Name: myeloid innate signaling pathway regulation by malt1 paracaspase activity
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Myeloid Innate Signaling Pathway Regulation by MALT1 Paracaspase Activity at JoVE.com

אנו מודים Elsevier לאישור שלהם (רשיון מס ' 4334770630127) להתרבות כאן איור 2A מ. Unterreiner et al. (2017).

הניסויים נערכו על פי קווים מנחים סטנדרטים של ועדת האתיקה נוברטיס מחקר אנושי.
1. הכנת תאי תאי דם היקפיים (PBMCs) מן האדם מעילים באפי
הערה: קיבלנו מעילים באפי מתנדבים בריאים יום לאחר אוסף, בשקיות 50 מ. הם היו בתנאי מדעת, הנאסף דרך Interregionale Blutspende Schweizeriches Rotes Kreu...

<ol>
	<li>Coornaert, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+antigen+receptor+stimulation+induces+MALT1+paracaspase-mediated+cleavage+of+the+NF-kappaB+inhibitor+A20.">T cell antigen receptor stimulation induces MALT1 paracaspase-mediated cleavage of the NF-kappaB inhibitor A20.</a> Nature immunology. 9 (3), 263-271 (2008).</li><li>Rebeaud, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proteolytic+activity+of+the+paracaspase+MALT1+is+key+in+T+cell+activation.">The proteolytic activity of the paracaspase MALT1 is key in T cell activation.</a> Nature immunology. 9 (3), 272-281 (2008).</li><li>Jaworski, M., Thome, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+paracaspase+MALT1:+Biological+function+and+potential+for+therapeutic+inhibition.">The paracaspase MALT1: Biological function and potential for therapeutic inhibition.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (3), 459-473 (2016).</li><li>Meininger, I., Krappmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+signaling+and+activation+by+the+CARMA1-BCL10-MALT1+signalosome.">Lymphocyte signaling and activation by the CARMA1-BCL10-MALT1 signalosome.</a> Biological Chemistry. 397 (12), 1315-1333 (2016).</li><li>Qiao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+architecture+of+the+CARMA1/Bcl10/MALT1+signalosome:+nucleation-induced+filamentous+assembly.">Structural architecture of the CARMA1/Bcl10/MALT1 signalosome: nucleation-induced filamentous assembly.</a> Molecular cell. 51 (6), 766-779 (2013).</li><li>Gross, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Card9+controls+a+non-TLR+signalling+pathway+for+innate+anti-fungal+immunity.">Card9 controls a non-TLR signalling pathway for innate anti-fungal immunity.</a> Nature. 442 (7103), 651-656 (2006).</li><li>Chiffoleau, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-type+lectin-like+receptors+as+emerging+orchestrators+of+sterile+inflammation+represent+potential+therapeutic+targets.">C-type lectin-like receptors as emerging orchestrators of sterile inflammation represent potential therapeutic targets.</a> Frontiers in Immunology. 9 (FEB), 1-9 (2018).</li><li>Taylor, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dectin-1+is+required+for+beta-glucan+recognition+and+control+of+fungal+infection.">Dectin-1 is required for beta-glucan recognition and control of fungal infection.</a> Nature Immunology. 8 (1), 31-38 (2007).</li><li>Lanternier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+immunodeficiencies+underlying+fungal+infections.">Primary immunodeficiencies underlying fungal infections.</a> Current opinion in pediatrics. 25 (6), 736-747 (2013).