Name: myeloid innate signaling pathway regulation by malt1 paracaspase activity
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Myeloid Innate Signaling Pathway Regulation by MALT1 Paracaspase Activity at JoVE.com

ونحن نشكر السفير على تصريح (ترخيص رقم 4334770630127) استنساخ هنا الشكل 2 ألف من أونتيرينير et al. (2017).

وقد أجريت التجارب وفقا لمبادئ توجيهية ومعايير "لجنة أخلاقيات البحوث البشرية نوفارتيس".
1-إعداد خلايا الدم المحيطية وحيدات النوى (ببمكس) من المعاطف بافي البشرية
ملاحظة: تلقينا المعاطف بافي من المتطوعين صحية في يوم واحد بعد جمع، في أكياس 50 مل. كانت المقد...

<ol>
	<li>Coornaert, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+antigen+receptor+stimulation+induces+MALT1+paracaspase-mediated+cleavage+of+the+NF-kappaB+inhibitor+A20.">T cell antigen receptor stimulation induces MALT1 paracaspase-mediated cleavage of the NF-kappaB inhibitor A20.</a> Nature immunology. 9 (3), 263-271 (2008).</li><li>Rebeaud, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proteolytic+activity+of+the+paracaspase+MALT1+is+key+in+T+cell+activation.">The proteolytic activity of the paracaspase MALT1 is key in T cell activation.</a> Nature immunology. 9 (3), 272-281 (2008).</li><li>Jaworski, M., Thome, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+paracaspase+MALT1:+Biological+function+and+potential+for+therapeutic+inhibition.">The paracaspase MALT1: Biological function and potential for therapeutic inhibition.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (3), 459-473 (2016).</li><li>Meininger, I., Krappmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+signaling+and+activation+by+the+CARMA1-BCL10-MALT1+signalosome.">Lymphocyte signaling and activation by the CARMA1-BCL10-MALT1 signalosome.</a> Biological Chemistry. 397 (12), 1315-1333 (2016).</li><li>Qiao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+architecture+of+the+CARMA1/Bcl10/MALT1+signalosome:+nucleation-induced+filamentous+assembly.">Structural architecture of the CARMA1/Bcl10/MALT1 signalosome: nucleation-induced filamentous assembly.</a> Molecular cell. 51 (6), 766-779 (2013).</li><li>Gross, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Card9+controls+a+non-TLR+signalling+pathway+for+innate+anti-fungal+immunity.">Card9 controls a non-TLR signalling pathway for innate anti-fungal immunity.</a> Nature. 442 (7103), 651-656 (2006).</li><li>Chiffoleau, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-type+lectin-like+receptors+as+emerging+orchestrators+of+sterile+inflammation+represent+potential+therapeutic+targets.">C-type lectin-like receptors as emerging orchestrators of sterile inflammation represent potential therapeutic targets.</a> Frontiers in Immunology. 9 (FEB), 1-9 (2018).</li><li>Taylor, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dectin-1+is+required+for+beta-glucan+recognition+and+control+of+fungal+infection.">Dectin-1 is required for beta-glucan recognition and control of fungal infection.</a> Nature Immunology. 8 (1), 31-38 (2007).</li><li>Lanternier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+immunodeficiencies+underlying+fungal+infections.">Primary immunodeficiencies underlying fungal infections.</a> Current opinion in pediatrics. 25 (6), 736-747 (2013).