Name: myeloid innate signaling pathway regulation by malt1 paracaspase activity
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Myeloid Innate Signaling Pathway Regulation by MALT1 Paracaspase Activity at JoVE.com

हम उनके प्राधिकरण (लाइसेंस नंबर ४३३४७७०६३०१२७) के लिए Elsevier धंयवाद यहां Unterreiner एट अल से चित्रा 2a प्रतिलिपि । (२०१७) ।

नोवार्टिस मानव अनुसंधान आचार समिति के दिशानिर्देशों और मानकों के अनुसार प्रयोग किए गए ।
1. मानव Buffy कोट से परिधीय रक्त Mononuclear कोशिकाओं (PBMCs) की तैयारी
नोट: हम एक दिन के संग्रह के बाद ?...

<ol>
	<li>Coornaert, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+antigen+receptor+stimulation+induces+MALT1+paracaspase-mediated+cleavage+of+the+NF-kappaB+inhibitor+A20.">T cell antigen receptor stimulation induces MALT1 paracaspase-mediated cleavage of the NF-kappaB inhibitor A20.</a> Nature immunology. 9 (3), 263-271 (2008).</li><li>Rebeaud, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proteolytic+activity+of+the+paracaspase+MALT1+is+key+in+T+cell+activation.">The proteolytic activity of the paracaspase MALT1 is key in T cell activation.</a> Nature immunology. 9 (3), 272-281 (2008).</li><li>Jaworski, M., Thome, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+paracaspase+MALT1:+Biological+function+and+potential+for+therapeutic+inhibition.">The paracaspase MALT1: Biological function and potential for therapeutic inhibition.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (3), 459-473 (2016).</li><li>Meininger, I., Krappmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+signaling+and+activation+by+the+CARMA1-BCL10-MALT1+signalosome.">Lymphocyte signaling and activation by the CARMA1-BCL10-MALT1 signalosome.</a> Biological Chemistry. 397 (12), 1315-1333 (2016).</li><li>Qiao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+architecture+of+the+CARMA1/Bcl10/MALT1+signalosome:+nucleation-induced+filamentous+assembly.">Structural architecture of the CARMA1/Bcl10/MALT1 signalosome: nucleation-induced filamentous assembly.</a> Molecular cell. 51 (6), 766-779 (2013).</li><li>Gross, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Card9+controls+a+non-TLR+signalling+pathway+for+innate+anti-fungal+immunity.">Card9 controls a non-TLR signalling pathway for innate anti-fungal immunity.</a> Nature. 442 (7103), 651-656 (2006).</li><li>Chiffoleau, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-type+lectin-like+receptors+as+emerging+orchestrators+of+sterile+inflammation+represent+potential+therapeutic+targets.">C-type lectin-like receptors as emerging orchestrators of sterile inflammation represent potential therapeutic targets.</a> Frontiers in Immunology. 9 (FEB), 1-9 (2018).</li><li>Taylor, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dectin-1+is+required+for+beta-glucan+recognition+and+control+of+fungal+infection.">Dectin-1 is required for beta-glucan recognition and control of fungal infection.</a> Nature Immunology. 8 (1), 31-38 (2007).</li><li>Lanternier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+immunodeficiencies+underlying+fungal+infections.">Primary immunodeficiencies underlying fungal infections.</a> Current opinion in pediatrics. 25 (6), 736-747 (2013).