</li><li>Thome, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+roles+for+MALT1+in+T-cell+activation.">Multifunctional roles for MALT1 in T-cell activation.</a> Nature reviews. Immunology. 8 (7), 495-500 (2008).</li><li>Unterreiner, A., Stoehr, N., Huppertz, C., Calzascia, T., Farady, C. J., Bornancin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+MALT1+paracaspase+inhibition+does+not+block+TNF-&#945;+production+downstream+of+TLR-4+in+myeloid+cells.">Selective MALT1 paracaspase inhibition does not block TNF-&#945; production downstream of TLR-4 in myeloid cells.</a> Immunology Letters. , 48-51 (2017).</li><li>Strasser, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syk+Kinase-Coupled+C-type+Lectin+Receptors+Engage+Protein+Kinase+C-&#x3B4;+to+Elicit+Card9+Adaptor-Mediated+Innate+Immunity.">Syk Kinase-Coupled C-type Lectin Receptors Engage Protein Kinase C-&#x3B4; to Elicit Card9 Adaptor-Mediated Innate Immunity.</a> Immunity. 36 (1), 32-42 (2012).</li><li>Jaworski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malt1+protease+inactivation+efficiently+dampens+immune+responses+but+causes+spontaneous+autoimmunity.">Malt1 protease inactivation efficiently dampens immune responses but causes spontaneous autoimmunity.</a> The EMBO journal. 33 (23), 2765-2781 (2014).</li><li>Yu, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALT1+protease+activity+is+required+for+innate+and+adaptive+immune+responses.">MALT1 protease activity is required for innate and adaptive immune responses.</a> PLoS ONE. 10 (5), 1-20 (2015).</li><li>Bardet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+T-cell+fingerprint+of+MALT1+paracaspase+revealed+by+selective+inhibition.">The T-cell fingerprint of MALT1 paracaspase revealed by selective inhibition.</a> Immunology and Cell Biology. 96 (1), 81-99 (2018).</li><li>Thoma, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+profiling+of+a+selective+and+efficacious+syk+inhibitor.">Discovery and profiling of a selective and efficacious syk inhibitor.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 58 (4), 1950-1963 (2015).</li><li>Bauer, B., Steinle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HemITAM:+A+single+tyrosine+motif+that+packs+a+punch.">HemITAM: A single tyrosine motif that packs a punch.</a> Science Signaling. 10 (508), 1-10 (2017).</li><li>Gringhuis, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+c-Rel+activation+via+Malt1+controls+anti-fungal+TH-17+immunity+by+dectin-1+and+dectin-2.">Selective c-Rel activation via Malt1 controls anti-fungal TH-17 immunity by dectin-1 and dectin-2.</a> PLoS Pathogens. 7 (1), (2011).</li><li>Dufner, A., Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell+antigen+receptor-induced+activation+of+an+IRAK4-dependent+signaling+pathway+revealed+by+a+MALT1-IRAK4+double+knockout+mouse+model.">B cell antigen receptor-induced activation of an IRAK4-dependent signaling pathway revealed by a MALT1-IRAK4 double knockout mouse model.</a> Cell Communication and Signaling. 9 (1), 6 (2011).</li><li>Phelan, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiprotein+supercomplex+controlling+oncogenic+signalling+in+lymphoma.">A multiprotein supercomplex controlling oncogenic signalling in lymphoma.</a> Nature. , (2018).</li></ol>