</li><li>Thome, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+roles+for+MALT1+in+T-cell+activation.">Multifunctional roles for MALT1 in T-cell activation.</a> Nature reviews. Immunology. 8 (7), 495-500 (2008).</li><li>Unterreiner, A., Stoehr, N., Huppertz, C., Calzascia, T., Farady, C. J., Bornancin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+MALT1+paracaspase+inhibition+does+not+block+TNF-&#945;+production+downstream+of+TLR-4+in+myeloid+cells.">Selective MALT1 paracaspase inhibition does not block TNF-&#945; production downstream of TLR-4 in myeloid cells.</a> Immunology Letters. , 48-51 (2017).</li><li>Strasser, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syk+Kinase-Coupled+C-type+Lectin+Receptors+Engage+Protein+Kinase+C-&#x3B4;+to+Elicit+Card9+Adaptor-Mediated+Innate+Immunity.">Syk Kinase-Coupled C-type Lectin Receptors Engage Protein Kinase C-&#x3B4; to Elicit Card9 Adaptor-Mediated Innate Immunity.</a> Immunity. 36 (1), 32-42 (2012).</li><li>Jaworski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malt1+protease+inactivation+efficiently+dampens+immune+responses+but+causes+spontaneous+autoimmunity.">Malt1 protease inactivation efficiently dampens immune responses but causes spontaneous autoimmunity.</a> The EMBO journal. 33 (23), 2765-2781 (2014).</li><li>Yu, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALT1+protease+activity+is+required+for+innate+and+adaptive+immune+responses.">MALT1 protease activity is required for innate and adaptive immune responses.</a> PLoS ONE. 10 (5), 1-20 (2015).</li><li>Bardet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+T-cell+fingerprint+of+MALT1+paracaspase+revealed+by+selective+inhibition.">The T-cell fingerprint of MALT1 paracaspase revealed by selective inhibition.</a> Immunology and Cell Biology. 96 (1), 81-99 (2018).</li><li>Thoma, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+profiling+of+a+selective+and+efficacious+syk+inhibitor.">Discovery and profiling of a selective and efficacious syk inhibitor.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 58 (4), 1950-1963 (2015).</li><li>Bauer, B., Steinle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HemITAM:+A+single+tyrosine+motif+that+packs+a+punch.">HemITAM: A single tyrosine motif that packs a punch.</a> Science Signaling. 10 (508), 1-10 (2017).</li><li>Gringhuis, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+c-Rel+activation+via+Malt1+controls+anti-fungal+TH-17+immunity+by+dectin-1+and+dectin-2.">Selective c-Rel activation via Malt1 controls anti-fungal TH-17 immunity by dectin-1 and dectin-2.</a> PLoS Pathogens. 7 (1), (2011).</li><li>Dufner, A., Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell+antigen+receptor-induced+activation+of+an+IRAK4-dependent+signaling+pathway+revealed+by+a+MALT1-IRAK4+double+knockout+mouse+model.">B cell antigen receptor-induced activation of an IRAK4-dependent signaling pathway revealed by a MALT1-IRAK4 double knockout mouse model.</a> Cell Communication and Signaling. 9 (1), 6 (2011).</li><li>Phelan, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiprotein+supercomplex+controlling+oncogenic+signalling+in+lymphoma.">A multiprotein supercomplex controlling oncogenic signalling in lymphoma.</a> Nature. , (2018).</li></ol>