</li><li>Thome, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+roles+for+MALT1+in+T-cell+activation.">Multifunctional roles for MALT1 in T-cell activation.</a> Nature reviews. Immunology. 8 (7), 495-500 (2008).</li><li>Unterreiner, A., Stoehr, N., Huppertz, C., Calzascia, T., Farady, C. J., Bornancin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+MALT1+paracaspase+inhibition+does+not+block+TNF-&#945;+production+downstream+of+TLR-4+in+myeloid+cells.">Selective MALT1 paracaspase inhibition does not block TNF-&#945; production downstream of TLR-4 in myeloid cells.</a> Immunology Letters. , 48-51 (2017).</li><li>Strasser, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syk+Kinase-Coupled+C-type+Lectin+Receptors+Engage+Protein+Kinase+C-&#x3B4;+to+Elicit+Card9+Adaptor-Mediated+Innate+Immunity.">Syk Kinase-Coupled C-type Lectin Receptors Engage Protein Kinase C-&#x3B4; to Elicit Card9 Adaptor-Mediated Innate Immunity.</a> Immunity. 36 (1), 32-42 (2012).</li><li>Jaworski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malt1+protease+inactivation+efficiently+dampens+immune+responses+but+causes+spontaneous+autoimmunity.">Malt1 protease inactivation efficiently dampens immune responses but causes spontaneous autoimmunity.</a> The EMBO journal. 33 (23), 2765-2781 (2014).</li><li>Yu, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALT1+protease+activity+is+required+for+innate+and+adaptive+immune+responses.">MALT1 protease activity is required for innate and adaptive immune responses.</a> PLoS ONE. 10 (5), 1-20 (2015).</li><li>Bardet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+T-cell+fingerprint+of+MALT1+paracaspase+revealed+by+selective+inhibition.">The T-cell fingerprint of MALT1 paracaspase revealed by selective inhibition.</a> Immunology and Cell Biology. 96 (1), 81-99 (2018).</li><li>Thoma, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+profiling+of+a+selective+and+efficacious+syk+inhibitor.">Discovery and profiling of a selective and efficacious syk inhibitor.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 58 (4), 1950-1963 (2015).</li><li>Bauer, B., Steinle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HemITAM:+A+single+tyrosine+motif+that+packs+a+punch.">HemITAM: A single tyrosine motif that packs a punch.</a> Science Signaling. 10 (508), 1-10 (2017).</li><li>Gringhuis, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+c-Rel+activation+via+Malt1+controls+anti-fungal+TH-17+immunity+by+dectin-1+and+dectin-2.">Selective c-Rel activation via Malt1 controls anti-fungal TH-17 immunity by dectin-1 and dectin-2.</a> PLoS Pathogens. 7 (1), (2011).</li><li>Dufner, A., Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell+antigen+receptor-induced+activation+of+an+IRAK4-dependent+signaling+pathway+revealed+by+a+MALT1-IRAK4+double+knockout+mouse+model.">B cell antigen receptor-induced activation of an IRAK4-dependent signaling pathway revealed by a MALT1-IRAK4 double knockout mouse model.</a> Cell Communication and Signaling. 9 (1), 6 (2011).</li><li>Phelan, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiprotein+supercomplex+controlling+oncogenic+signalling+in+lymphoma.">A multiprotein supercomplex controlling oncogenic signalling in lymphoma.</a> Nature. , (2018).</li></ol>

