Name: myeloid innate signaling pathway regulation by malt1 paracaspase activity
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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我々 は Unterreinerらから図 2 aをここで再現する彼らの承認 (ナンバー 4334770630127) のエルゼビアに感謝します。(2017 年)。

ガイドラインとノバルティス人間研究倫理委員会の基準に従って実験を行った。
1. 末梢血単核球 (PBMCs) 人間のバフィー コートからの準備
注:1 日 50 mL 袋内のコレクションの後、健康なボランティアからバフィー コートをいただきました。インフォームド コンセントの下で提供され、 Interregionale Blutspende Schweizeriches Rotes クロイツを?...

<ol>
	<li>Coornaert, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+antigen+receptor+stimulation+induces+MALT1+paracaspase-mediated+cleavage+of+the+NF-kappaB+inhibitor+A20.">T cell antigen receptor stimulation induces MALT1 paracaspase-mediated cleavage of the NF-kappaB inhibitor A20.</a> Nature immunology. 9 (3), 263-271 (2008).</li><li>Rebeaud, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proteolytic+activity+of+the+paracaspase+MALT1+is+key+in+T+cell+activation.">The proteolytic activity of the paracaspase MALT1 is key in T cell activation.</a> Nature immunology. 9 (3), 272-281 (2008).</li><li>Jaworski, M., Thome, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+paracaspase+MALT1:+Biological+function+and+potential+for+therapeutic+inhibition.">The paracaspase MALT1: Biological function and potential for therapeutic inhibition.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (3), 459-473 (2016).</li><li>Meininger, I., Krappmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+signaling+and+activation+by+the+CARMA1-BCL10-MALT1+signalosome.">Lymphocyte signaling and activation by the CARMA1-BCL10-MALT1 signalosome.</a> Biological Chemistry. 397 (12), 1315-1333 (2016).</li><li>Qiao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+architecture+of+the+CARMA1/Bcl10/MALT1+signalosome:+nucleation-induced+filamentous+assembly.">Structural architecture of the CARMA1/Bcl10/MALT1 signalosome: nucleation-induced filamentous assembly.</a> Molecular cell. 51 (6), 766-779 (2013).</li><li>Gross, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Card9+controls+a+non-TLR+signalling+pathway+for+innate+anti-fungal+immunity.">Card9 controls a non-TLR signalling pathway for innate anti-fungal immunity.</a> Nature. 442 (7103), 651-656 (2006).</li><li>Chiffoleau, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-type+lectin-like+receptors+as+emerging+orchestrators+of+sterile+inflammation+represent+potential+therapeutic+targets.">C-type lectin-like receptors as emerging orchestrators of sterile inflammation represent potential therapeutic targets.</a> Frontiers in Immunology. 9 (FEB), 1-9 (2018).</li><li>Taylor, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dectin-1+is+required+for+beta-glucan+recognition+and+control+of+fungal+infection.">Dectin-1 is required for beta-glucan recognition and control of fungal infection.</a> Nature Immunology. 8 (1), 31-38 (2007).</li><li>Lanternier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+immunodeficiencies+underlying+fungal+infections.">Primary immunodeficiencies underlying fungal infections.</a> Current opinion in pediatrics. 25 (6), 736-747 (2013).