בעבודה זו, היינו הגדרות ניסיוני פשוטה ללמוד איתות המסלולים-אנוש ותאים מולדת העכבר, ולחקור את התלות פונקציית הפרוטאוליטי MALT1. הרחבת העבודה הקודמת11, המחקר שלנו הראה כי MALT1 paracaspase פעילות פקדי C-type קולטן דמוי לקטין בהשפעת ציטוקינים הייצור, כולל TNF-α. לעומת זאת, TNF-α TLR-4-induced היה עצמאי ש...

הפעילות paracaspase של MALT1 (רירית הקשורים רקמת הלימפה לימפומה רוברטסונית חלבון 1) התגלה ב 20081,2. מאז, מספר מחקרים דיווחו על תרומתה קריטי אנטיגן קולטן תגובות לימפוציטים. דגמים גנטיים העכבר כמו גם נתונים פרמקולוגיה תמיכה תפקיד מפתח בתאי T, T-cell התלויים מחלת חיסון עצמי, B-cell לימפומה הגדרות3,4. לימפוציטים, הפעלת paracaspase MALT1 חל על הרכבה של CARD11-BCL10-MALT1 מורכבים5, אשר מופעלת על ידי אנטיגן קולטן proximal איתות במורד הזרם של הקולטן T - או B-cell. יש גם ראיות המלמדות כי מתחם CARD9-BCL10-MALT1 דומה חשוב להפצת אותות במורד הזרם של קולטני לקטין דמוי C-type (הר ר), למשל, Dectin-1, Dectin-2 ו- MINCLE ב מיאלואידית תאים6,7. Dectin-1 נחקרה היטב כי מסלול זה הוא קריטי עבור המארח הגנה מפני זיהומים פטרייתיים8,9. המשמעות של MALT1 במשעולים קולטן דמוי-אגרה (TLR), עם זאת, נותרה במחלוקת10. הראיות זה התבצעה בתאי מיאלואידית אדם לשלול תפקיד ישיר לפעילות paracaspase MALT1 בוויסות של TNF-ייצור במורד הזרם של TLR-411.
בשנת העבודה הנוכחית, השתמשנו שונים הגדרות ניסיוני מופחתים בן אנוש וכל התנאים התאים מיאלואידית העכבר כדי לחקור מולדת איתות המסלולים, להסתמך על כלי תרופתי מסוים מעכבי ומדידה של ייצור ציטוקינים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 &#181;m nylon cell strainer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS431752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 ml Falcon tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plates</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat-bottom plate, with low evaporation lid</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well V-bottom plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>734-1798</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride - NH4Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay diluent RD1-W ELISA</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>895038</td>
			<td>Assay diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture microplate, 384 well, black</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>781986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depleted Zymosan</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>tlrl-dzn</td>
			<td>now: tlrl-zyd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td>DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA-Na2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA muTNF-&#945;</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>SMTA00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C tubes</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS dissociator</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM-CSF</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTRF hu IL-23</td>
			<td>CisBio</td>
			<td>62HIL23PEG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTRF hu TNF-&#945;</td>
			<td>CisBio</td>
			<td>62TNFPEC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTRF reconstitution buffer</td>
			<td>CisBio</td>
			<td>62RB3RDE</td>
			<td>50mM Phosphate buffer, pH 7.0, 0.8M KF, 0.2% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-&#947;</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>L4516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-4</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>Forene</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides (LPS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4391</td>
			<td>LPS used in human samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4516</td>
			<td>LPS used in murine samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis buffer</td>
			<td>Self-made</td>
			<td>-</td>
			<td>155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 1 mM EDTA, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnet</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>18001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, 384 well white</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>784075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monocytes enrichment kit</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>19059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Mr. Frosty Cryo 1 &#176;C Freezing Container</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>cooling device (containing Propanol-2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x pH 7.4 [-] CaCl2 [-] MgCl2</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010</td>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td>Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium bicarbonate - KHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrestoBlue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A13262</td>
			<td>Resazurin solution for viability assessment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propanol-2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.09634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Read buffer</td>
			<td>MesoScale Discovery</td>
			<td>R92TC-3</td>
			<td>Tris-based buffer containing tripropylamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery cell culture freezing medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12648-010</td>
			<td>freezing medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) with Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61870</td>
			<td>+ 10% FBS for iMoDCs 
			+ 10% FBS + 1 mM Sodium Pyruvate + 100 U/mL Pen/Strep + 5 &#181;M &#946;-mercaptoethanol for human PBMCs and monocytes 
			+ 10% FBS + Pen/Strep + 5 &#181;M &#946;-mercaptoethanol for murine splenocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separation buffer</td>
			<td>Self-made</td>
			<td>-</td>
			<td>PBS pH 7.4 + 2% FBS + 1 mM EDTA pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trehalose-6,6-dibehenate</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>tlrl-tdb</td>
			<td>TDB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7949</td>
			<td>Polysorbate 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5 M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15675</td>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viewseal sealer</td>
			<td>Greiner BioOne</td>
			<td>676070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-PLEX Proinflammatory Panel 1 Human Kit</td>
			<td>MesoScale Discovery</td>
			<td>K15049D</td>
			<td>electrochemiluminescent multiplex assay (IL-1&#946;, TNF-&#945;, IL-6, IL-8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