في هذا العمل، استخدمنا إعدادات تجريبي بسيط لدراسة مسارات إشارات في الإنسان والماوس الخلايا الفطرية، واستجواب الاعتماد على وظيفة بروتيوليتيك MALT1. التوسع في العمل السابق11، أظهرت الدراسة أن يتحكم MALT1 باراكاسباسي نشاط إنتاج سيتوكين مستقبلات يكتين مثل التي يسببها ج-نوع، بما في ذ...

نشاط باراكاسباسي MALT1 (المرتبطة بالغشاء المخاطي الأنسجة اللمفاوية سرطان الغدد الليمفاوية إزفاء بروتين 1) قد كشف في 20081،2. ومنذ ذلك الحين، سجلت عددا من الدراسات مساهمتها الحاسمة في مستضد مستقبلات الردود في الخلايا الليمفاوية. نماذج الوراثية في الماوس، فضلا عن دعم بيانات الصيدلة دوراً رئيسيا في خلايا تي تي خلية تعتمد المناعة الذاتية وفي ب-الخلية اللمفاوية إعدادات3،4. في الخلايا الليمفاوية، يحدث التنشيط باراكاسباسي MALT1 لدى الجمعية من CARD11-BCL10-MALT1 مجمع5، التي يتم تشغيلها بواسطة إشارات مستقبلات مستضد الدانية المتلقين للمعلومات من مستقبلات خلية تي أو ب. وهناك أيضا أدلة كثيرة على أن مجمع CARD9-BCL10-MALT1 مماثلة أمر مهم لنشر إشارات المصب ج-نوع يكتين مثل مستقبلات (لشانون)، مثل، ديكتين-1 وديكتين-2 مينكلي في النقوي الخلايا6،7. ديكتين-1 درست جيدا لأن هذا المسار أمر حاسم للمضيف الدفاع ضد الأمراض الفطرية8،9. بيد أن الآثار المترتبة MALT1 في الممرات الشبيهة بحصيلة مستقبلات (TLR)، ظلت مثيرة للجدل10. واستبعد الأدلة الأخيرة في الخلايا البشرية النقوي دوراً مباشرا للنشاط باراكاسباسي MALT1 في تنظيم الإنتاج تنف المصب TLR-411.
في هذا العمل، استخدمنا مختلف إعدادات التجريبية وظروف محفزة في الإنسان وخلايا النقوي الماوس لسبر مسارات الإشارات الفطرية، الاعتماد على مثبطات أداة معينة الدوائي وقياس إنتاج سيتوكين.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 &#181;m nylon cell strainer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS431752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 ml Falcon tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plates</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat-bottom plate, with low evaporation lid</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well V-bottom plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>734-1798</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride - NH4Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay diluent RD1-W ELISA</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>895038</td>
			<td>Assay diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture microplate, 384 well, black</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>781986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depleted Zymosan</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>tlrl-dzn</td>
			<td>now: tlrl-zyd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td>DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA-Na2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA muTNF-&#945;</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>SMTA00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C tubes</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS dissociator</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM-CSF</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTRF hu IL-23</td>
			<td>CisBio</td>
			<td>62HIL23PEG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTRF hu TNF-&#945;</td>
			<td>CisBio</td>
			<td>62TNFPEC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTRF reconstitution buffer</td>
			<td>CisBio</td>
			<td>62RB3RDE</td>
			<td>50mM Phosphate buffer, pH 7.0, 0.8M KF, 0.2% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-&#947;</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>L4516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-4</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>Forene</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides (LPS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4391</td>
			<td>LPS used in human samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4516</td>
			<td>LPS used in murine samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis buffer</td>
			<td>Self-made</td>
			<td>-</td>
			<td>155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 1 mM EDTA, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnet</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>18001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, 384 well white</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>784075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monocytes enrichment kit</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>19059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Mr. Frosty Cryo 1 &#176;C Freezing Container</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>cooling device (containing Propanol-2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x pH 7.4 [-] CaCl2 [-] MgCl2</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010</td>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td>Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium bicarbonate - KHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrestoBlue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A13262</td>
			<td>Resazurin solution for viability assessment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propanol-2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.09634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Read buffer</td>
			<td>MesoScale Discovery</td>
			<td>R92TC-3</td>
			<td>Tris-based buffer containing tripropylamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery cell culture freezing medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12648-010</td>
			<td>freezing medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) with Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61870</td>
			<td>+ 10% FBS for iMoDCs 
			+ 10% FBS + 1 mM Sodium Pyruvate + 100 U/mL Pen/Strep + 5 &#181;M &#946;-mercaptoethanol for human PBMCs and monocytes 
			+ 10% FBS + Pen/Strep + 5 &#181;M &#946;-mercaptoethanol for murine splenocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separation buffer</td>
			<td>Self-made</td>
			<td>-</td>
			<td>PBS pH 7.4 + 2% FBS + 1 mM EDTA pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trehalose-6,6-dibehenate</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>tlrl-tdb</td>
			<td>TDB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7949</td>
			<td>Polysorbate 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5 M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15675</td>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viewseal sealer</td>
			<td>Greiner BioOne</td>
			<td>676070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-PLEX Proinflammatory Panel 1 Human Kit</td>
			<td>MesoScale Discovery</td>
			<td>K15049D</td>
			<td>electrochemiluminescent multiplex assay (IL-1&#946;, TNF-&#945;, IL-6, IL-8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

