Name: generation of human 3d lung tissue cultures (3d-ltcs) for disease modeling
Uploaded: 2019-02-12T13:00:00
Duration: 5 min 47 s
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著者は、専門家の技術援助の魔理沙のノイマンに感謝しています。すべての肺組織は親切 CPC M バイオ アーカイブによってを提供されます。この作品は、肺研究 (dzl と)、ヘルムホルツ協会、CPC 研究学校補助金のドイツ センターによって支えられました。

人間の組織の使用は、[ミュンヘン、ドイツ (プロジェクト番号 455 12)] ルートヴィヒ マクシミリアン大学の倫理委員会によって承認されました。ひと腫瘍無料肺切除術は、肺疾患 (Gauting, ドイツの, プロジェクト番号 333-10) のアスクレピオス バイオバンクによって提供されました。
注:人間の PCL 生産 (図 1) のすべてのプロシージャは、滅菌の層流フードの下で行われます。
1. 器具材料の準備
<ol><li>
下記のとおりの agarose が付いて肺組織のインフレのすべての材料を準備します。
	<ol>
<li>培地の準備: ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) F-12 L-グルタミン、HEPES、10,000 IE ペニシリン、10,000 IE ストレプトマイシン 0.1% (v/v) ウシ胎児血清を添加しました。 注:37 ° C でメディアを使用します。</li>
		<li>ティッシュ ペーパーで覆われた滅菌金属製のトレイを準備します。トレイに滅菌 15 cm 細胞培養皿を置きます。</li>
		<li>15 mL の培地で細胞培養ディッシュを埋めます。</li>
		<li>3% (w/v) アガロース溶液を準備するには、最小培地 30 mL の低融点ポイント agarose の適切な量を溶解します。</li>
		<li>熱沸騰するまでレンジでソリューション。42 の ° C の水浴中にアガロース溶液を冷却します。風呂の水に格納されている液体アガロース溶液を維持します。</li>
		<li>いくつかの 50 mL の円錐管満ちている液体の agarose を準備します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 肺癌組織
<ol><li>ストア新鮮な無料肺腫瘍切除 resectates ステップ 3 まで 4 ° C、DMEM F 12 中切除直後後の。</li>
	<li>処理の前に 4-8 時間の冷たい虚血時間を超えないようにします。</li>
</ol>3. 検査・ アガロース充填前に切除組織の選択
<ol><li>ピンセットで中から組織を持ち上げます。胸膜では特に、組織への損傷を避けるために気道だけでピンセットでティッシュを処理します。</li>
	<li>アガロース充填肺スコアの表 1に定義の条件に基づいて組織の品質をスコアします。</li>
	<li>組織の品質より大きいか等しい 72 の採点される場合手順 4 に進みます。組織の品質の 60% 以下スコアは、もし続きを充填の agarose が付いてさらに。 注:組織のスコアが 60 と 68 の場合合理的な結果を生む可能性がありますまだ agarose 充填と組織スライスと実験の延長は最終決定がケースにケースを可能にします。ただし、上記の要件を満たしていない肺組織はほとんど充填 agarose の失敗します。</li>
</ol>4. 肺組織インフレ Agarose 記入
<ol><li>記憶媒体から組織を持ち上げて、組織から余分なメディアを排出します。1.1.2 の準備 15 cm 培養皿に肺組織を転送します。</li>
	<li>1.1.3 からポイントの低融点アガロースで 30 mL シリンジを埋めます。</li>
	<li>Obturator を削除することによって末梢静脈カテーテルを準備し、30 mL の注射器に接続</li>
	<li>組織部がそのままの換気は組織における気管支 (0.5-3 mm の直径) を識別する (図 2参照)。</li>
	<li>選択した気管支にカニューレを挿入 (0.5-3 mm の直径)。</li>
	<li>可能な限り穏やかにカニューレを軽く押します。</li>
	<li>理想的には同時に任意の隣接する肺動脈をクランプ鉗子でカニューレ周囲気管支壁の圧縮でカニューレ周囲気管支はシールします。</li>
	<li>Agarose のこれらの航空路を介して漏れを防ぐために手術用クランプ他追加気道を閉塞します。</li>
	<li>培養皿から鉗子で組織を持ち上げます。</li>
	<li>手動で注射器を 0.3 mL/s よりも速く agarose を注ぐ。充填 agarose の速度は、約 0.05 ~ 航空や無気肺の異機種混在環境の抵抗のため 0.3 mL/秒の異なる場合があります。</li>
	<li>