myeloid innate signaling pathway regulation by malt1 paracaspase activity

מלבד תפקודו בתאים הלימפה, אשר טופלה על ידי מחקרים רבים, paracaspase MALT1 גם ממלא תפקיד חשוב בתאים מולדת במורד הזרם של קולטני זיהוי דפוס. למד בצורה הטובה ביותר הם בני Dectin-1 ו- Dectin-2 של משפחת לקטין דמוי קולטן מסוג C זה לגרום SYK CARD9 ותלוי איתות אשד שמוביל NF-κB ההפעלה, באופן תלוי-MALT1. לעומת זאת, כמו אגרה קולטנים (TLR), כגון TLR-4, הפצת NF-κB הפעלה אבל אות דרך המפל MYD88/שמסכנים-תלוי. בכל זאת, MALT1 עשוי לתרום TLR-4 איתות נשאר לא ברור. הראיות זה התבצעה עם המכון הטכנולוגי-827, מעכב חזק, סלקטיבי של פעילות paracaspase MALT1, מציין כי TNF-ייצור במורד הזרם של TLR-4 בתאי מיאלואידית אדם אינו תלוי MALT1, בניגוד TNF-הייצור במורד הזרם של Dectin-1, אשר הוא MALT1 התלויים. כאן, אנחנו פתרנו את מעורבות סלקטיבי של MALT1 זיהוי תבניות חישה עוד יותר, באמצעות מגוון של האדם ואת ההכנות הסלולר העכבר גירוי של Dectin-1, MINCLE או TLR-4 מסלולים. אנחנו גם מספק תובנות נוספות על-ידי חקר ציטוקינים מעבר TNF- ולאחר השוואת הטכנולוגי-827 מעכב SYK (Cpd11), מעכב IKK (AFN700). באופן קולקטיבי, הנתונים שנמסרו ראיות נוספות עבור MALT1-התלות של קולטן דמוי לקטין C-type – איתות לעומת זאת כדי TLR איתות.

בתאי מיאלואידית, MALT1 ממסרים הפעלת אותות במורד הזרם של מספר קולטני לקטין דמוי C-type, כגון Dectin-1, Dectin-2 ו- MINCLE6. המסלולים הללו מסתמכים על (שולי) ITAM מוטיב המכילים קולטנים (למשל, Dectin-1) או מוטיב המכילים קולטנים שיתוף ITAM (למשל, FcRγ, Dectin-2 ו MINCLE) זה לגייס ולהפעיל את SYK...

Watch this Scientific Journal Video about Myeloid Innate Signaling Pathway Regulation by MALT1 Paracaspase Activity at JoVE.com

Myeloid Innate Signaling Pathway Regulation by MALT1 Paracaspase Activity

MALT1 מסדיר מולדת חסינות אך איך זה מתרחש נשאר מעורפל. השתמשנו החומר המדכא paracaspase סלקטיבית MALT1 הטכנולוגי-827 לפענח את התרומה של MALT1 איתות מולדת במורד הזרם של קולטני לקטין דמוי כמו אגרה או C-type, הוכחת MALT1 מסדיר את הייצור של תאים מיאלואידים ציטוקינים, ויוצאת של קולטני לקטין דמוי C-type, באופן סלקטיבי.

תאים מיאלואידים מולדת איתות לשביל רגולציה על-ידי פעילות Paracaspase MALT1

Besides its function in lymphoid cells, which has been addressed by numerous studies, the paracaspase MALT1 also plays an important role in innate cells ...

