Name: myeloid innate signaling pathway regulation by malt1 paracaspase activity
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Myeloid Innate Signaling Pathway Regulation by MALT1 Paracaspase Activity at JoVE.com

Nous remercions Elsevier pour leur autorisation (numéro de licence 4334770630127) reproduire ici la Figure 2 a de Unterreiner et al. (2017).

Des expériences ont été menées selon les lignes directrices et les normes de la Novartis Human Research Ethics Committee.
1. préparation des cellules mononucléaires de sang périphérique (PBMC) de manteaux Buffy humaine
Remarque : Nous avons reçu buffy manteaux de volontaires sains, un jour après le prélèvement, dans des sacs de 50 mL. Ils ont été fournis en vertu du consentement éclairé et recueillies par le biais de l' Interregio...

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	<li>Coornaert, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+antigen+receptor+stimulation+induces+MALT1+paracaspase-mediated+cleavage+of+the+NF-kappaB+inhibitor+A20.">T cell antigen receptor stimulation induces MALT1 paracaspase-mediated cleavage of the NF-kappaB inhibitor A20.</a> Nature immunology. 9 (3), 263-271 (2008).</li><li>Rebeaud, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proteolytic+activity+of+the+paracaspase+MALT1+is+key+in+T+cell+activation.">The proteolytic activity of the paracaspase MALT1 is key in T cell activation.</a> Nature immunology. 9 (3), 272-281 (2008).</li><li>Jaworski, M., Thome, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+paracaspase+MALT1:+Biological+function+and+potential+for+therapeutic+inhibition.">The paracaspase MALT1: Biological function and potential for therapeutic inhibition.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (3), 459-473 (2016).</li><li>Meininger, I., Krappmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+signaling+and+activation+by+the+CARMA1-BCL10-MALT1+signalosome.">Lymphocyte signaling and activation by the CARMA1-BCL10-MALT1 signalosome.</a> Biological Chemistry. 397 (12), 1315-1333 (2016).</li><li>Qiao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+architecture+of+the+CARMA1/Bcl10/MALT1+signalosome:+nucleation-induced+filamentous+assembly.">Structural architecture of the CARMA1/Bcl10/MALT1 signalosome: nucleation-induced filamentous assembly.</a> Molecular cell. 51 (6), 766-779 (2013).</li><li>Gross, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Card9+controls+a+non-TLR+signalling+pathway+for+innate+anti-fungal+immunity.">Card9 controls a non-TLR signalling pathway for innate anti-fungal immunity.</a> Nature. 442 (7103), 651-656 (2006).</li><li>Chiffoleau, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-type+lectin-like+receptors+as+emerging+orchestrators+of+sterile+inflammation+represent+potential+therapeutic+targets.">C-type lectin-like receptors as emerging orchestrators of sterile inflammation represent potential therapeutic targets.</a> Frontiers in Immunology. 9 (FEB), 1-9 (2018).</li><li>Taylor, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dectin-1+is+required+for+beta-glucan+recognition+and+control+of+fungal+infection.">Dectin-1 is required for beta-glucan recognition and control of fungal infection.</a> Nature Immunology. 8 (1), 31-38 (2007).</li><li>Lanternier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+immunodeficiencies+underlying+fungal+infections.">Primary immunodeficiencies underlying fungal infections.