充填または組織からの漏れの agarose 中高抵抗が発生した場合は、手順 4.4 から異なる気管支で全体の手順を再試行します。以下のトラブルシューティングを実行します。 注:充填 agarose の程度は組織でカテーテルの位置および地域 (*) 肺組織 (図 2) のような小さい円錐形の agarose 充填でカテーテルの結果の浸透に大きく依存。<ol>
<li>高抵抗の場合 (図 2 D) (#) 組織のほとんどの地域の適切な充填にカテーテル リードの位置決めをしてください。</li>
		<li>近位気管支または障害物 (矢印) が (図 2 e) 組織の不完全な充填につながることができます他の気道内初期凝固 agarose のプラグとしてアガロース充填の充填ではなく塗りつぶしの領域での欠陥につながる可能性として無理します。閉塞組織の部分。</li>
		<li>● キャニュレイテッド気管支から派生した呼吸のツリーは、切除や液体 agarose (図 2 fの矢印) の定数漏れの結果を充填 agarose の中に損傷がある場合は気道系により周辺部にカテーテルを挿入します。少なくとも組織 (*) (図 2) のマイナーな部分を記入してください。さらに、手術のクランプ (矢印) (図 2 H) で破損した末梢気道を封印します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>肺の組織が完全に塗りつぶされるまでは、アガロースを適用します。組織は、組織構造とその細胞に不可逆的な損傷を引き起こす可能性がありますこの過剰注入しないでください。</li>
	<li>クランプ気管支充填に使用されたすぐに。クランプする前にカニューレを削除します。</li>
	<li>アガロース凝固を確認する 30 分の 4 ° C で培養組織を孵化させなさい。</li>
	<li>切除組織に気管支の複数のエントリがある場合は、組織のすべての部分は、アガロースで満ちているまで手順 4.2 に 4.13 を繰り返します。</li>
	<li>店のアガロースゲル スライスまで 4 ° C の冷たい中に肺ティッシュ セクションをいっぱい。</li>
</ol>5. 精密カット肺のスライス
<ol><li>
Agarose で満ちているしっかりと肺組織内の領域を識別します。彼らが細胞培養皿の底面に対してピンセットで軽く押されたとき、しっかりと塗り潰し領域は折りたたまれません。
	<ol>
<li>片側まだ胸膜とカバーされるべきであるに対し、5.1 では、指定された領域の消費税 1 〜 1.5 cm の3ブロック。</li>
	</ol>
</li>
	<li>個々 の組織の各ブロックのシアノアクリ レート系接着剤を使用して、vibratome の所有者に連絡胸膜側付します。 注:胸膜は少し弾力性したがって vibratome 刃を切断を阻害する.ティッシュ ホルダーに置くと、胸膜切断と干渉しない、重要なは、シアノアクリ レート系接着剤と接着剤の最小限の拡散を可能にする組織の実質の自然な障壁を形作る。</li>
	<li>次の設定で vibratome と肺組織のスライス: 厚さ: 500 μ m、周波数: 100 Hz、ナイフの振幅: 1.2 mm、3-12 μ m/s、組織剛性に依存するブレードの速度。スライスのカットが、適切ではない場合、または振動を開始する組織ブロック自体は、ブレードの前突速度を減らします。</li>
	<li>軽く培地でいっぱい 12 ウェル プレートのウェルに vibratome トレイからピンセットでそれを持ち上げることによってスライスを転送します。最後に、肺のスライス標準培養条件下でインキュベーターで孵化させなさい。</li>
	<li>停止スライス組織ブロックの 2 〜 3 mm が残っている場合丸ごと以来、シアノアクリ レート系接着剤により、この地域の組織の完全性が侵害します。</li>
</ol>6. PCL パンチの世代
<ol><li>空 10 cm 皿に単一の井戸から肺のスライスを転送します。</li>
	<li>PCL の上面に縦横 4 mm 生検パンチャーを置き、右回りと左回りの回転のパンチャーを移動を開始します。</li>
	<li>96 ウェル プレートのウェルに、細胞培養液を入力します。鉗子を使って組織パンチをリフトし、96 ウェル プレートのウェルにパンチを転送します。最後に、1.1.1 で調製した培地に浸漬肺パンチを孵化させなさい。標準条件 (酸素が 21% (v/v), 5% (v/v)、二酸化炭素と 95% の湿度 37 ° c) の下での細胞培養インキュベーターで</li>
</ol>7. 組織培養とサンプルの収穫
<ol><li>PCL と標準的な培養条件下でインキュベーターで一晩パンチの文化.</li>
	<li>培養細胞の生存と機能を確保するため PCL および 120 時間後彼らの世代の最大の輪郭を描かれた条件下でのパンチ。</li>
	<li>タンパク質と RNA の収穫、PCL とリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で 3 回パンチを洗う、クリオバイアルにそれらを転送およびスナップ-凍結液体窒素で。</li>