myeloid innate signaling pathway regulation by malt1 paracaspase activity

وإلى جانب وظيفته في الخلايا اللمفاوية، وقد عالج العديد من الدراسات، باراكاسباسي MALT1 أيضا دوراً هاما في الخلايا الفطرية المصب مستقبلات التعرف على نمط. أفضل درس من أعضاء الأسرة يكتين مثل مستقبلات ج من نوع ديكتين-1 وديكتين-2 التي تحفز SYK و CARD9-تعتمد على إشارات تتالي مما يؤدي إلى تنشيط NF-κB، بطريقة تعتمد على MALT1. على النقيض من ذلك، مثل عدد القتلى مستقبلات (TLR)، مثل TLR-4، نشر التنشيط NF-κB لكن الإشارات عبر تتالي MYD88/IRAK-تعتمد على. ومع ذلك، ظلت عما إذا كان MALT1 قد تسهم في TLR-4 إشارات غير واضحة. تشير الأدلة الأخيرة مع MLT-827، مثبط قوية والانتقائي للنشاط باراكاسباسي MALT1، إلى أن إنتاج تنف المصب TLR-4 في الخلايا البشرية النقوي مستقلة عن MALT1، بدلاً من إنتاج تنف المصب ديكتين-1، وهو MALT1 يعتمد. هنا، نحن معالجة انتقائية مشاركة MALT1 في التعرف على نمط الاستشعار كذلك، باستخدام مجموعة متنوعة من الإنسان والاستعدادات الخلوية الماوس، والحث على مسارات ديكتين-1، مينكلي أو TLR-4. كما قدمنا أفكاراً إضافية باستكشاف السيتوكينات بعدها تنف-، وعن طريق مقارنة MLT 827 مثبط SYK (Cpd11) ومثبط لايك (AFN700). جماعياً، البيانات المقدمة كذلك الأدلة على MALT1-تبعية مستقبلات يكتين مثل نوع ج – يشير في المقابل إلى إشارات TLR.

في الخلايا النقوي، التبديلات MALT1 إشارات التنشيط المصب عدة مستقبلات يكتين مثل ج-نوع، مثل ديكتين-1 وديكتين-2 مينكلي6. هذه المسارات تعتمد على المستقبلات المحتوية على عزر (هيم) أيتام (مثل، ديكتين-1) أو أيتام المحتوية على فكرة مستقبلات المشارك (مثل، FcRγ، دي?...

Watch this Scientific Journal Video about Myeloid Innate Signaling Pathway Regulation by MALT1 Paracaspase Activity at JoVE.com

Myeloid Innate Signaling Pathway Regulation by MALT1 Paracaspase Activity

MALT1 ينظم الحصانة الفطرية ولكن كيف يحدث هذا وتظل غير محددة. كنا مثبط باراكاسباسي MALT1 انتقائية MLT-827 لكشف مساهمة MALT1 الفطرية مما يشير إلى المتلقين للمعلومات من مستقبلات يكتين مثل مثل عدد القتلى أو نوع ج، مما يدل على أن MALT1 وينظم إنتاج السيتوكينات النقوي، والمتلقين للمعلومات ج-نوع يكتين مثل مستقبلات، بشكل انتقائي.

تنظيم مسار الإشارات الفطرية النقوي بنشاط باراكاسباسي MALT1

Besides its function in lymphoid cells, which has been addressed by numerous studies, the paracaspase MALT1 also plays an important role in innate cells ...