</a> Current opinion in pediatrics. 25 (6), 736-747 (2013).</li><li>Thome, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+roles+for+MALT1+in+T-cell+activation.">Multifunctional roles for MALT1 in T-cell activation.</a> Nature reviews. Immunology. 8 (7), 495-500 (2008).</li><li>Unterreiner, A., Stoehr, N., Huppertz, C., Calzascia, T., Farady, C. J., Bornancin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+MALT1+paracaspase+inhibition+does+not+block+TNF-&#945;+production+downstream+of+TLR-4+in+myeloid+cells.">Selective MALT1 paracaspase inhibition does not block TNF-&#945; production downstream of TLR-4 in myeloid cells.</a> Immunology Letters. , 48-51 (2017).</li><li>Strasser, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syk+Kinase-Coupled+C-type+Lectin+Receptors+Engage+Protein+Kinase+C-&#x3B4;+to+Elicit+Card9+Adaptor-Mediated+Innate+Immunity.">Syk Kinase-Coupled C-type Lectin Receptors Engage Protein Kinase C-&#x3B4; to Elicit Card9 Adaptor-Mediated Innate Immunity.</a> Immunity. 36 (1), 32-42 (2012).</li><li>Jaworski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malt1+protease+inactivation+efficiently+dampens+immune+responses+but+causes+spontaneous+autoimmunity.">Malt1 protease inactivation efficiently dampens immune responses but causes spontaneous autoimmunity.</a> The EMBO journal. 33 (23), 2765-2781 (2014).</li><li>Yu, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALT1+protease+activity+is+required+for+innate+and+adaptive+immune+responses.">MALT1 protease activity is required for innate and adaptive immune responses.</a> PLoS ONE. 10 (5), 1-20 (2015).</li><li>Bardet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+T-cell+fingerprint+of+MALT1+paracaspase+revealed+by+selective+inhibition.">The T-cell fingerprint of MALT1 paracaspase revealed by selective inhibition.</a> Immunology and Cell Biology. 96 (1), 81-99 (2018).</li><li>Thoma, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+profiling+of+a+selective+and+efficacious+syk+inhibitor.">Discovery and profiling of a selective and efficacious syk inhibitor.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 58 (4), 1950-1963 (2015).</li><li>Bauer, B., Steinle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HemITAM:+A+single+tyrosine+motif+that+packs+a+punch.">HemITAM: A single tyrosine motif that packs a punch.</a> Science Signaling. 10 (508), 1-10 (2017).</li><li>Gringhuis, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+c-Rel+activation+via+Malt1+controls+anti-fungal+TH-17+immunity+by+dectin-1+and+dectin-2.">Selective c-Rel activation via Malt1 controls anti-fungal TH-17 immunity by dectin-1 and dectin-2.</a> PLoS Pathogens. 7 (1), (2011).</li><li>Dufner, A., Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell+antigen+receptor-induced+activation+of+an+IRAK4-dependent+signaling+pathway+revealed+by+a+MALT1-IRAK4+double+knockout+mouse+model.">B cell antigen receptor-induced activation of an IRAK4-dependent signaling pathway revealed by a MALT1-IRAK4 double knockout mouse model.</a> Cell Communication and Signaling. 9 (1), 6 (2011).</li><li>Phelan, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiprotein+supercomplex+controlling+oncogenic+signalling+in+lymphoma.">A multiprotein supercomplex controlling oncogenic signalling in lymphoma.</a> Nature. , (2018).</li></ol>