	<li>
培養 PCL のサンプル中の上澄みはパンチから分泌されるタンパク質の分析のため。
	<ol>
<li>組織学的解析では、PCL および PBS で 3 回パンチを洗浄し、37 ° C で 30 分間インキュベートし 4% パラホルムアルデヒドで固定最後に、さらに下流の汚損のための 4 ° C で PBS で、PCL を格納します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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すべての著者は競合する金銭的な利益を宣言しません。

本稿で説明されたプロトコルは、液体アガロースと後続の vibratome スライスで塗りつぶすことによりひと肺組織 resectates から PCL の世代をカバーしています。組織スライスの世代は、これらの器官の固有の剛性はそのまま組織のスライスを直接許可、肝臓や脳などの臓器のカップルのため前に示されました。注記のうち、肺組織の初期の適切な準備は、PCL を生成する際に最も重要なステップです。肺の Agarose の充填は、選択はその柔らかく、弾性の性質を安定させるために、同種で再現可能な PCL の世代を確保するための方法です。肺癌組織の大きい航空路、小気道だけでなく、そのまま肺実質へのアクセスを提供する cannulated します。充填アガロースはほぼ不可能になります、そのまま胸膜の欠如は、肺は肺をスライスするために使用可能なほとんどない主要な理由です。前向き、もともと脱足場の機能の実験を行うため合成胸膜は成功したアガロース充填不足そのまま胸膜31外植体を達成するために可能性があります適用でした。そのまま胸膜とひと肺組織部分の切除がティッシュをスライスするためのブロックを生成するために不可欠です。切除は完全にそのまま葉や肺移植を受けた患者の全肺植よりも腫瘍組織がん切除からのため利用可能です。
一般的には、2 つのシステムは、PCL を生成に使用される: Krumdieck 組織スライサー15と振動ミクロトーム (vibratomes)。組織スライサーは、この船の終わりに 90 ° で、PCL を切る金属容器を組織ブロックを通過してスライスを生成します。Vibratomes 振動を移動することによって PCL を生成する組織に以下のせん断力を発揮する Krumdieck スライサーに比べて冷却中お風呂に浸漬する組織の固定ブロックを水平にナイフ。栽培する前に組織の少ない過酷な治療でこの結果します。その一方で、vibratome 切断は多くの時間と作業を消費です。私たちの手でスライス有効な最大 100 PCL または 500 PCL の生産 vibratome は 1 日、最も実験的研究のために十分にパンチします。PCL は、さまざまな方法で培養することができます: (a) (b) 動的な器官培養 (DOC) として (ALI) システム、トランス-井戸空気液体インターフェイスを生成するのに添付または (c) 標準的な培養条件で細胞培養液に浸漬します。PCL の詳細には、栽培された前述の22,23,25;しかし、世界中の様々 な研究所での使用の間の栽培条件の一般的な標準はまだ不足しています。特に、培養時間は重要な可能性があります: 144 時間後、120 h22後マウス PCL のように SFTPC 2 肯定的な肺胞型細胞の損失が観察されます。加えて、代謝活性はマウス22と人間 PCL25 120 h が安定するようです。
PCL の世代のためにいくつかの技術的な制限があります: 時間とともに変動する数と、resectates のサイズ得られた組織内そのまま胸膜の存在によって決まる、充填、アガロースの効率 PCL の世代の最終的な成功を決定します。(病気) の得られた肺組織内病変による組織破壊が PCL 準備を妨げる可能性があります。気道閉塞とそのまま歯槽スペースに欠けている線維組織充填の agarose が付いて阻害して線維化組織の要求の厳しいタスクをスライスします。気腫性の組織は、COPD やアルファ 1-抗トリプシン欠損の充填、アガロースの圧力に耐える可能性がありますいない肺胞や建築工芸品の破断になりますよう病気の発見します。これらのケースで低 agarose 濃度、1% (w/v) を、などの使用量は圧力を減少させ、アガロース充填時スピード役に立つかもしれない。全体的にみて、組織の病気の状態は劇的に PCL 生成のための組織の利用を制限できます。これらすべてのパラメーターは、肺組織から生成することができる PCL の量を決定する、また、時間のかかる、PCL を生成します。さらに PCL の制限、さらに実験のための正規化の手順を必要とするサイズや組織のコンテンツに関して異なる肺のスライスの間に不整合であります。これを克服するためには、同じスライスの類似した領域の生検パンチを生成できます。この手順は、組織の変動を軽減し、追加のメリットとして実験に使用することができます PCL サンプルの数を増やす傾向があります。