אז מטרת השיטה בכתב היד שלנו היא לספק ניתוח השוואתי של מסלולי איתות בתאי מיאלואידים באמצעות מערכות אדם ועכבר. זה עוזר להגדיר איזה מסלול איתות מעורב במורד הזרם של קולטני זיהוי דפוס נבחרים. אז שיטה זו היא פשוטה ליישום.הוא מסתמך על תכשירי תאים ראשוניים ותרכובות ייחוס מאומתות, החיוניות להבהרת מנגנוני איתות. הדגמת ההליך תהיה Ratiba Touil ו אדלין Unterreiner, בהתאמה מדען עמית מחקר בקבוצה שלנו. במכסה המנוע של זרימה למינארית קבעו זוג מספריים סטרילי, ליטר אחד ושקית ניילון.מניחים את מעיל באפי שהושג בעבר לתוך המקוון ולהשתמש במספריים כדי לפתוח אותו בזהירות. באמצעות פיפטה 25 מ"מ להוסיף 100 מ"ל של PBS בתוספת 2 מילימולר של EDTA. מערבבים על ידי צינורות לאט למעלה ולמטה.ואז להעביר 25 מ"ל של מעיל באפי מדולל לתוך שישה צינורות צנטריפוגה חרוט 50 מ"ל כי יש כל מולאו מראש עם 15 מ"ל של שיפוע צפיפות מבוסס פוליסכריד. צנטריפוגה הצינורות במשך 20 דקות ב 800 גרם עם האצה מתונה ללא הפסקה כדי לאפשר הפרדת תאים המבוססים על הצפיפות שלהם. לאחר צנטריפוגה שלוש שכבות יהיו גלויות, גלולה המכילה תאי דם אדומים וגרנולוציוטים, שכבה עליונה עשויה פלזמה, וטבעת לבנה המכילה תאים מונונוקלאריים בדם היקפיים.השתמש פיפטה 10 מ"ל לקצור את טבעות PBMC ולהעביר אותם לתוך צינור חדש 50 מ"ל. למעלה עם PBS ו- EDTA. בצע שלוש שטיפות רצופות עם ירידה בזמן הצנטריפוגה והמהירות כמתואר בפרוטוקול הטקסט.לאחר הכביסה הסופית, לחץ מחדש את גלולה ב 25 מ"ל של חיץ תריס קר קרח כדי lyse תאי הדם האדומים על ידי לחץ אוסמוטי. דגירה הפתרון בטמפרטורת החדר עד שהוא הופך להיות ברור. לאחר מכן הוסיפו 25 מ"ל של מאגר הפרדה כדי לעצור את התגובה.צנטריפוגה ב 150 גרם במשך שמונה דקות כדי לשטוף את הפתרון. יוצקים את העל-טבעי ומורידים מחדש את גלולת הכדור עם חיץ ההפרדה. לאחר ספירת התאים, לדלל אותם בתרבות בינוני עד 12, 500 תאים לגם.להפיץ 30 מ"ל של ההשעיה תא זה לתוך כל באר של צלחת 384 היטב. לאחר מכן להוסיף 15 microliters של פתרונות מורכבים מרוכזים ארבע פעמים לכל באר preincubate את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני במשך שעה אחת. אם תרצה, להוסיף גם LPS לריכוז הסופי של 1 ננוגרם למיליליטר או Zymosan מדולדל לריכוז סופי של 100 מק"ג לכל מ"ל.ואז לה הדגירה את הצלחת לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. למחרת לקחת 10 microliters של supernatant למדוד את רמות אלפא TNF המופרש. כדי להתחיל את הדילול הסדרתי, לדלל את פתרון המניות MLT-827 עם בינוני להגיע לריכוז של 8 micromolar ללכת אחד.בצע דילול טורי של שישה שלבים 1:5 באמצעות מדיום עם 0.08%DMSO. כדי להתכונן לבדיקות מנה אחת, לדלל את MLT-827, AFN700, ותרכובת 11 פתרונות מלאי עם בינוני להגיע לריכוז של 4 micromolar ללכת אחד. ראשית, מוסיפים 2 מ"ל של מים סטריליים נטולי אנדוטוקסין ל -10 מ"ג של Zymosan מדולדל.וורטקס פתרון המניה הזה כדי הומוגניזציה זה. עליות הפתרון ולאחר מכן לאחסן את aliquots ב 20 מעלות צלזיוס. במחקר זה PBMCs אנושיים ותאי טחול העכבר מגורים עם Zymosan מדולדל, אגוניסט דקטין-1, או lipopolysaccharide, אגוניסט TL4.שחרור אלפא NTNF ב supernatant נמדד לאחר 20 שעות. הן האדם והן העכבר מסמן את המתחם MLT-827 באופן סלקטיבי חוסם ייצור אלפא TNF מונע על ידי מסלול Dectin-1 אבל לא על ידי מסלול TLR4. במונוציטים מגורה עם LPS, הייצור של אלפא TNF הוא כמעט לחלוטין נפסל על ידי AFN700 אבל זה לא רגיש Cpd11, אשר עולה בקנה אחד עם התלות של מסלול TLR4 בפעילות NF-kappa B ואת התלות שלה על פעילות SIC.לעומת זאת, ייצור אלפא TNF המונע על ידי Dectin-1 ו- MODCs מראה רגישות ל- MLT-827, AFN700 ו- Cpd11. זה מספק ראיות נוספות למעורבות של מפל איתות CBM SIC במסלול Dectin-1. ייצור בטא IL-1, IL-6 ו-IL-23 רגיש גם לשלושת המעכבים, מה שמצביע על מנגנונים רגולטוריים הדומים ל-TNF אלפא.עם זאת, ההשפעה המוגבלת שנראתה על הייצור של IL-8 מרמזת כי ציטוקין זה יש מנגנון רגולטורי מובהק. העלאת ריכוזי Trehalose-dibehenate מעל 50 מק"ג למ"ל מובילה לייצור אלפא TNF, IL-6 ו- IL-1 בטא, שהסתמכו על פעילות paracaspase מאלט1 על פי אפקט החסימה של MLT-827. תוצאות דומות נראו כאשר מאתגרים את MODCs עם ריכוזים הולכים וגדלים של Zymosan מדולדל כדי לעורר Dectin-1.שיטה זו אפשרה להראות כי PARACASPASE MALT1 מווסת באופן סלקטיבי קולטן דמוי לטין מסוג C. זה חיוני כדי להשתמש תרכובות התייחסות מאופיין היטב. שים לב להליך לדילול פתרונות המניות.זה קריטי עבור מתחם עם מבודדות מוגבלת.