Dans ce travail, nous avons utilisé les paramètres expérimentaux simples pour étudier les voies de signalisation chez les humains et les cellules de souris innée et interroger leur dépendance sur la MALT1 fonction protéolytique. Élargissant le précédent travail11, notre étude a montré que la MALT1 paracaspase activité contrôle type C type lectine récepteurs induit la production de cytokines, dont le TNF-α. En revanche, les TLR 4-induite par le TNF-α est indépendante de la MALT1 c...

L’activité paracaspase de la MALT1 (protéine de translocation du tissu lymphoïde associé aux muqueuses lymphome 1) a été révélé en 20081,2. Depuis lors, un certain nombre d’études ont signalé sa contribution essentielle aux réponses du récepteur antigène dans les lymphocytes. Modèles génétiques chez la souris ainsie que les données pharmacologiques appuient un rôle clé dans les cellules de T, en auto-immunité dépendante de lymphocytes T et B-cell lymphoma paramètres3,4. Dans les lymphocytes, MALT1 paracaspase activation se produit lors de l’Assemblée d’un CARD11-BCL10-MALT1 complexe5, qui est déclenchée par le récepteur d’antigène-signalisation proximale en aval du récepteur T - ou B-cellule. Il y a aussi amplement prouvé qu’un complexe CARD9-BCL10-MALT1 semblable est important pour la propagation des signaux en aval des récepteurs de type lectine de type C (m.), par exemple, Dectin-1, 2-Dectin et MINCLE dans myéloïde cellules6,7. Dectin-1 a été particulièrement bien étudié car cette voie est critique pour la défense de l’hôte contre les infections fongiques8,9. Implication de la MALT1 dans les voies du récepteur Toll-like (TLR), cependant, est resté controversé10. Des preuves récentes dans les cellules myéloïdes humaines exclue un rôle direct pour l’activité paracaspase MALT1 dans la régulation du TNF-production en aval de TLR-411.
Dans le présent travail, nous avons utilisé divers paramètres expérimentaux, stimulateurs conditions chez les humains et les cellules myéloïdes souris pour sonder les voies de signalisation innées, en s’appuyant sur les inhibiteurs de l’outil pharmacologique spécifique et la mesure de la production de cytokines.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 &#181;m nylon cell strainer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS431752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 ml Falcon tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plates</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat-bottom plate, with low evaporation lid</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well V-bottom plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>734-1798</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride - NH4Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay diluent RD1-W ELISA</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>895038</td>
			<td>Assay diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture microplate, 384 well, black</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>781986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depleted Zymosan</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>tlrl-dzn</td>
			<td>now: tlrl-zyd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td>DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA-Na2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA muTNF-&#945;</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>SMTA00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C tubes</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS dissociator</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM-CSF</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTRF hu IL-23</td>
			<td>CisBio</td>
			<td>62HIL23PEG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTRF hu TNF-&#945;</td>
			<td>CisBio</td>
			<td>62TNFPEC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTRF reconstitution buffer</td>
			<td>CisBio</td>
			<td>62RB3RDE</td>
			<td>50mM Phosphate buffer, pH 7.0, 0.8M KF, 0.2% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-&#947;</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>L4516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-4</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>Forene</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides (LPS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4391</td>
			<td>LPS used in human samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4516</td>
			<td>LPS used in murine samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis buffer</td>
			<td>Self-made</td>
			<td>-</td>
			<td>155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 1 mM EDTA, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnet</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>18001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, 384 well white</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>784075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monocytes enrichment kit</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>19059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Mr. Frosty Cryo 1 &#176;C Freezing Container</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>cooling device (containing Propanol-2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x pH 7.4 [-] CaCl2 [-] MgCl2</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010</td>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td>Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium bicarbonate - KHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrestoBlue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A13262</td>
			<td>Resazurin solution for viability assessment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propanol-2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.09634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Read buffer</td>
			<td>MesoScale Discovery</td>
			<td>R92TC-3</td>
			<td>Tris-based buffer containing tripropylamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery cell culture freezing medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12648-010</td>
			<td>freezing medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) with Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61870</td>
			<td>+ 10% FBS for iMoDCs 
			+ 10% FBS + 1 mM Sodium Pyruvate + 100 U/mL Pen/Strep + 5 &#181;M &#946;-mercaptoethanol for human PBMCs and monocytes 
			+ 10% FBS + Pen/Strep + 5 &#181;M &#946;-mercaptoethanol for murine splenocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separation buffer</td>
			<td>Self-made</td>
			<td>-</td>
			<td>PBS pH 7.4 + 2% FBS + 1 mM EDTA pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trehalose-6,6-dibehenate</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>tlrl-tdb</td>
			<td>TDB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7949</td>
			<td>Polysorbate 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5 M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15675</td>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viewseal sealer</td>
			<td>Greiner BioOne</td>
			<td>676070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-PLEX Proinflammatory Panel 1 Human Kit</td>
			<td>MesoScale Discovery</td>
			<td>K15049D</td>
			<td>electrochemiluminescent multiplex assay (IL-1&#946;, TNF-&#945;, IL-6, IL-8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