結論としては、アガロースから人間の 3 D 肺組織文化いっぱい PCL 肺の生理と疾患を勉強するため複雑な人体モデルを提供します。プロトコルは肺癌組織およびその栽培から PCL の準備の詳細な説明、またひと肺切除とどのようにそれらを克服する agarose 充填での課題に対応します。

慢性および急性肺疾患は、罹患率と死亡率世界1の主要な原因です。びまん性の実質性肺疾患5肺がん4重度の喘息3閉塞性肺疾患 (COPD)2のような慢性肺疾患を持つ患者の根治的治療、現在利用できません。肺疾患の動物モデルでの研究疾患病因6の理解を深めたし、潜在的な新規治療標的7,8,9, 識別につながっているがこれらのモデルは、関連する生物学的および生理学的な違い人間10と比較して展示します。マウスおよびひと生物学と解剖学、生体 3 D 肺組織培養 ex 人間間のこれらの矛盾を克服するために (3 D-LTC) システムは、生物医学研究のさまざまな領域で使用されます。これらの 3 D LTC 培養システムは、精密カット肺のスライス (PCL) に基づいています。前のヴィヴォ PCL の世代全体肺胞や気道11、間質、血管内細胞の空間と機能の関係の調査では、3 番目の空間の次元の分析が可能と中皮。特に、ex vivo モデル PCL が多細胞、その場で肺の最も機能的な細胞が含まれていることを意味、従って細胞のネイティブの生物学的環境を密接に表す、従って限られた細胞とほとんど 2 D 細胞マトリックス相互作用を克服します。細胞培養に近づきます。今まで前のヴィヴォ マウス PCL 使用されてモデル肺疾患, COPD12, 肺線維症13、肺がん14、ウイルス感染15,16, 気管支肺異形成症17のような喘息18。しかし、臨床試験で調べたひと肺疾患における新規薬物療法のかなりの割合翻訳しないでくださいの有効性や安全性の欠如に起因する診療所に assumingly ため人間間違いをかなりまだとマウス生物学と疾患19,20,21。
数年間、人間の PCL を主化学薬品および薬剤の肺毒性を評価するために使用されています。ごく最近、ひと肺組織は、病態生理学的および薬理学的研究を追求する COPD22,23, 喘息の24、および肺線維症25、患者から使用されています。切除患者臓器材料を利用して PCL の生成を表すと器官のネイティブの細胞多様性のほとんどを維持することの複雑な 3 D 組織環境22の主要な病気の認刻極印を要約 1 つ等。また、多様な実験のセットアップで適用される病気の組織は、肝臓、腸管、腎臓26,27,28,29病様変化を模倣する示されました。
ただし、いくつかの理由のため肺組織の処理、やりがいのままです。固体組織とは異なりネイティブ肺換気なしで崩壊するがちで、下部組織の剛性を展示します。これらのプロパティは、組織のスライスを妨げます。したがって、気道やポイントの低融点アガロースと肺胞腔の充填はネイティブの肺構造を維持し、マウスおよびひと肺30の精密カット スライスに必要な剛性を提供します。研究目的のため寄付ひと肺 resectates が本来の解剖学的、遺伝的、生理学的高度多様な従って実験25を実行するとき多くの場合高い患者間の可変性を提示します。全葉または全肺植と対照をなして胸部外科による切除肺サンプルは必ずしも解剖学的セグメントに従う、したがって、特別な準備が必要。この資料では、モデル肺疾患切除肺組織、その後栽培・実験用から人間の PCL の世代の詳細かつ最適化されたプロトコルを提供します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vibratome Hyrax V50</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyrax CU 65</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vasofix Braun&#252;le 18G</td>
			<td>B. Braun Melsungen AG</td>
			<td>4268130B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30mL NORM-INJECT</td>
			<td>Henke Sass Wolf</td>
			<td>4830001000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guarded disposable scalpels, sterile</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loctite 406</td>
			<td>Henkel</td>
			<td>LOCTITE 406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic Single Crystal Sapphire</td>