لذا فإن الهدف من الطريقة في مخطوطتنا هو توفير تحليل مقارن لمسارات الإشارات في الخلايا النخاعية باستخدام أنظمة الإنسان والفأر. وهو يساعد على تحديد مسار الإشارة الذي ينطوي على المصب من مستقبلات التعرف على نمط مختارة. لذلك هذا الأسلوب هو بسيط لتنفيذ.وهو يعتمد على الاستعدادات الأولية للخلية والمركبات المرجعية التي تم التحقق منها، وهو أمر ضروري لتوضيح آليات الإشارات. وسوف يكون إثبات الإجراء راتيبا Touil و Adeline Unterreiner، على التوالي عالم والبحوث الزميلة في مجموعتنا. في غطاء تدفق لارينار تعيين زوج معقمة من مقص، واحد لتر منقار، وكيس من البلاستيك.ضع معطف بافي التي تم الحصول عليها سابقا في beaker واستخدام مقص لفتح بعناية. باستخدام ماصة 25 مم إضافة 100 مل من برنامج تلفزيوني تكملها 2 ملليمتر من EDTA. مزيج عن طريق الأنابيب ببطء صعودا وهبوطا.ثم نقل 25 مل من معطف بافي المخفف إلى ستة 50 مل أنابيب أجهزة الطرد المركزي المخروطية التي تم ملء كل مسبقا مع 15 مل من التدرج كثافة السكرييد القائمة. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب لمدة 20 دقيقة في 800 غرام مع تسارع معتدل دون كسر للسماح لفصل الخلايا على أساس كثافاتها. بعد الطرد المركزي ثلاث طبقات ستكون مرئية، بيليه تحتوي على خلايا الدم الحمراء والميقبتات، وطبقة عليا مصنوعة من البلازما، وحلقة بيضاء تحتوي على خلايا أحادية النوى الدم المحيطية.استخدام ماصة 10 مل لحصاد حلقات PBMC ونقلها إلى أنبوب 50 مل جديدة. أعلى مع برنامج تلفزيوني وEDTA. تنفيذ ثلاثة يغسل متتالية مع تقليل وقت الطرد المركزي والسرعة كما هو موضح في بروتوكول النص.بعد الغسيل النهائي ، resuspend بيليه في 25 مل من الجليد الباردة تحلل العازلة لتحلل خلايا الدم الحمراء عن طريق الضغط التناضح. احتضان الحل في درجة حرارة الغرفة حتى يصبح واضحا. ثم إضافة 25 مل من العازلة الفصل لوقف رد الفعل.جهاز طرد مركزي في 150 غرام لمدة ثماني دقائق لغسل الحل. صب قبالة مفطل وإعادة فرض بيليه مع العازلة الفصل. بعد عد الخلايا، وتمييع لهم في المتوسط الثقافة وصولا الى 12500 الخلايا في البئر.توزيع 30 مل من هذا التعليق الخلية في كل بئر من 384 لوحة جيدا. التالي إضافة 15 ميكرولتردات من أربع مرات مجمعة الحلول المركزة لكل بئر وpreincubate لوحة في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة واحدة. إذا رغبت في ذلك، إضافة إما LPS إلى التركيز النهائي من 1 نانوغرام لكل مل أو Zymosan المنضب إلى تركيز نهائي من 100 ميكروغرام لكل مل.ثم احتضان لوحة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي تأخذ 10 ميكرولترات من عظمى لقياس المستويات ألفا TNF يفرز. لبدء التخفيف التسلسلي، تمييع محلول MLT-827 للمخزون مع متوسطة للوصول إلى تركيز 8 ميكرومولار في خطوة واحدة.تنفيذ ست خطوات 1:5 تخفيف المسلسل باستخدام المتوسطة مع 0.08٪ DMSO. للتحضير لاختبارات جرعة واحدة، تمييع MLT-827، AFN700، ومجمع 11 حلول المخزون مع المتوسطة للوصول إلى تركيز 4 ميكرومولار في الذهابة واحدة. أولاً، أضف 2 مل من الماء الخالي من السموم المعقمة إلى 10 ملغ من Zymosan المنضب.دوامة هذا الحل الأسهم لتجانس ذلك. Aliquot الحل ومن ثم تخزين aliquots في 20 درجة مئوية. في هذه الدراسة PBMCs الإنسان والخلايا الطحال الماوس يتم تحفيز مع إما Zymosan المنضب، وهو ناهض Dectin-1، أو lipopolysaccharide، ناهض TL4.يتم قياس NNF ألفا الافراج في عظمى بعد 20 ساعة. في كل من البشر والفأر مقايسات المركب MLT-827 كتل انتقائية إنتاج ألفا TNF مدفوعة مسار Dectin-1 ولكن ليس من قبل مسار TLR4. في أحادية حفز مع LPS، وإنتاج ألفا TNF هو إلغاء تماما تقريبا من قبل AFN700 لكنه ليس حساسا لCpd11، وهو ما يتفق مع اعتماد مسار TLR4 على NF-كابا B النشاط وديمومة على النشاط SIC.وعلى النقيض من ذلك، فإن إنتاج TNF ألفا الذي يقوده ديكين-1 وMODCs يظهر حساسية تجاه MLT-827 وAFN700 وCpd11. ويقدم ذلك أدلة إضافية على تورط سلسلة تعاقبية لإشارات SIC CBM في مسار Dectin-1. كما أن إنتاج IL-1 بيتا و IL-6 و IL-23 حساس أيضاً للمثبطات الثلاثة، مما يشير إلى آليات تنظيمية مماثلة لـ TNF alpha.ومع ذلك، فإن التأثير المحدود الذي شوهد على إنتاج IL-8 يشير إلى أن هذا السيتوكين لديه آلية تنظيمية متميزة. رفع Trehalose-dibehenate تركيزات فوق 50 ميكروغرام لكل مل يؤدي إلى إنتاج TNF ألفا, IL-6, و IL-1 بيتا, التي تعتمد على نشاط الباركاسال1 MALT1 وفقا لتأثير منع MLT-827. وقد شوهدت نتائج مماثلة عند تحدي الـ MODCs مع زيادة تركيزات Zymosan المنضب لتحفيز ديكتين-1.جعلت هذه الطريقة من الممكن أن تظهر أن مالتكالباس paracaspase ينظم بشكل انتقائي C-نوع الليكتين مثل مستقبلات الإشارات. من الضروري استخدام مركبات مرجعية تتميز بشكل جيد. إيلاء الاهتمام لإجراء لتخفيف حلول الأسهم.وهذا أمر بالغ الأهمية للمجمع مع قابلية الذوبان المحدودة.