Research

JoVE Journal

Biology

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

התרבות של תאים דנדריטים מיאלואידית מ מבשרי מח עצם

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

Reaggregate Thymus Cultures

Reaggregate תרבויות קורנית

Stromal cells within lymphoid tissues are organized into three-dimensional structures that provide a scaffold that is thought to control the migration and ...

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

הכנת 2-dGuo שטופלו תרבויות איברים קורנית

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Dissection ו מכתים של תסיסנית הזחל השחלות

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

ויזואליזציה של כלי דם Ca 2 + איתות מופעלות על ידי ROS נגזר אוטוקריני

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

באמצעות רצף מעצר SecM ככלי לבודד פוליפפטידים כרוכים הריבוזום

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

הדמית עבודה גבוהה תוכן ללמוד Grb2 מכלולי איתות על ידי שיבוט ביטוי

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

הדמית מולקולה הבודדה של רגולציה גנטית<em&gt; בחי</em&gt; שימוש הפעלת Cotranslational ידי מחשוף (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

הרבייה מכאנית מושרה גירוי סיד גל בmonolayers הסלולרי: דוגמה לתאי אנדותל קרני שור

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

מטבולית תיוג וממברנה היפוך חלוקה לניתוח השוואתי של proteomic<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em&gt; תא תרבויות השעיה

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...