Name: myeloid innate signaling pathway regulation by malt1 paracaspase activity
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Myeloid Innate Signaling Pathway Regulation by MALT1 Paracaspase Activity at JoVE.com

Vi takker Elsevier om deres tilladelse (licensnummer 4334770630127) til at gengive her figur 2A fra Unterreiner et al. (2017).

Eksperimenter blev udført efter de retningslinjer og standarder for Novartis menneskelige forskning etiske komité.
1. forberedelse af perifert blod mononukleære celler (PBMC) fra menneskelige Buffy frakker
Bemærk: Vi fik buffy frakker fra raske frivillige en dag efter indsamling, i 50 mL poser. De blev leveret under informeret samtykke og indsamlet gennem Interregionale Blutspende Schweizeriches Rotes Kreuz. Vi håndteret dem ved hjælp a...

<ol>
	<li>Coornaert, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+antigen+receptor+stimulation+induces+MALT1+paracaspase-mediated+cleavage+of+the+NF-kappaB+inhibitor+A20.">T cell antigen receptor stimulation induces MALT1 paracaspase-mediated cleavage of the NF-kappaB inhibitor A20.</a> Nature immunology. 9 (3), 263-271 (2008).</li><li>Rebeaud, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proteolytic+activity+of+the+paracaspase+MALT1+is+key+in+T+cell+activation.">The proteolytic activity of the paracaspase MALT1 is key in T cell activation.</a> Nature immunology. 9 (3), 272-281 (2008).</li><li>Jaworski, M., Thome, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+paracaspase+MALT1:+Biological+function+and+potential+for+therapeutic+inhibition.">The paracaspase MALT1: Biological function and potential for therapeutic inhibition.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (3), 459-473 (2016).</li><li>Meininger, I., Krappmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+signaling+and+activation+by+the+CARMA1-BCL10-MALT1+signalosome.">Lymphocyte signaling and activation by the CARMA1-BCL10-MALT1 signalosome.</a> Biological Chemistry. 397 (12), 1315-1333 (2016).</li><li>Qiao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+architecture+of+the+CARMA1/Bcl10/MALT1+signalosome:+nucleation-induced+filamentous+assembly.">Structural architecture of the CARMA1/Bcl10/MALT1 signalosome: nucleation-induced filamentous assembly.</a> Molecular cell. 51 (6), 766-779 (2013).</li><li>Gross, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Card9+controls+a+non-TLR+signalling+pathway+for+innate+anti-fungal+immunity.">Card9 controls a non-TLR signalling pathway for innate anti-fungal immunity.</a> Nature. 442 (7103), 651-656 (2006).</li><li>Chiffoleau, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-type+lectin-like+receptors+as+emerging+orchestrators+of+sterile+inflammation+represent+potential+therapeutic+targets.">C-type lectin-like receptors as emerging orchestrators of sterile inflammation represent potential therapeutic targets.</a> Frontiers in Immunology. 9 (FEB), 1-9 (2018).</li><li>Taylor, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dectin-1+is+required+for+beta-glucan+recognition+and+control+of+fungal+infection.">Dectin-1 is required for beta-glucan recognition and control of fungal infection.</a> Nature Immunology. 8 (1), 31-38 (2007).</li><li>Lanternier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+immunodeficiencies+underlying+fungal+infections.">Primary immunodeficiencies underlying fungal infections.</a> Current opinion in pediatrics. 25 (6), 736-747 (2013).</li><li>Thome, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+roles+for+MALT1+in+T-cell+activation.">Multifunctional roles for MALT1 in T-cell activation.</a> Nature reviews. Immunology. 8 (7), 495-500 (2008).</li><li>Unterreiner, A., Stoehr, N., Huppertz, C., Calzascia, T., Farady, C. J., Bornancin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+MALT1+paracaspase+inhibition+does+not+block+TNF-&#945;+production+downstream+of+TLR-4+in+myeloid+cells.">Selective MALT1 paracaspase inhibition does not block TNF-&#945; production downstream of TLR-4 in myeloid cells.</a> Immunology Letters. , 48-51 (2017).</li><li>Strasser, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syk+Kinase-Coupled+C-type+Lectin+Receptors+Engage+Protein+Kinase+C-&#x3B4;+to+Elicit+Card9+Adaptor-Mediated+Innate+Immunity.">Syk Kinase-Coupled C-type Lectin Receptors Engage Protein Kinase C-&#x3B4; to Elicit Card9 Adaptor-Mediated Innate Immunity.</a> Immunity. 36 (1), 32-42 (2012).</li><li>Jaworski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malt1+protease+inactivation+efficiently+dampens+immune+responses+but+causes+spontaneous+autoimmunity.">Malt1 protease inactivation efficiently dampens immune responses but causes spontaneous autoimmunity.</a> The EMBO journal. 33 (23), 2765-2781 (2014).</li><li>Yu, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALT1+protease+activity+is+required+for+innate+and+adaptive+immune+responses.">MALT1 protease activity is required for innate and adaptive immune responses.</a> PLoS ONE. 10 (5), 1-20 (2015).</li><li>Bardet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+T-cell+fingerprint+of+MALT1+paracaspase+revealed+by+selective+inhibition.">The T-cell fingerprint of MALT1 paracaspase revealed by selective inhibition.</a> Immunology and Cell Biology. 96 (1), 81-99 (2018).</li><li>Thoma, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+profiling+of+a+selective+and+efficacious+syk+inhibitor.">Discovery and profiling of a selective and efficacious syk inhibitor.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 58 (4), 1950-1963 (2015).</li><li>Bauer, B., Steinle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HemITAM:+A+single+tyrosine+motif+that+packs+a+punch.">HemITAM: A single tyrosine motif that packs a punch.</a> Science Signaling. 10 (508), 1-10 (2017).</li><li>Gringhuis, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+c-Rel+activation+via+Malt1+controls+anti-fungal+TH-17+immunity+by+dectin-1+and+dectin-2.">Selective c-Rel activation via Malt1 controls anti-fungal TH-17 immunity by dectin-1 and dectin-2.</a> PLoS Pathogens. 7 (1), (2011).</li><li>Dufner, A., Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell+antigen+receptor-induced+activation+of+an+IRAK4-dependent+signaling+pathway+revealed+by+a+MALT1-IRAK4+double+knockout+mouse+model.">B cell antigen receptor-induced activation of an IRAK4-dependent signaling pathway revealed by a MALT1-IRAK4 double knockout mouse model.</a> Cell Communication and Signaling. 9 (1), 6 (2011).</li><li>Phelan, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiprotein+supercomplex+controlling+oncogenic+signalling+in+lymphoma.">A multiprotein supercomplex controlling oncogenic signalling in lymphoma.</a> Nature. , (2018).</li></ol>