			<td>Delaware Diamond Knives</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium F-12 Nutreient Mixture (Ham) + L-Glutamine + 15mM HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31330-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Special process fetal bovine serum (Sera Plus)</td>
			<td>Pan Biotech</td>
			<td>P30-3702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Biopsy Punch</td>
			<td>pfm medical</td>
			<td>48401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well, Black/Clear, Tissue Culture Treated Plate, Flat Bottom with Lid, sterile</td>
			<td>Falcon / Corning</td>
			<td>353219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose, low geling temperature</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9414-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human 3d lung tissue cultures (3d-ltcs) for disease modeling

人間の病気発見の小説の翻訳は、病気の人間組織モデルの可用性によって制限されます。精密カット肺スライス (PCL) 3 D 肺組織培養 (3 D-Ltc) をエレガントな表現として使用と関連性の高い生物学的 3 D 細胞培養モデル、非常に類似しているその複雑さ、バイオメカニクスのためその場で組織・分子組成物。組織スライスは、様々 な動物モデルで広く適用されます。人間 PCL から派生した 3 D Ltc は、メカニズムと人間の組織に薬の機能効果を理解するために役立つさらに新薬、レスポンスを分析する使用できます。PCL の肺切除を経験、患者の切除肺の組織サンプルからの準備は、病気のアクセシビリティとリンパを向上します。ここでは、切除軟弾性患者の肺組織から人間の PCL の生成のための詳しいプロトコルについて述べる.アガロースは、このように肺構造を維持し、その後スライスにとって重要である組織の硬さの増加、resectates の肺胞領域に導入されました。500 μ m の厚さのスライスを vibratome と組織ブロックから作製した.PCL から生検パンチはサンプル サイズに匹敵する組織を確保する、組織サンプルの量をさらに増やします。生成された肺組織文化は、さまざまなひと肺生物学、病態とその最高の状態で (サブ-) 細胞レベルで線維化のプロセスなど、さまざまな病気のメカニズムなどの研究に適用できます。モデル前のヴィヴォ3 D LTC の最大のメリットは 3 D の組織構造, 細胞タイプの多様性肺の解剖学と個々 の患者からのティッシュの評価の可能性についてその場で人間の肺をその近くに表現します。さらに精度の薬のための新しい戦略を開発するものです。

PCL 世代 PCL の世代は 4 つの重要なステップに分けることができる: 外科的肺組織の切除、アガロース充填、vibratome ベース PCL 生成、および PCL の文化。肺癌組織は、低融点ポイント アガロース、スライスの肺組織に必要な剛性を追加し、ネイティブの肺構造とアーキテクチャを維持でいっぱいです。注記のうち、PCL 世代は非常に時間がかかる、従ってしばしば DMEM F 12 媒体で満たされた肺組織の夜の記憶は、追加手順として含めることができる、PCL 世代が次の日に開始。次の実験のセットアップによって生成された PCL を実験条件が適用される前に 0.1% (w/v) ウシ胎児血清を含む標準的な細胞培養液中夜通し孵化することができます。3 D Ltc が実行可能な培養条件で 120 h22までこのプロトコル (図 1) に記載されているし、さらに改善及び最適化可能性があります携帯電話機能 (界面活性剤蛋白質分泌) などを展示。
アガロース充填 組織の agarose の充填、アガロースで満たされた注射器に接続されている直径 1.3 mm の末梢静脈カテーテルのカニューレは切断組織 (図 2 a) の表面で気管支に挿入されます。気管支は、肺動脈の近くによくローカライズされます。動脈は薄い壁を持っているし、崩壊する傾向がある、気管支は良い表示ルーメンを展示しました。組織の整合性によってカテーテルは肺の周囲に呼吸の木のいくつかの世代を進めることができます。イク気管支カニューレ周囲ピンセット (図 2 b) を使用して密閉.肺動脈は、同時に、ピンセットでクランプすることができます。その後、組織は持ち上げ、液体 agarose が気道にしみ込まない優しく。