</li><li>Thome, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+roles+for+MALT1+in+T-cell+activation.">Multifunctional roles for MALT1 in T-cell activation.</a> Nature reviews. Immunology. 8 (7), 495-500 (2008).</li><li>Unterreiner, A., Stoehr, N., Huppertz, C., Calzascia, T., Farady, C. J., Bornancin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+MALT1+paracaspase+inhibition+does+not+block+TNF-&#945;+production+downstream+of+TLR-4+in+myeloid+cells.">Selective MALT1 paracaspase inhibition does not block TNF-&#945; production downstream of TLR-4 in myeloid cells.</a> Immunology Letters. , 48-51 (2017).</li><li>Strasser, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syk+Kinase-Coupled+C-type+Lectin+Receptors+Engage+Protein+Kinase+C-&#x3B4;+to+Elicit+Card9+Adaptor-Mediated+Innate+Immunity.">Syk Kinase-Coupled C-type Lectin Receptors Engage Protein Kinase C-&#x3B4; to Elicit Card9 Adaptor-Mediated Innate Immunity.</a> Immunity. 36 (1), 32-42 (2012).</li><li>Jaworski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malt1+protease+inactivation+efficiently+dampens+immune+responses+but+causes+spontaneous+autoimmunity.">Malt1 protease inactivation efficiently dampens immune responses but causes spontaneous autoimmunity.</a> The EMBO journal. 33 (23), 2765-2781 (2014).</li><li>Yu, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALT1+protease+activity+is+required+for+innate+and+adaptive+immune+responses.">MALT1 protease activity is required for innate and adaptive immune responses.</a> PLoS ONE. 10 (5), 1-20 (2015).</li><li>Bardet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+T-cell+fingerprint+of+MALT1+paracaspase+revealed+by+selective+inhibition.">The T-cell fingerprint of MALT1 paracaspase revealed by selective inhibition.</a> Immunology and Cell Biology. 96 (1), 81-99 (2018).</li><li>Thoma, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+profiling+of+a+selective+and+efficacious+syk+inhibitor.">Discovery and profiling of a selective and efficacious syk inhibitor.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 58 (4), 1950-1963 (2015).</li><li>Bauer, B., Steinle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HemITAM:+A+single+tyrosine+motif+that+packs+a+punch.">HemITAM: A single tyrosine motif that packs a punch.</a> Science Signaling. 10 (508), 1-10 (2017).</li><li>Gringhuis, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+c-Rel+activation+via+Malt1+controls+anti-fungal+TH-17+immunity+by+dectin-1+and+dectin-2.">Selective c-Rel activation via Malt1 controls anti-fungal TH-17 immunity by dectin-1 and dectin-2.</a> PLoS Pathogens. 7 (1), (2011).</li><li>Dufner, A., Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell+antigen+receptor-induced+activation+of+an+IRAK4-dependent+signaling+pathway+revealed+by+a+MALT1-IRAK4+double+knockout+mouse+model.">B cell antigen receptor-induced activation of an IRAK4-dependent signaling pathway revealed by a MALT1-IRAK4 double knockout mouse model.</a> Cell Communication and Signaling. 9 (1), 6 (2011).</li><li>Phelan, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiprotein+supercomplex+controlling+oncogenic+signalling+in+lymphoma.">A multiprotein supercomplex controlling oncogenic signalling in lymphoma.</a> Nature. , (2018).</li></ol>