myeloid innate signaling pathway regulation by malt1 paracaspase activity

En plus de sa fonction dans les cellules lymphoïdes, qui a été traitée par de nombreuses études, la paracaspase MALT1 joue également un rôle important dans les cellules innées en aval des récepteurs de reconnaissance de modèle. Mieux étudiés sont les membres de la famille des récepteurs de type lectine de type C Dectin-1 et Dectin-2 qui induisent une fonction SYK et CARD9 signalisation cascade conduisant à l’activation de NF-κB, d’une manière MALT1-dépendante. Par contre, les récepteurs Toll-like (TLR), tels que le TLR-4, propager l’activation de NF-κB, mais le signal via une cascade de MYD88/IRAK-dépendante. Néanmoins, si MALT1 pourrait contribuer à la signalisation TLR-4 est restée incertaine. Des preuves récentes MLT-827, un inhibiteur puissant et sélectif de la MALT1 paracaspase activité, indiquent que TNF-production en aval du TLR-4 dans les cellules myéloïdes humains est indépendante de la MALT1, par opposition à la production de TNF en aval du Dectin-1, qui est MALT1 dépendant. Ici, nous avons abordé la participation sélective des MALT1 en reconnaissance des formes de détection plus loin, en utilisant une variété de préparations cellulaires de souris de l’homme et la stimulation des voies Dectin-1, MINCLE ou TLR-4. Nous avons également fourni des perspicacités supplémentaires en explorant les cytokines au-delà de TNF-et en comparant les MLT-827 à un inhibiteur SYK (Cpd11) et d’un inhibiteur de l’IKK (AFN700). Collectivement, les données fournies preuves supplémentaires pour la MALT1-dépendance du récepteur de type lectine de type C — signalisation en revanche à la signalisation TLR.

Dans les cellules myéloïdes, MALT1 relaie les signaux d’activation en aval de plusieurs récepteurs de type lectine de type C, tels que Dectin-1, 2-Dectin et MINCLE6. Ces voies s’appuient sur les récepteurs contenant du motif (hem) ITAM (p. ex., Dectin-1) ou corécepteurs contenant du motif ITAM (p. ex., FcRγ, pour Dectin-2 et MINCLE) qui recrutent et activer la kinase SYK (Figure 1). Cela conduit à l’activ...

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Myeloid Innate Signaling Pathway Regulation by MALT1 Paracaspase Activity

MALT1 régule l’immunité innée, mais comment dans ce cas reste mal défini. Nous avons utilisé l’inhibiteur sélectif du paracaspase MALT1 MLT-827 à démêler la contribution de MALT1 innée de signalisation en aval des récepteurs Toll-like ou type C de type lectine, démontrant que la MALT1 régule la production de cytokines myéloïde et en aval des récepteurs de type lectine de type C, sélectivement.

Règlement de voie signalisation innée myéloïde par MALT1 Paracaspase activité

Besides its function in lymphoid cells, which has been addressed by numerous studies, the paracaspase MALT1 also plays an important role in innate cells ...