カテーテルの位置によって組織の大半は液体 agarose (図 2 D) を入力できます。必要に応じて、イク気管支によって換気される肺の実質を反映する肺組織の部品のようなコーン agarose (図 2) でいっぱいになる可能性があります。両方のシナリオでしっかりと充填組織領域の特徴的なパターンを観察できる: 最初に、組織の主要な部分はウェッジ (図 2 D) で満ちているまたは第二に、徹底的に突出部ラウンド小さい塗りつぶされた組織領域表示 (図 2)。気道の部分は agarose 血栓やその他の原因による妨害する場合、組織の部品は agarose が付いて正しく塗りつぶされません可能性があります。したがって、組織の部分だけをスライスするため適用があります。Agarose の入力手順中に漏出、塗りつぶされた呼吸の木の部分が穴あきを得ると充填肺組織の取得はほぼ不可能ただし、考えられる回避策より深くより末梢の気管支を介して充填遠位気道 (図 2)、または隙間面積 (図 2 H) の潜在的なクランプにカニューレの浸透。
精密カット肺のスライス ティッシュのブロックの長さと 1 〜 1.5 cm の幅で完全に固化したアガロース(図 3 aで満ちていた組織領域から摘出-3B)。次に、個々 の組織ブロック vibratome (図 3) のティッシュ ホルダーに釘づけになっていた。500 μ m、vibratome で組織ブロックだった 3-12 μ m/s. の速度で直進に対し、厚い PCL が生成された (図 3 D-3F)。最後に、PCL は 0.1% (w/v) 牛胎児血清を含む細胞培養液中に浸漬されアウトライン手順 7 として標準的な細胞培養条件で培養しました。
培養 48 時間後の人間 3 D LTC の実験的読み出し Alsafadi ら25、前述したように、代表的な蛍光染色は、図 4 a-4 Cに表示されます。(赤) フィブロネクチンの細胞核 (DAPI、青) の前のヴィヴォ人間 3 D LTC で保存された肺胞構造のイメージングの反応。48 h は人間の線維化のような変化の結果のため、PCL がパンチ profibrotic サイトカイン カクテル (腫瘍壊死因子 α lipophosphatidyl 酸、血小板由来成長因子 AB トランスフォーミング成長因子 β 1 を含む) を持つ人間の治療3 D-Ltc。QPCR、profibrotic カクテル (図 4) と細胞外基質の線維化関連コンポーネント コラーゲン タイプ 1, フィブロネクチン遺伝子の 3 D LTC パンチで重要な誘導が認められました。さらに、蛋白質間葉系マーカー ビメンチンのレベルは 3 D LTC パンチ (図 4E) の治療後 3 のうち 4 患者の誘導を発見されました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58437/58437fig1.jpg"> 図 1: PCL 世代のワークフロー 。その組織の整合性のための肺切除腫瘍自由な区域を徹底的に検査します。組織はさらに使用に適して得点される場合 (得点は説明材料と方法のセクションで説明)、それは次に液体アガロースでいっぱいです。凝固アガロースでいっぱいティッシュのブロックは、その後、vibratome とスライスします。細胞培養液に浸漬、3 D LTC、彼らの世代の後 120 h まで培養します。3 D Ltc の下流解析を含む蛋白質または RNA の表現ライブ組織蛍光、蛍光抗体法、ティッシュの固定後染色します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58437/58437fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58437/58437fig2.jpg"> 図 2: 肺組織を充填ポイントの低融点アガロース。肺組織は、末梢静脈カテーテル肺動脈 (図 2 a) に隣接する気管支に挿入を cannulated です。ピンセットを使用するは、気管支にカニューレを修正したり、液体の agarose の漏洩を避けるために肺動脈をクランプします。42 ° C で液体アガロース 30 mL シリンジ (図 2 b) の肺組織は注がれる。充填中にカニューレの遠位位置組織量が多い (図 2 D) の充填をすることによって、近位位置決めはいっぱいティッシュ (図 2) の小さな領域が発生します。気道の異物は量を減らすことができるボリューム充填 (図 2 e) 組織の。Agarose が漏れている場合位置決めおよび/または漏出側のクランプの遠位カニューレにより肺組織(図 2 fの適切な agarose 充填-2 H)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58437/58437fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58437/58437fig3.jpg"> 図 3: 精密カット肺スライスします。