I dette arbejde brugte vi simple eksperimentelle indstillinger til at studere signaling veje i menneskelige og mus medfødte celler, og afhøre deres afhængighed af MALT1 proteolytiske funktion. Udvide på tidligere arbejde11, viste vores undersøgelse, at MALT1 paracaspase aktivitet styrer C-type lektin-lignende receptor induceret cytokin produktion, herunder TNF-α. Derimod var TLR-4-induceret TNF-α uafhængige af MALT1 i begge arter. Kollektivt, bekræftede disse data den centrale og selektiv...

Paracaspase aktivitet af MALT1 (slimhinde-associerede lymfoide væv lymfom translokation protein 1) blev afsløret i 20081,2. Siden da, har en række undersøgelser rapporterede sin kritiske bidrag til antigen receptor svar i lymfocytter. Genetiske modeller i mus samt farmakologi data understøtter en nøglerolle i T-celler, T-celle afhængige autoimmunitet og B-celle lymfom indstillinger3,4. I lymfocytter, MALT1 paracaspase Aktivering sker ved montering af en CARD11-BCL10-MALT1 komplekse5, som er udløst af antigen-receptor proksimale signalering neden for T - eller B-celle receptoren. Der er også rigeligt med beviser for at en lignende CARD9-BCL10-MALT1-kompleks er vigtigt for formerings signaler nedstrøms af C-typen lektin-lignende receptorer (CLLR), fx, Dectin-1, Dectin-2 og MINCLE i myeloide celler6,7. Dectin-1 er blevet særligt godt undersøgt, da denne vej er kritiske for værten forsvar mod svampeinfektioner8,9. Konsekvenser af MALT1 i Toll-lignende receptor (TLR) veje, dog forblevet kontroversielle10. Seneste beviser i menneskelige myeloide celler udelukket en direkte rolle for MALT1 paracaspase aktivitet i reguleringen af TNF-produktion nedstrøms TLR-411.
I det foreliggende arbejde brugte vi forskellige eksperimentelle indstillinger og stimulerende forhold i menneskelige og mus myeloide celler for at sonde medfødte signaling veje, afhængige af bestemte farmakologisk værktøj hæmmere og måling af cytokin produktion.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 &#181;m nylon cell strainer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS431752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 ml Falcon tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plates</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat-bottom plate, with low evaporation lid</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well V-bottom plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>734-1798</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride - NH4Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay diluent RD1-W ELISA</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>895038</td>
			<td>Assay diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture microplate, 384 well, black</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>781986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depleted Zymosan</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>tlrl-dzn</td>
			<td>now: tlrl-zyd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td>DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA-Na2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA muTNF-&#945;</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>SMTA00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C tubes</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS dissociator</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM-CSF</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTRF hu IL-23</td>
			<td>CisBio</td>
			<td>62HIL23PEG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTRF hu TNF-&#945;</td>
			<td>CisBio</td>
			<td>62TNFPEC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTRF reconstitution buffer</td>
			<td>CisBio</td>
			<td>62RB3RDE</td>
			<td>50mM Phosphate buffer, pH 7.0, 0.8M KF, 0.2% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-&#947;</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>L4516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-4</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>Forene</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides (LPS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4391</td>
			<td>LPS used in human samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4516</td>
			<td>LPS used in murine samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis buffer</td>
