतक नमूना आकार सुनिश्चित करने और आगे ऊतक नमूनों की मात्रा में वृद्धि । जनित फेफड़ों के ऊतकों संस्कृतियों मानव फेफड़ों जीव विज्ञान में अध्ययन की एक किस्म में लागू किया जा सकता है, pathophysiology और विभिन्न रोगों के तंत्र सहित, अपने पर सबसे अच्छा में fibrotic प्रक्रियाओं के रूप में (उप-) सेलुलर स्तर. 3 डी-एलटीसी ex vivo मॉडल का सबसे अधिक लाभ 3 डी ऊतक वास्तुकला, सेल प्रकार विविधता और फेफड़ों के एनाटॉमी के संबंध में सीटू मानव फेफड़ों में के रूप में अच्छी तरह से व्यक्तिगत रोगियों से ऊतक के आकलन के लिए क्षमता के अपने करीबी प्रतिनिधित्व है, जो आगे सटीक दवा के लिए उपंयास रणनीतियों का विकास करने के लिए प्रासंगिक है ।

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Generation of Human 3D Lung Tissue Cultures 3D-LTCs for Disease Modeling

यहां, हम agarose-भरा मानव परिशुद्धता की तैयारी के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद-resected रोगी ऊतक है कि 3 डी फेफड़ों ऊतक संस्कृतियों के लिए जैविक और जैव चिकित्सा अध्ययन में मानव फेफड़ों के रोगों मॉडल पैदा करने के लिए उपयुक्त है से फेफड़ों के स्लाइस में कटौती ।

मानव 3 डी फेफड़ों के ऊतक संस्कृतियों की पीढ़ी (3d-LTCs) रोग मॉडलिंग के लिए

Translation of novel discoveries to human disease is limited by the availability of human tissue-based models of disease. Precision-cut lung slices (PCLS) ...