アガロースで満たされた正常肺組織組織ブロックの一部を切除するために使用 (1 cm × 1.5 cm × 1 cm) とメス (図 3 a)。ティッシュ ホルダーに摘出組織ブロックを接着する次に、スケール バーが 1 cm (図 3 b) を示します。好ましくは、図 3に示すように、ティッシュ ホルダーの表面に胸膜表面の組織を接着します。500 μ m の厚さのスライスは、vibratome によって (図 3 D ・ 3 e) 組織から 10 °-15 ° の角度でサファイア ナイフでカットされます。切断手順の結果 2-3 cm3大そのまま肺スライス、スケール バー = 5 mm (図 3 f)。また、生検パンチャーを使用して直径 4 mm の小さな再現可能なパンチを生成できます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58437/58437fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58437/58437fig4.jpg"> 図 4: 実験的文化の 48 時間後の人間 3 D Ltc リードアウト。直径 4 mm の人間の 3 D LTC パンチでした (赤) はフィブロネクチンと (青) の DAPI の immunostained (図 4 a-4C)。スケール バー = 1,000 μ m図 4番組統合画像。定量的 RT-PCR によって PCL の RNA 解析 profibrotic カクテル25FN1 と COL1A1 遺伝子の有意な増加を示しています。図 4Eは、PCL は、線維化カクテル25症例の全体蛋白質 lysates のイムノブロットを表示します。患者サンプル 1、3、および 4 の要因 profibrotic 治療後、間葉系のマーカー (ビメンチン) の増加タンパク質発現を示したビメンチンと β-アクチン プローブします。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58437/58437fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>基準</td>
			<td>ポイント</td>
		</tr>
<tr>
<td>組織サンプルは、そのまま肋膜の表面。</td>
			<td>20</td>
		</tr>
<tr>
<td>組織サンプルは肉眼的にそのまま、切開、退治、破裂と歪みを欠けているようです。</td>
			<td>20</td>
		</tr>
<tr>
<td>直径の少なくとも 1 つの気管支を含む組織サンプル > 1 mm。</td>
			<td>20</td>
		</tr>
<tr>
<td>組織サンプル no または少しだけの量の血。</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>生体試料中に完全に格納されていた、無気肺の明らかな兆候を示しています。</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>組織サンプルは、最後の 4 時間以内に切除した.</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>組織サンプルは、最大直径 5 cm より大きいです。</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>合計をスコアします。</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: 肺 Agarose のスコアを入力します。その後 vibratome ベース PCL 生産のための agarose が付いて組織切除に合わせて成功率と相関する肺 Agarose 充填スコア (LAFS)。スコアは条件が組織によって満たされたのすべてのポイントにまとめています。LAFS 以上 72 上良い agarose のプロパティの入力を予測する、60 以下のスコアは組織の agarose 充填の可能性が高い障害が予測します。

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Generation of Human 3D Lung Tissue Cultures 3D-LTCs for Disease Modeling

ここでは、生物学的および生物医学研究のモデル人間の肺疾患に 3 D 肺組織文化の生成に適している患者の切除から肺癌 agarose 充填精度カット スライスの準備のためのプロトコルを提案する.

疾患モデル作製のひと 3 D 肺組織培養 (3 D-Ltc) の生成

Translation of novel discoveries to human disease is limited by the availability of human tissue-based models of disease. Precision-cut lung slices (PCLS) ...