इस काम में, हम मानव और माउस सहज कोशिकाओं में संकेत रास्ते का अध्ययन करने के लिए सरल प्रयोगात्मक सेटिंग्स का इस्तेमाल किया, और MALT1 proteolytic समारोह पर उनकी निर्भरता पूछताछ. पिछले काम11पर विस्तार, हमारे ?...

MALT1 की paracaspase गतिविधि (म्यूकोसा जुड़े लसीकावत् ऊतक लिंफोमा translocation प्रोटीन 1) २००८1,2में पता चला था । तब से, अध्ययन के एक नंबर लिम्फोसाइटों में प्रतिजन रिसेप्टर प्रतिक्रियाओं के लिए अपने महत्वपूर्ण योगदान की सूचना दी है । माउस में आनुवंशिक मॉडल के रूप में के रूप में अच्छी तरह से औषध विज्ञान डेटा टी कोशिकाओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका, t-सेल में निर्भर उन्मुक्ति और B-सेल लिंफोमा सेटिंग्स3,4में समर्थन करते हैं । लिम्फोसाइटों में, MALT1 paracaspase सक्रियण एक CARD11-BCL10-MALT1 जटिल5, जो प्रतिजन-टी या बी-सेल रिसेप्टर के संकेतन के बहाव से शुरू हो रहा है की विधानसभा पर होता है । वहां भी पर्याप्त सबूत है कि एक समान CARD9-BCL10-MALT1 जटिल सी के बहाव संकेत-प्रकार लेक्टिन रिसेप्टर्स की तरह (CLLR), जैसे, Dectin-1, Dectin-2 और माइलॉयड कोशिकाओं में MINCLE6,7के प्रवाह का प्रचार के लिए महत्वपूर्ण है । Dectin-1 विशेष रूप से अच्छी तरह से अध्ययन किया गया है क्योंकि इस मार्ग कवक संक्रमण8,9के खिलाफ मेजबान रक्षा के लिए महत्वपूर्ण है । टोल में MALT1 के निहितार्थ-रिसेप्टर (TLR) रास्ते की तरह है, तथापि, विवादास्पद10बनी हुई है । मानव माइलॉयड कोशिकाओं में हाल ही में सबूत TLR-411के TNF-उत्पादन बहाव के विनियमन में MALT1 paracaspase गतिविधि के लिए एक सीधी भूमिका से इनकार किया ।
वर्तमान काम में, हम विभिन्न प्रयोगात्मक सेटिंग्स और मानव और माउस माइलॉयड कोशिकाओं में stimulatory शर्तों सहज संकेतन रास्ते की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया, विशिष्ट औषधीय उपकरण अवरोधकों और cytokine उत्पादन की माप पर निर्भर है ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 &#181;m nylon cell strainer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS431752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 ml Falcon tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plates</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat-bottom plate, with low evaporation lid</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well V-bottom plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>734-1798</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride - NH4Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay diluent RD1-W ELISA</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>895038</td>
			<td>Assay diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture microplate, 384 well, black</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>781986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depleted Zymosan</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>tlrl-dzn</td>
			<td>now: tlrl-zyd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td>DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA-Na2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA muTNF-&#945;</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>SMTA00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C tubes</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS dissociator</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM-CSF</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTRF hu IL-23</td>
			<td>CisBio</td>
			<td>62HIL23PEG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTRF hu TNF-&#945;</td>
			<td>CisBio</td>
			<td>62TNFPEC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTRF reconstitution buffer</td>
			<td>CisBio</td>
			<td>62RB3RDE</td>
			<td>50mM Phosphate buffer, pH 7.0, 0.8M KF, 0.2% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-&#947;</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>L4516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-4</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>Forene</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides (LPS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4391</td>
			<td>LPS used in human samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4516</td>
			<td>LPS used in murine samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis buffer</td>
			<td>Self-made</td>
			<td>-</td>
			<td>155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 1 mM EDTA, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnet</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>18001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, 384 well white</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>784075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monocytes enrichment kit</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>19059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Mr. Frosty Cryo 1 &#176;C Freezing Container</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>cooling device (containing Propanol-2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x pH 7.4 [-] CaCl2 [-] MgCl2</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010</td>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td>Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium bicarbonate - KHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrestoBlue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A13262</td>
			<td>Resazurin solution for viability assessment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propanol-2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.09634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Read buffer</td>
			<td>MesoScale Discovery</td>
			<td>R92TC-3</td>
			<td>Tris-based buffer containing tripropylamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery cell culture freezing medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12648-010</td>
			<td>freezing medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) with Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61870</td>
			<td>+ 10% FBS for iMoDCs 
			+ 10% FBS + 1 mM Sodium Pyruvate + 100 U/mL Pen/Strep + 5 &#181;M &#946;-mercaptoethanol for human PBMCs and monocytes 
			+ 10% FBS + Pen/Strep + 5 &#181;M &#946;-mercaptoethanol for murine splenocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separation buffer</td>
			<td>Self-made</td>
			<td>-</td>
			<td>PBS pH 7.4 + 2% FBS + 1 mM EDTA pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trehalose-6,6-dibehenate</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>tlrl-tdb</td>
			<td>TDB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7949</td>
			<td>Polysorbate 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5 M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15675</td>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viewseal sealer</td>
			<td>Greiner BioOne</td>
			<td>676070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-PLEX Proinflammatory Panel 1 Human Kit</td>
			<td>MesoScale Discovery</td>
			<td>K15049D</td>
			<td>electrochemiluminescent multiplex assay (IL-1&#946;, TNF-&#945;, IL-6, IL-8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