यह विधि संभावित उपचारों में प्रमुख प्रयोगशाला निष्कर्षों के अनुवाद के लिए प्राकृतिक 3 डी संरचना और संरचना में जीवित मानव ऊतक की जांच की अनुमति देती है। यह तकनीक विशेष रूप से ऊतक संस्कृतियों की पीढ़ी को व्यक्तिगत मृत रोगी फेफड़ों के ऊतकों के नमूनों के दृश्य के लिए शल्य चिकित्सा से पुनः प्राप्त या मानव फेफड़ों के ऊतकों को निकालने में सक्षम बनाती है। रोग मुक्त फेफड़ों के ऊतकों को 3 डी ऊतक संस्कृतियों के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है मॉडल पल्मोनरी रोगों पूर्व वीवो एक उच्च स्थानिकप्र संकल्प में प्रारंभिक रोगविज्ञान के विश्लेषण को सक्षम करने के लिए ।एक बाँझ 15 सेंटीमीटर संस्कृति पकवान और बाँझ धातु टिश्यू पेपर में कवर ट्रे में खेती माध्यम के 15 मिलीलीटर में पुनः प्राप्त फेफड़ों के नमूने रखने से शुरू करो, और ४२ डिग्री सेल्सियस कम पिघलने बिंदु agarose के साथ एक 30 मिलीलीटर सिरिंज भरें । एक परिधीय विषैले कैथेटर से ऑबटर निकालें और कैथेटर को 30 मिलीलीटर सिरिंज से अटैच करें। ऊतक के एक बरकरार खंड में हवादार ऊतक में 0.5 से 3 मिलीमीटर व्यास के ब्रोंचस की पहचान करें, और जहां तक संभव हो, धीरे-धीरे कैनुला को ब्रोंकस में डालें।कैनुला के चारों ओर ब्रोंकिओल दीवार को संपीड़न करने के लिए संदंश का उपयोग करें, आदर्श रूप से एक ही समय में किसी भी आसन्न फेफड़े की धमनी को क्लैंप करें, कैनुला के चारों ओर ब्रोंकस को सील करने के लिए और किसी भी अन्य अतिरिक्त वायुमार्ग को ऑक्सीलेड करने के लिए सर्जिकल क्लैंप का उपयोग करें, ताकि एगरेग् लीकेज को रोका जा सके। इसके बाद, संस्कृति पकवान से फेफड़ों के ऊतकों को उठाने के लिए संदंश का उपयोग करें, और सिरिंज का उपयोग मैन्युअल रूप से कैनुला के माध्यम से एग्राम को वितरित करने के लिए करें, प्रति सेकंड 0.3 मिलीलीटर से अधिक तेज नहीं। जब फेफड़ों के ऊतक ऊतकों को ओवर-फुलाने के बिना पूरी तरह से भर जाता है, तो तुरंत कैनुला को हटा दें और ब्रोंकस को दबाएं।संस्कृति माध्यम में ऊतक को 30 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर जलमग्न करें ताकि एगर उठे ठोसकरण की सुविधा मिल सके, और किसी भी अतिरिक्त ब्रोंकियोल उद्घाटन के लिए एगर उठे भरने की प्रक्रिया को दोहराएं। फिर, टुकड़ा करने की क्रिया तक चार डिग्री सेल्सियस माध्यम में agarose से भरे फेफड़ों के ऊतकों वर्गों की दुकान । सटीक कट फेफड़ों की टुकड़ा करने की क्रिया के लिए, फेफड़ों के ऊतकों के भीतर मजबूती से agarose से भरे क्षेत्रों की पहचान करें, जो सेल संस्कृति पकवान के नीचे के खिलाफ चिमटी के साथ धीरे-धीरे दबाए जाने पर गिर नहीं जाते हैं।उत्पाद एक 1 से 1.5 घन सेंटीमीटर ब्लॉक मजबूत रूप से भरे हुए क्षेत्र के साथ एक तरफ अभी भी प्लूरा से ढका हुआ है, और प्रत्येक ऊतक ब्लॉक के बहुवचन पक्ष को वाइब्रेकोम धारक को संलग्न करने के लिए साइनोक्रिलेट गोंद का उपयोग करें। लंबे ऊतक ब्लॉक के माध्यम से पूरे रास्ते का टुकड़ा, जब तक ऊतक के केवल दो से तीन milometers बिना लाइसेंस छोड़ दिया जाता है । प्रत्येक 500 माइक्रोमीटर अनुभाग को बारह-अच्छी तरह से प्लेट युक्त खेती माध्यम के एक कुएं में स्थानांतरित करने के लिए संदंश का उपयोग करना, क्योंकि वे प्राप्त किए जाते हैं।जब सभी ऊतकों को अनुभागित किया गया है, तो प्रत्येक अच्छी तरह से नमूनों को व्यक्तिगत दस सेंटीमीटर संस्कृति व्यंजनों में स्थानांतरित करें और सटीक-कट फेफड़ों के टुकड़े की ऊपरी सतह पर चार मिलीमीटर बायोप्सी छिद्रक ऑर्थोगोनली स्थिति में रखें। फिर, दक्षिणावर्त और पलटवार में छिद्रक को आगे बढ़ाते हुए, फेफड़ों के नमूने के ऊतक घूंसे प्राप्त करें। एक ९६-अच्छी तरह से थाली के व्यक्तिगत कुओं में ताजा सेल संस्कृति माध्यम में प्रत्येक पंच रखने के रूप में वे प्राप्त कर रहे हैं ।जब सभी ऊतक घूंसे प्राप्त कर लिए गए हैं, तो प्लेट को सेल कल्चर इनक्यूबेटर में पांच दिनों तक रखें। मानव 3-डी फेफड़ों के ऊतक संस्कृतियों में इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करके कोशिका नाभिक में फाइब्रोनेक्टिन की इम्यूनोलबेलिंग संरक्षित अल्वेलर संरचना पूर्व वीवो की इमेजिंग की अनुमति देती है। मानव परिशुद्धता के उपचार के उपचार के लिए एक प्रोफिब्रोटिक साइटोकिन कॉकटेल के साथ फेफड़ों के टुकड़े घूंसे ४८ घंटे के लिए मानव फेफड़ों 3-डी ऊतक संस्कृतियों में फाइब्रोसिस की तरह परिवर्तन में परिणाम, फाइब्रोसिस प्रासंगिक बाह्य मैट्रिक्स घटकों, कोलेजन प्रकार एक, और फाइब्रोनेक्टिन जीन के महत्वपूर्ण प्रेरण सहित ।इसके अतिरिक्त, मेसेंचिमल मार्कर विमेंटिन के प्रोटीन स्तर को 3-डी फेफड़ों के ऊतकों की संस्कृति घूंसे के उपचार के बाद चार रोगियों में से तीन में विनियमित किया जाता है। इस प्रक्रिया के बाद, मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर द्वारा आरएनए विश्लेषण, या पश्चिमी ब्लॉटिंग द्वारा प्रोटीन विश्लेषण जैसे अन्य तरीकों को ऊतक के भीतर क्रमशः जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है। इसके विकास के बाद, इस तकनीक ने प्रयोगात्मक फेफड़े विज्ञान के क्षेत्र में शोधों के लिए मार्ग प्रशस्त किया, फेफड़ों के जीव विज्ञान को निकालने के साथ-साथ मानव ऊतक नमूनों में विषाक्त और औषधीय अध्ययन करने के लिए।याद रखें कि जीवित मानव ऊतक संभावित रूप से संक्रमित है और इस प्रक्रिया को निष्पादित करते समय व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण और उचित ऊतक भंडारण, परिवहन और अपशिष्ट हैंडलिंग का उपयोग करने जैसे एहतियाती उपाय हमेशा लिए जाने चाहिए