この方法は、自然な3D構造と潜在的な治療法への主要な実験室所見の翻訳のための組成の生きているヒト組織の調査を可能にする。この技術は、個々の死亡した患者肺組織サンプルの可視化のために、外科的に切除またはヒト肺組織を植え替えることから組織培養物を特異的に生成可能にする。疾患のない肺組織は、肺疾患をモデル化する3D組織培養物として使用することができ、高い時空間分解能で早期の病態機構の解析を可能にする。切除された肺サンプルを無菌15センチメートルの培養皿とティッシュペーパーで覆われた滅菌金属トレイの培養培地の15ミリリットルに入れ、30ミリリットルの注射器に42°Cの低融点アガロースを充填します。末梢静脈カテーテルから閉塞器を取り外し、カテーテルを30ミリリットルのシリンジに取り付けます。換気組織の直径0.5~3ミリメートルの気管支を、組織の無傷の部分で識別し、できるだけ気管支にカヌラをそっと挿入します。鉗子を使用して、カヌラの周りの気管支壁を圧縮し、理想的には隣接する肺動脈を同時にクランプし、カヌラの周りの気管支を密閉し、他の追加の気道を閉塞させるために外科用クランプを使用して、アガロース漏れを防ぎます。次に、鉗子を使用して培養皿から肺組織を持ち上げ、注射器を使用してアガロースをカヌラを通して手動で送達し、毎秒0.3ミリリットル以下にする。肺組織が組織を過剰に膨らませることなく完全に満たされたら、すぐにカヌラを取り除き、気管支をクランプする。アガロース凝固を容易にするために摂氏4度で培養培地に組織を沈め、さらに気管支開口部に対してアガロース充填手順を繰り返す。次に、アガロースで満たされた肺組織切片をスライスするまで摂氏4度培地で保存する。精密切断肺スライスの場合、細胞培養皿の底部にピンセットを軽く押しても崩壊しない、肺組織内の固体アガロース充填領域を特定する。片側がまだ胸膜で覆われている固形充填領域の1〜1.5立方センチメートルブロックを物品切りし、シアノクリレート接着剤を使用して各組織ブロックの複数側をビブラートホルダーに取り付けます。長い組織ブロックを通して全体をスライスし、組織のわずか2〜3ミロメーターがスライスされていないままになるまで。鉗子を使用して、各500マイクロメートルのセクションを、栽培培地を含む12ウェルプレートの1つの井戸に移し、得られる。すべての組織が切り離されたら、各井戸から個々の10センチメートルの培養皿にサンプルを移し、4ミリメートルの生検パンチャーを精密カット肺スライスの上面に直交して配置する。次いで、パンチャーを時計回りおよび反時計回りに移動させ、肺試料の組織パンチを得る。各パンチを96ウェルプレートの個々のウェルに新鮮な細胞培養培地に入れる。すべての組織パンチが得られたら、最大5日間、細胞培養インキュベーターにプレートを置く。ヒト3D肺組織培養における免疫蛍光を用いた細胞核におけるフィブロネクチンの免疫標識は、保存された肺胞構造ex vivoのイメージングを可能にする。48時間の前繊維性サイトカインカクテルでヒト精密カット肺スライスパンチの治療は、線維症関連の細胞外マトリックス成分、コラーゲンタイプOne、およびフィブロネクチン遺伝子の有意な誘導を含むヒト肺3D組織培養における線維化のような変化をもたらす。さらに、間葉マーカービメンチンのタンパク質レベルは、3D肺組織培養パンチの治療後、4人に3人の患者で調節される。この手順に従って、定量的リアルタイムPCRによるRNA分析、またはウェスタンブロッティングによるタンパク質分析などの他の方法を、組織内でそれぞれ遺伝子およびタンパク質発現を評価するために行うことができる。開発後、この技術は、実験性肺生物学の分野での研究、肺生物学の外植、ならびにヒト組織サンプルにおける毒物学的および薬理学的研究の道を開いた。生きているヒト組織は感染する可能性があり、この手順を実行している間は、個人保護具や適切な組織貯蔵、輸送、廃棄物の取り扱いなどの予防措置を常に講じるべきであることを覚えておいてください

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