myeloid innate signaling pathway regulation by malt1 paracaspase activity

लसीकावत् कोशिकाओं है, जो कई अध्ययनों से संबोधित किया गया है में अपने कार्य के अलावा, paracaspase MALT1 भी जन्मजात कोशिकाओं पैटर्न मांयता रिसेप्टर्स के बहाव में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । सबसे अच्छा अध्ययन किया Dectin-1 और Dectin-2 के सदस्यों सी प्रकार लेक्टिन रिसेप्टर परिवार की तरह है कि एक SYK-और CARD9-निर्भर संकेतन झरना NF-κB सक्रियण के लिए अग्रणी, एक MALT1-निर्भर तरीके से प्रेरित कर रहे हैं । इसके विपरीत, टोल जैसे रिसेप्टर्स (TLR), जैसे TLR-4, प्रचार NF-κB सक्रियण लेकिन एक MYD88/IRAK-निर्भर झरना के माध्यम से संकेत । फिर भी, चाहे MALT1 TLR में योगदान कर सकते है-4 संकेत अस्पष्ट बनी हुई है । MLT के साथ हाल ही में सबूत-८२७, MALT1 paracaspase गतिविधि के एक शक्तिशाली और चयनात्मक अवरोध करनेवाला, इंगित करता है कि TNF-TLR के उत्पादन बहाव-मानव माइलॉयड कोशिकाओं में 4 MALT1 से स्वतंत्र है, के रूप में TNF का विरोध-उत्पादन बहाव Dectin-1 है, जो MALT1 है निर्भर. यहां, हम पैटर्न मांयता में MALT1 के चयनात्मक भागीदारी को संबोधित किया आगे संवेदन, मानव और माउस सेलुलर तैयारी की एक किस्म का उपयोग कर, और Dectin की उत्तेजना-1, MINCLE या TLR-4 रास्ते । हम भी TNF से परे साइटोकिंस की खोज के द्वारा अतिरिक्त अंतर्दृष्टि प्रदान की-, और एक SYK अवरोध करनेवाला (Cpd11) के लिए MLT-८२७ तुलना करके और एक मतान्ध अवरोध करनेवाला (AFN700) । सामूहिक रूप से, डाटा प्रदान की MALT1-निर्भरता के लिए और अधिक सबूत सी प्रकार लेक्टिन रिसेप्टर की तरह-TLR संकेत के विपरीत द्वारा संकेतन ।

माइलॉयड कोशिकाओं में, MALT1 जैसे Dectin-1, Dectin-2 और MINCLE6के रूप में कई सी-प्रकार लेक्टिन रिसेप्टर्स, के बहाव सक्रियण संकेत रिले । इन रास्ते (हेम) आईटम आकृति-रिसेप्टर्स युक्त (जैसे, Dectin-1) या आईटम ?...

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Myeloid Innate Signaling Pathway Regulation by MALT1 Paracaspase Activity

MALT1 जन्मजात प्रतिरक्षा को नियंत्रित करता है, लेकिन यह कैसे होता है बीमार परिभाषित रहता है । हम चुनिंदा MALT1 paracaspase अवरोध करनेवाला MLT-८२७ का उपयोग करने के लिए MALT1 के योगदान को सहज संकेतन के बहाव के लिए टोल की तरह या सी-प्रकार लेक्टिन रिसेप्टर्स की तरह, प्रदर्शन कि MALT1 माइलॉयड साइटोकिंस के उत्पादन को नियंत्रित करता है, और बहाव सी के प्रकार लेक्टिन रिसेप्टर्स, चुनिंदा की तरह ।

माइलॉयड जन्मजात संकेतन मार्ग विनियमन MALT1 Paracaspase गतिविधि द्वारा

Besides its function in lymphoid cells, which has been addressed by numerous studies, the paracaspase MALT1 also plays an important role in innate cells ...