Research

JoVE Journal

Medicine

Generation of Human 3D Lung Tissue Cultures (3D-LTCs) for Disease Modeling

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

माउस फेफड़े इंटुबैषेण का एक सरल तरीका

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

रोग मॉडलिंग के लिए पेशी बायोप्सी से मरीज व्युत्पन्न सेल लाइनों के अलगाव और अमरता

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation

त्वचा माइक्रो Grafts पीढ़ी के लिए एक नई विधि disaggregation के बाद ऊतक विशेषता

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one ...

Quantitative 3D In Silico Modeling (q3DISM) of Cerebral Amyloid-beta Phagocytosis in Rodent Models of Alzheimer's Disease

Quantitative 3D In Silico Modeling q3DISM of Cerebral Amyloid-beta Phagocytosis in Rodent Models of Alzheimer's Disease

मात्रात्मक 3 डी<em&gt; सिलिको</em&gt; मॉडलिंग अल्जाइमर रोग के कृंतक मॉडल में मस्तिष्क amyloid बीटा phagocytosis की (q3DISM)

Neuroinflammation is now recognized as a major etiological factor in neurodegenerative disease. Mononuclear phagocytes are innate immune cells responsible ...

3D Ultrasound Imaging: Fast and Cost-effective Morphometry of Musculoskeletal Tissue

3d अल्ट्रासाउंड इमेजिंग: पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस ऊतक के तेजी से और लागत प्रभावी Morphometry

The developmental goal of 3D ultrasound imaging (3DUS) is to engineer a modality to perform 3D morphological ultrasound analysis of human muscles. 3DUS ...

Imaging Features of Systemic Sclerosis-Associated Interstitial Lung Disease

सिस्टमिक स्क्लेरोसिस-एसोसिएटेड इंटरस्टिशियल फेफड़ों की बीमारी की इमेजिंग विशेषताएं

Early diagnosis of systemic sclerosis-related interstitial lung disease (SSc-ILD) is important to enable treatment to be administered with minimal delay. ...

Tissue Preparation Techniques for Contrast-Enhanced Micro Computed Tomography Imaging of Large Mammalian Cardiac Models with Chronic Disease

इसके विपरीत के लिए ऊतक तैयारी तकनीक-बढ़ाया माइक्रो कम्प्यूटेड टोमोग्राफी क्रोनिक रोग के साथ बड़े स्तनधारी कार्डियक मॉडल की इमेजिंग

Structural remodeling is a common consequence of chronic pathological stresses imposed on the heart. Understanding the architectural and compositional ...

Standardization and Maintenance of 3D Canine Hepatic and Intestinal Organoid Cultures for Use in Biomedical Research

मानकीकरण और बायोमेडिकल अनुसंधान में उपयोग के लिए 3 डी कैनाइन हेपेटिक और आंतों के Organoid संस्कृतियों के रखरखाव

Dogs develop complex multifactorial diseases analogous to humans, including inflammatory diseases, metabolic diseases, and cancer. Therefore, they ...

Enhancing Pulmonary Nodule Diagnosis Using Whole-Lung 3D Reconstruction

Three-Dimensional Reconstruction for the Whole Lung with Early Multiple Pulmonary Nodules

Advancing 3D Modeling for Enhanced Diagnosis and Treatment of Pulmonary Nodules in Early-Stage Lung Cancer (Video) | JoVE

प्रारंभिक मल्टीपल पल्मोनरी नोड्यूल्स के साथ पूरे फेफड़े के लिए त्रि-आयामी पुनर्निर्माण

For patients with early multiple pulmonary nodules, it is essential, from a diagnostic perspective, to determine the spatial distribution, size, location, ...

Innovative Lung Imaging Using Agarose-Embedded Vibratome Sections

Automated Vibratome Sectioning of Agarose-Embedded Lung Tissue for Multiplex Fluorescence Imaging

Studying Spatial Protein Expression Using Agarose Embedded Lung Tissue Sections (Video) | JoVE

मल्टीप्लेक्स प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए एगरोज़-एम्बेडेड फेफड़े के ऊतक का स्वचालित वाइब्रेटोम सेक्शनिंग

Due to its inherent structural fragility, the lung is regarded as one of the more difficult tissues to process for microscopic readouts. To add structural ...