			<td>Self-made</td>
			<td>-</td>
			<td>155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 1 mM EDTA, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnet</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>18001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, 384 well white</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>784075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monocytes enrichment kit</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>19059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Mr. Frosty Cryo 1 &#176;C Freezing Container</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>cooling device (containing Propanol-2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x pH 7.4 [-] CaCl2 [-] MgCl2</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010</td>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td>Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium bicarbonate - KHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrestoBlue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A13262</td>
			<td>Resazurin solution for viability assessment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propanol-2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.09634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Read buffer</td>
			<td>MesoScale Discovery</td>
			<td>R92TC-3</td>
			<td>Tris-based buffer containing tripropylamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery cell culture freezing medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12648-010</td>
			<td>freezing medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) with Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61870</td>
			<td>+ 10% FBS for iMoDCs 
			+ 10% FBS + 1 mM Sodium Pyruvate + 100 U/mL Pen/Strep + 5 &#181;M &#946;-mercaptoethanol for human PBMCs and monocytes 
			+ 10% FBS + Pen/Strep + 5 &#181;M &#946;-mercaptoethanol for murine splenocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separation buffer</td>
			<td>Self-made</td>
			<td>-</td>
			<td>PBS pH 7.4 + 2% FBS + 1 mM EDTA pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trehalose-6,6-dibehenate</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>tlrl-tdb</td>
			<td>TDB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7949</td>
			<td>Polysorbate 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5 M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15675</td>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viewseal sealer</td>
			<td>Greiner BioOne</td>
			<td>676070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-PLEX Proinflammatory Panel 1 Human Kit</td>
			<td>MesoScale Discovery</td>
			<td>K15049D</td>
			<td>electrochemiluminescent multiplex assay (IL-1&#946;, TNF-&#945;, IL-6, IL-8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

myeloid innate signaling pathway regulation by malt1 paracaspase activity

Udover sin funktion i lymfoide celler, som er blevet behandlet af talrige undersøgelser, spiller paracaspase MALT1 også en vigtig rolle i medfødte celler nedstrøms mønster anerkendelse receptorer. Bedst undersøgt er de Dectin-1 og Dectin-2 medlemmer af familien C-type lektin-lignende receptor, der inducerer en SYK - og CARD9-afhængige signalering cascade fører til NF-κB aktivering, på en måde, MALT1-afhængige. Af kontrast, Toll-lignende receptorer (TLR), såsom TLR-4, udbrede NF-κB aktivisering men signal via en MYD88/IRAK-afhængige cascade. Ikke desto mindre, om MALT1 kan bidrage til TLR-4 signalering er forblevet uklart. Seneste beviser med MLT-827, en potent og selektiv hæmmer af MALT1 paracaspase aktivitet, angiver, at TNF-produktion nedstrøms TLR-4 i menneskelige myeloide celler er uafhængig af MALT1, i stedet for TNF-produktion nedstrøms Dectin-1, som er MALT1 afhængige. Her, vi har behandlet den selektive inddragelse af MALT1 i mønstergenkendelse sensing yderligere, ved hjælp af en række menneskelige og mus cellulære præparater og stimulering af Dectin-1, MINCLE eller TLR-4 veje. Vi gav også yderligere indsigt ved at udforske cytokiner ud over TNF- og ved at sammenligne MLT-827 en SYK hæmmer (Cpd11) og en IKK hæmmer (AFN700). Kollektivt, de data, som yderligere bevis for MALT1-afhængighed af C-typen lektin-lignende receptor-signalering i modsætning til TLR-signalering.