इसलिए हमारी पांडुलिपि में विधि का उद्देश्य मानव और माउस प्रणालियों का उपयोग करके माइलॉयड कोशिकाओं में सिग्नलिंग रास्तों का तुलनात्मक विश्लेषण प्रदान करना है। यह परिभाषित करने में मदद करता है जो सिग्नलिंग मार्ग चयनित पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स के डाउनस्ट्रीम में शामिल है। इसलिए इस विधि को लागू करने के लिए सरल है।यह प्राथमिक कोशिका तैयारी और मान्य संदर्भ यौगिकों पर निर्भर करता है, जो सिग्नलिंग तंत्र की स्पष्टता के लिए आवश्यक है। प्रक्रिया का प्रदर्शन रतिबा Touil और Adeline Unterreiner, क्रमशः वैज्ञानिक और हमारे समूह में अनुसंधान सहयोगी होगा । एक लैमिनार फ्लो हुड में कैंची की एक बाँझ जोड़ी, एक लीटर बीकर, और एक प्लास्टिक की थैली निर्धारित की गई।पहले से प्राप्त बफी कोट को बीकर में रखें और इसे ध्यान से खोलने के लिए कैंची का उपयोग करें। 25 मिमी पिपेट का उपयोग करके ईडीटीए के 2 मिलीमोलर के साथ पूरक पीबीएस के 100 मिलीलीटर जोड़ें। धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पाइपिंग करके मिलाएं।और फिर पतला बफी कोट के 25 मिलीलीटर को छह 50 मिलीलीटर शंकुकेंद्री ट्यूबों में स्थानांतरित करें जो प्रत्येक को 15 मिलीलीटर पॉलीसैचराइड आधारित घनत्व ढाल के साथ पूर्व से भरा गया है। उनके घनत्व के आधार पर कोशिकाओं के पृथक्करण के लिए अनुमति देने के लिए ब्रेक के बिना मध्यम त्वरण के साथ 800 ग्राम पर 20 मिनट के लिए ट्यूबों को अपकेंद्रित्र करें। अपकेंद्रित्र के बाद तीन परतें दिखाई देंगी, लाल रक्त कोशिकाओं और ग्रेनुलोसाइट्स युक्त एक गोली, प्लाज्मा से बनी एक ऊपरी परत, और परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं से युक्त एक सफेद अंगूठी।पीबीएमसी के छल्ले की कटाई के लिए 10 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग करें और उन्हें एक नई 50 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें। पीबीएस और ईडीटीए के साथ टॉप अप करें। पाठ प्रोटोकॉल में उल्लिखित अपकेंद्रण समय और गति के साथ लगातार तीन वॉश करें।अंतिम धोने के बाद, 25 मिलीलीटर बर्फ ठंड में गोली को फिर से रखें ताकि ओस्मोटिक प्रेशर द्वारा लाल रक्त कोशिकाओं को लाइसे किया जा सके। कमरे के तापमान पर समाधान को तब तक इनक्यूबेट करें जब तक कि यह स्पष्ट न हो जाए। फिर प्रतिक्रिया को रोकने के लिए 25 मिलीलीटर सेपरेशन बफर जोड़ें।समाधान धोने के लिए आठ मिनट के लिए 150 ग्राम पर सेंट्रलाइज करें। सुपरनेट को बंद करें और सेपरेशन बफर के साथ गोली को फिर से खर्च करें। कोशिकाओं की गिनती के बाद, उन्हें संस्कृति माध्यम में पतला करने के लिए 12, ५०० कोशिकाओं को अच्छी तरह से नीचे ।एक 384 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में इस सेल निलंबन के 30 मिलीलीटर वितरित करें। इसके बाद प्रत्येक कुएं में चार बार केंद्रित यौगिक समाधानों के 15 माइक्रोलीटर जोड़ें और प्लेट को एक घंटे के लिए 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रीइनक्यूबेट करें। यदि वांछित है, तो प्रति मिलीलीटर 1 एनजी की अंतिम एकाग्रता में एलपीएस जोड़ें या 100 एमसीजी प्रति मिलीलीटर की अंतिम एकाग्रता में ज़िमोसन समाप्त हो गया।