Ainsi, le but de la méthode dans notre manuscrit est de fournir une analyse comparative des voies de signalisation dans les cellules myéloïdes à l’aide de systèmes humains et muraux. Il aide à définir quelle voie de signalisation est impliquée en aval de certains récepteurs de reconnaissance de motifs. Cette méthode est donc simple à mettre en œuvre.Il s’appuie sur les préparations cellulaires primaires et les composés de référence validés, ce qui est essentiel pour l’élucidation des mécanismes de signalisation. Ratiba Touil et Adeline Unterreiner, respectivement scientifique et associée de recherche dans notre groupe, démontreront la procédure. Dans une hotte d’écoulement laminaire mis en place une paire stérile de ciseaux, un bécher d’un litre, et un sac en plastique.Placez le pelage bouffi précédemment obtenu dans le bécher et utilisez les ciseaux pour l’ouvrir soigneusement. À l’aide d’une pipette de 25 mm, ajouter 100 ml de PBS complétés par 2 millimolaires d’EDTA. Mélanger en pipetting lentement de haut en bas.Et puis transférer 25 ml de la couche buffy diluée en six tubes de centrifugeuse conique de 50 ml qui ont chacun été précalillés avec 15 ml de gradient de densité à base de polysaccharide. Centrifugeuse les tubes pendant 20 minutes à 800 g avec accélération modérée sans rupture pour permettre la séparation des cellules en fonction de leur densité. Après centrifugation, trois couches seront visibles, une pastille contenant des globules rouges et des granulocytes, une couche supérieure en plasma et un anneau blanc contenant des cellules mononucléaires périphériques du sang.Utilisez une pipette de 10 ml pour récolter les anneaux PBMC et les transférer dans un nouveau tube de 50 ml. Rechargez-le avec PBS et EDTA. Effectuez trois lavages successifs avec une diminution du temps et de la vitesse de centrifugation, comme le décrit le protocole texte.Après le lavage final, resuspendez la pastille dans 25 ml de tampon de lyse glacée pour lyser les globules rouges par pression osmotique. Incuber la solution à température ambiante jusqu’à ce qu’elle devienne claire. Ajouter ensuite 25 ml de tampon de séparation pour arrêter la réaction.Centrifugeuse à 150 g pendant huit minutes pour laver la solution. Versez le supernatant et resuspendez la pastille avec le tampon de séparation. Après avoir compté les cellules, diluer dans le milieu de la culture jusqu’à 12 500 cellules par puits.Répartir 30 ml de cette suspension cellulaire dans chaque puits d’une plaque de puits de 384. Ajoutez ensuite 15 microlitres de quatre solutions composées concentrées à chaque puits et préincubez la plaque à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant une heure. Si désiré, ajouter le LPS à la concentration finale de 1 ng par ml ou le Zymosan épuisé à une concentration finale de 100 mcg par ml.Puis incuber la plaque pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Le lendemain, prenez 10 microlitres du supernatant pour mesurer les niveaux alpha TNF sécrétés. Pour commencer la dilution en série, diluer la solution de stock MLT-827 avec moyen pour atteindre une concentration de 8 micromolaires en une seule fois.Effectuez une dilution en série en six étapes 1:5 à l’aide d’un support avec 0,08% DMSO. Pour se préparer aux tests à dose unique, diluer le MLT-827, l’APN700 et composé 11 solutions de stock avec moyen pour atteindre une concentration de 4 micromolaires en une seule fois. Tout d’abord, ajouter 2 ml d’eau stérile sans endotoxine à 10 mg de zymosan appauvri.Vortex cette solution de stock pour l’homogénéiser. Aliquot la solution, puis stocker les aliquots à 20 degrés Celsius. Dans cette étude, les PBMCs humains et les cellules de la rate de souris sont stimulés soit avec zymosan épuisé, agoniste de déctine-1, soit lipopolysaccharide, agoniste TL4.La libération alpha NTNF dans le surnatant est mesurée après 20 heures. Dans les analyses humaines et souris, le composé MLT-827 bloque sélectivement la production alpha du TNF entraînée par la voie Dectin-1, mais pas par la voie TLR4. Chez les monocytes stimulés par le LPS, la production d’alpha TNF est presque entièrement abrogée par l’APN700, mais elle n’est pas sensible au Cpd11, ce qui est compatible avec la dépendance de la voie TLR4 à l’activité du NF-kappa B et son indépendance sur l’activité du SIC.En revanche, la production alpha de TNF entraînée par Dectin-1 et les MODCs montre une sensibilité au MLT-827, à l’AFN700 et au Cpd11. Cela fournit d’autres preuves de la participation d’une cascade de signalisation CBM de la SIC dans la voie Dectin-1. La production d’IL-1 bêta, IL-6 et IL-23 est également sensible aux trois inhibiteurs, indiquant des mécanismes réglementaires similaires à TNF alpha.Cependant, l’effet limité observé sur la production d’IL-8 suggère que cette cytokine a un mécanisme réglementaire distinct. L’augmentation des concentrations de Tréhalose-dibehenate au-dessus de 50 mcg par ml conduit à la production de bêta TNF alpha, IL-6 et IL-1, qui s’est appuyée sur l’activité malt1 paracaspase selon l’effet de blocage du MLT-827. Des résultats similaires ont été observés lors de la remise en question des MODCs avec des concentrations croissantes de Zymosan épuisé pour stimuler Dectin-1.Cette méthode a permis de montrer que la paracaspase MALT1 régule sélectivement la signalisation des récepteurs de type C. Il est essentiel d’utiliser des composés de référence bien caractérisés. Faites attention à la procédure de dilution des solutions de stock.Ceci est essentiel pour le composé avec une solubilité limitée.

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