I myeloide celler relæer MALT1 aktivering signaler nedstrøms af flere C-type lektin-lignende receptorer, som Dectin-1, Dectin-2 og MINCLE6. Disse veje stole på (forneden) ITAM motiv-holdige receptorer (f.eks., Dectin-1) eller ITAM motiv-holdige Co receptorer (f.eks., FcRγ, Dectin-2 og MINCLE) at rekruttere og aktivere SYK kinase (figur 1). Dette fører til aktivering af en protein kinase C isoform, nemlig PKCδ, s...

Watch this Scientific Journal Video about Myeloid Innate Signaling Pathway Regulation by MALT1 Paracaspase Activity at JoVE.com

Myeloid Innate Signaling Pathway Regulation by MALT1 Paracaspase Activity

MALT1 regulerer medfødt immunitet, men hvor dette sker fortsat er uklare. Vi brugte den selektive MALT1 paracaspase hæmmer MLT-827 for at trævle MALT1 bidrag til medfødte signalering neden for Toll-lignende eller C-type lektin-lignende receptorer, demonstrerer, at MALT1 regulerer produktionen af myeloide cytokiner, og downstream af C-typen lektin-lignende receptorer selektivt.

Myeloid medfødte Signaling Pathway regulering af MALT1 Paracaspase aktivitet

Besides its function in lymphoid cells, which has been addressed by numerous studies, the paracaspase MALT1 also plays an important role in innate cells ...