फिर 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर थाली इनक्यूबेट । अगले दिन स्रावित टीएनएफ अल्फा स्तरों को मापने के लिए सुपरनेट के 10 माइक्रोलीटर लें। धारावाहिक कमजोर पड़ने शुरू करने के लिए, एक बार में 8 माइक्रोमोलर की एकाग्रता तक पहुंचने के लिए माध्यम के साथ MLT-827 स्टॉक समाधान को कमजोर करें।0.08% DMSO के साथ माध्यम का उपयोग कर एक छह कदम 1:5 धारावाहिक कमजोर पड़ने प्रदर्शन करते हैं। एकल खुराक परीक्षण के लिए तैयार करने के लिए, एक बार में 4 माइक्रोमोलर की एकाग्रता तक पहुंचने के लिए माध्यम के साथ MLT-827, AFN700, और यौगिक 11 स्टॉक समाधान को पतला करें। सबसे पहले, 10 मिलीग्राम समाप्त होने वाले ज़ाइमोसन में 2 मिलीलीटर बाँझ एंडोटॉक्सिन-मुक्त पानी जोड़ें।भंवर यह स्टॉक समाधान इसे समरूप करने के लिए। समाधान को अलीकोट करें और फिर एलिकोट्स को 20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। इस अध्ययन में मानव पीबीएमसी और माउस तिल्ली कोशिकाओं को या तो समाप्त होने वाले ज़ाइमोसन, डेटिन-1 एगोनिस्ट, या लिपोपॉलिसाकराइड, टीएल 4 एगोनिस्ट के साथ उत्तेजित किया जाता है।सुपरनेट में एनटीएनएफ अल्फा रिलीज को 20 घंटे के बाद मापा जाता है। मानव और माउस दोनों में MLT-827 यौगिक चुनिंदा टीएनएफ अल्फा उत्पादन को डेप्टिन-1 मार्ग द्वारा संचालित अवरुद्ध करता है लेकिन टीएलआर 4 मार्ग द्वारा नहीं। एलपीएस के साथ उत्तेजित मोनोसाइट्स में, टीएनएफ अल्फा का उत्पादन AFN700 द्वारा लगभग पूरी तरह से निरस्त किया गया है, लेकिन यह Cpd11 के प्रति संवेदनशील नहीं है, जो एनएफ-कापा बी गतिविधि पर टीएलआर4 पाथवे की निर्भरता और एसआईसी गतिविधि पर इसकी निर्भरता के अनुरूप है।इसके विपरीत टेटिन-1 और MODCs द्वारा संचालित टीएनएफ अल्फा उत्पादन MLT-827, AFN700, और Cpd11 के प्रति संवेदनशीलता दिखाता है। यह डेटिन-1 मार्ग में एक एसआईसी सीबीएम सिग्नलिंग झरना की भागीदारी के लिए और अधिक सबूत प्रदान करता है । आईएल-1 बीटा, आईएल-6 और आईएल-23 का उत्पादन भी तीन अवरोधकों के प्रति संवेदनशील है, जो टीएनएफ अल्फा के समान नियामक तंत्र का संकेत है।हालांकि, आईएल-8 के उत्पादन पर देखे गए सीमित प्रभाव से पता चलता है कि इस साइटोकिन में एक अलग नियामक तंत्र है। 50 एमसीजी प्रति मिलीलीटर से ऊपर ट्रेहालोस-डिबेहेनेट सांद्रता बढ़ाने से टीएनएफ अल्फा, आईएल-6 और आईएल-1 बीटा का उत्पादन होता है, जो एमएलटी-827 के अवरुद्ध प्रभाव के अनुसार माल्ट1 पैराकास्पास गतिविधि पर भरोसा करता है। इसी तरह के परिणाम तब देखे गए जब डेटिन-1 को प्रोत्साहित करने के लिए समाप्त होने वाले ज़ाइमोसन की बढ़ती सांद्रता के साथ MODCs को चुनौती दी गई।इस विधि ने यह दिखाना संभव बनाया कि पैराकास्पाज़ माल्ट1 चुनिंदा सी-प्रकार लेक्टिन-जैसे रिसेप्टर सिग्नलिंग को नियंत्रित करता है। अच्छी तरह से विशेषता वाले संदर्भ यौगिकों का उपयोग करना आवश्यक है। स्टॉक समाधानों को कमजोर करने की प्रक्रिया पर ध्यान दें।यह सीमित घुलनशीलता के साथ यौगिक के लिए महत्वपूर्ण है।

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