Research

JoVE Journal

Biology

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

ثقافة الخلايا الجذعية من الدم النخاعي السلائف نخاع العظم

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

Reaggregate Thymus Cultures

Reaggregate الثقافات الغدة الصعترية

Stromal cells within lymphoid tissues are organized into three-dimensional structures that provide a scaffold that is thought to control the migration and ...

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

إعداد 2 - dGuo المعاملة الثقافات الجهاز الغدة الصعترية

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

تشريح وتلون ذبابة الفاكهة اليرقات المبايض

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

تصور كا الأوعية الدموية 2 + اشارة سببها ريوس المشتقة نظير الصماوي

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

باستخدام SecM تسلسل توقيف كأداة لعزل البروتينية منضم ريبوسوم

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

سير عمل التصوير عالي المحتوى لدراسة Grb2 مجمعات اشارة عن طريق الاستنساخ التعبير

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

واحدة جزيء التصوير من تنظيم الجينات<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; استخدام التنشيط بواسطة Cotranslational انشقاق (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

تحفيز الميكانيكية التي يسببها الكالسيوم انتشار الموجات في الخلية monolayers: مثال من الأبقار الخلايا البطانية القرنية

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

الأيضية وصفها وغشاء التقطير للالمقارن تحليل البروتين من<em&gt; نبات الأرابيدوبسيس thaliana</em&gt; الثقافات تعليق خلية

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...