Så formålet med metoden i vores manuskript er at give sammenlignende analyse af signalveje i myeloidceller ved hjælp af menneskelige og mus systemer. Det hjælper med at definere, hvilken signalvej der er involveret nedstrøms for udvalgte mønstergenkendelsesreceptorer. Så denne metode er enkel at gennemføre.Det bygger på primære cellepræparater og validerede referenceforbindelser, hvilket er afgørende for belysningen af signalmekanismer. Demonstration af proceduren vil være Ratiba Touil og Adeline Unterreiner, henholdsvis videnskabsmand og forskning associeret i vores gruppe. I en laminar flow hætte fastsat en steril saks, en en liter bæger, og en plastikpose.Placer den tidligere opnåede buffy frakke i bægeret og brug saksen til omhyggeligt at åbne den. Ved hjælp af en 25 mm pipette tilsættes 100 ml PBS suppleret med 2 millimolar EDTA. Bland ved langsomt pipettering op og ned.Og derefter overføre 25 ml af den fortyndede buffy pels i seks 50 ml koniske centrifuge rør, der hver er blevet fyldt på forhånd med 15 ml polysaccharid baseret tæthed gradient. Centrifuge rørene i 20 minutter ved 800 g med moderat acceleration uden pause for at give mulighed for adskillelse af celler baseret på deres tætheder. Efter centrifugering vil tre lag være synlige, en pellet indeholdende røde blodlegemer og granulocytter, et øvre lag lavet af plasma, og en hvid ring, der indeholder perifere blod mononukleare celler.Brug en 10 ml pipette til at høste PBMC ringene og overføre dem til et nyt 50 ml rør. Optjret med PBS og EDTA. Udfør tre på hinanden følgende vaske med faldende centrifugeringstid og -hastighed som beskrevet i tekstprotokollen.Efter den endelige vask, resuspend pellet i 25 ml iskold lysis buffer til lyse de røde blodlegemer ved osmotisk tryk. Inkuber opløsningen ved stuetemperatur, indtil den bliver klar. Derefter tilsættes 25 ml separationsbuffer for at stoppe reaktionen.Centrifuge ved 150 g i otte minutter for at vaske opløsningen. Hæld supernatanten af og opslæmp pelletet med separationsbuffer. Efter optælling af cellerne, fortynde dem i kultur medium ned til 12, 500 celler pr brønd.30 ml af denne cellesuspension fordeles i hver brønd på en 384 brøndplade. Næste tilføje 15 mikroliter af fire gange koncentreret sammensatte opløsninger til hver brønd og preincubate pladen ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid i en time. Hvis det ønskes, tilsættes enten LPS til slutkoncentration på 1 ng pr. ml eller udtømt Zymosan til en endelig koncentration på 100 mcg pr. ml.Derefter inkubere pladen natten over ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid. Den næste dag tage 10 mikroliter af supernatant til at måle udskilles TNF alpha niveauer. For at begynde den serielle fortynding fortyndes MLT-827-stamopløsningen med medium for at nå en koncentration på 8 mikromolar på én gang.Udfør en sekstrins 1:5 seriel fortynding ved hjælp af medium med 0,08%DMSO. For at forberede sig til enkeltdosistest fortyndes MLT-827, AFN700 og sammensatte 11 stock-opløsninger med medium for at nå en koncentration på 4 mikromolar på én gang. Først tilsættes 2 ml sterilt endoksfrit vand til 10 mg forarmet Zymosan.Vortex denne bestand løsning til at homogenisere det. Aliquot løsningen og derefter gemme aliquots ved 20 grader Celsius. I denne undersøgelse humane PBMCs og mus milt celler stimuleres med enten forarmet Zymosan, en Dectin-1 agonist, eller lipopolysaccharid, en TL4 agonist.NTNF alpha frigivelse i supernatant måles efter 20 timer. I både human og mus assays MLT-827 sammensatte selektivt blokerer TNF alpha produktion drevet af Dectin-1 vej, men ikke af TLR4 vej. I monocytter stimuleret med LPS, produktion af TNF alpha er næsten helt ophævet af AFN700, men det er ikke følsom over for Cpd11, hvilket er i overensstemmelse med TLR4 pathway afhængighed af NF-kappa B aktivitet og dens uafhængighed på SIC aktivitet.I modsætning TNF alpha produktion drevet af Dectin-1 og MODCs viser følsomhed over for MLT-827, AFN700, og Cpd11. Dette giver yderligere dokumentation for inddragelse af en SIC CBM signalering kaskade i Dectin-1 vej. Produktion af IL-1 beta, IL-6 og IL-23 er også følsom over for de tre inhibitorer, hvilket indikerer regulerende mekanismer svarende til TNF alpha.Den begrænsede virkning, der ses på produktionen af IL-8, tyder imidlertid på, at dette cytokin har en særskilt reguleringsmekanisme. Koncentrationen af Trehalose-dibehenate på over 50 mcg pr. ml fører til produktion af TNF alpha, IL-6 og IL-1 beta, som var baseret på MALT1 paracaspase-aktivitet i henhold til blokeringseffekten af MLT-827. Lignende resultater blev set, når udfordrende MODCs med stigende koncentrationer af udtømte Zymosan at stimulere Dectin-1.Denne metode gjorde det muligt at vise, at paracaspase MALT1 selektivt regulerer C-type lectin-lignende receptor signalering. Det er vigtigt at bruge vel karakteriserede referenceforbindelser. Vær opmærksom på proceduren for fortynding af stamopløsninger.Dette er afgørende for sammensatte med begrænset opløselighed.

Research

JoVE Journal

Biology

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

Reaggregate Thymus Cultures

Stromal cells within lymphoid tissues are organized into three-dimensional structures that provide a scaffold that is thought to control the migration and ...

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Visualisering af Vascular Ca 2 + Signaling Triggered ved Paracrine Afledte ROS

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Brug SecM Arrest Sequence som et redskab til at isolere ribo bundne polypeptider

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

Et højt indhold Imaging Workflow til Uddannelse Grb2 signalering Komplekser ved ekspressionskloning

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

Single-molekyle Imaging af genregulering<em&gt; In vivo</em&gt; Brug Cotranslational Aktivering ved spaltning (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Mekanisk Stimulation-induceret Calcium bølgeudbredelse i cellemonolag: eksempel med Bovin hornhindeendothelceller

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabolisk mærkning og membranfraktionering for Komparativ proteomiske analyse af<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...