この仕事で人間のシグナル伝達経路とマウス自然細胞研究し、MALT1 蛋白分解機能への依存度を調査簡単な実験設定を使用しました。以前の作業11で拡大して、我々 の研究は、MALT1 paracaspase 活動が C 型レクチン様受容体誘導サイトカイン産生、TNF α などを制御することを示した。対照的に、TLR 4 誘導性 TNF α は両草種と MALT1 の独立していた。総称して、これらのデータは、MAL...

MALT1 の paracaspase 活動 (粘膜関連リンパ組織リンパ腫転座蛋白質 1) は、2008 年1,2で明らかにされました。その後、研究の数は、リンパ球の抗原受容体応答への重要な貢献を報告しています。マウス T 細胞、T 細胞の依存の自己免疫および B 細胞リンパ腫の設定3,4薬理データが重要な役割をサポートと同様に遺伝的モデル。CARD11-BCL10-MALT1 複雑な5、抗原受容体近位伝達によってトリガーされるアセンブリに発生します MALT1 paracaspase 活性化リンパ球の T ・ B 細胞受容体の下流。また同様 CARD9 BCL10 MALT1 コンプレックスが例えば C 型レクチン様受容体 (CLLR) の下流にシグナルを伝達するために重要という十分な証拠がある,自己免疫 1、ヒトデクチン 2、骨髄性で MINCLE 細胞6,7。自己免疫 1 はこの経路は真菌感染症8,9防御の重要なので、特によく研究されています。ただし、Toll 様受容体 (TLR) 経路で MALT1 の含意は、物議を醸す10を推移しています。ひと骨髄細胞における最近の証拠は TLR 411の下流 TNF 産規制で MALT1 paracaspase 活性に直接的な役割を否定しました。
現在の仕事で特定の薬理学的ツール阻害剤、サイトカイン産生の測定に依存する生得的なシグナル伝達経路をプローブする様々 な実験的設定と人間の刺激条件マウス骨髄細胞を使いました。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 &#181;m nylon cell strainer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS431752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 ml Falcon tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plates</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat-bottom plate, with low evaporation lid</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well V-bottom plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>734-1798</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride - NH4Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay diluent RD1-W ELISA</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>895038</td>
			<td>Assay diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture microplate, 384 well, black</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>781986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depleted Zymosan</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>tlrl-dzn</td>
			<td>now: tlrl-zyd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td>DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA-Na2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA muTNF-&#945;</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>SMTA00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C tubes</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS dissociator</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM-CSF</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTRF hu IL-23</td>
			<td>CisBio</td>
			<td>62HIL23PEG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTRF hu TNF-&#945;</td>
			<td>CisBio</td>
			<td>62TNFPEC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTRF reconstitution buffer</td>
			<td>CisBio</td>
			<td>62RB3RDE</td>
			<td>50mM Phosphate buffer, pH 7.0, 0.8M KF, 0.2% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-&#947;</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>L4516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-4</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>Forene</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides (LPS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4391</td>
			<td>LPS used in human samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4516</td>
			<td>LPS used in murine samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis buffer</td>
			<td>Self-made</td>
			<td>-</td>
			<td>155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 1 mM EDTA, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnet</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>18001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, 384 well white</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>784075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monocytes enrichment kit</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>19059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Mr. Frosty Cryo 1 &#176;C Freezing Container</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>cooling device (containing Propanol-2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x pH 7.4 [-] CaCl2 [-] MgCl2</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010</td>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td>Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium bicarbonate - KHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrestoBlue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A13262</td>
			<td>Resazurin solution for viability assessment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propanol-2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.09634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Read buffer</td>
			<td>MesoScale Discovery</td>
			<td>R92TC-3</td>
			<td>Tris-based buffer containing tripropylamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery cell culture freezing medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12648-010</td>
			<td>freezing medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) with Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61870</td>
			<td>+ 10% FBS for iMoDCs 
			+ 10% FBS + 1 mM Sodium Pyruvate + 100 U/mL Pen/Strep + 5 &#181;M &#946;-mercaptoethanol for human PBMCs and monocytes 
			+ 10% FBS + Pen/Strep + 5 &#181;M &#946;-mercaptoethanol for murine splenocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separation buffer</td>
			<td>Self-made</td>
			<td>-</td>
			<td>PBS pH 7.4 + 2% FBS + 1 mM EDTA pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trehalose-6,6-dibehenate</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>tlrl-tdb</td>
			<td>TDB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7949</td>
			<td>Polysorbate 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5 M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15675</td>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viewseal sealer</td>
			<td>Greiner BioOne</td>
			<td>676070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-PLEX Proinflammatory Panel 1 Human Kit</td>
			<td>MesoScale Discovery</td>
			<td>K15049D</td>
			<td>electrochemiluminescent multiplex assay (IL-1&#946;, TNF-&#945;, IL-6, IL-8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

myeloid innate signaling pathway regulation by malt1 paracaspase activity

多くの研究によって対処されている、リンパ球様細胞でその機能のほか paracaspase MALT1 はまたパターン認識受容体の下流生得の細胞で重要な役割を果たしています。SYK と CARD9-依存性シグナル伝達カスケード MALT1 依存的に、NF-κ B の活性化につながるを誘発する C 型レクチン様受容体ファミリの自己免疫 1 および自己免疫-2 メンバーである最もよく研究します。一方で、Toll 様受容体 (TLR) TLR 4 など NF-κ B 活性化が MYD88/アイラック依存型カスケードを介して信号を伝達します。それにもかかわらず、MALT1 TLR 4 シグナル伝達に貢献するかもしれないかどうか明白でなく残ったが。MLT-827、MALT1 paracaspase 活動の強力かつ選択的な阻害剤を最近の証拠ことを示しますひと骨髄細胞における TLR 4 の下流 TNF 産 MALT1 TNF 産下流ではなく自己免疫-1 の独立 MALT1 であります。依存。ここでは、我々 はさらに、さまざまな人間とマウス細胞製剤と自己免疫 1、MINCLE または TLR 4 経路の刺激を使用してパターン認識における MALT1 の選択的関与に対処。サイトカイン TNF-を超えてあり、MLT 827 SYK 阻害剤 (Cpd11)、IKK 阻害剤 (AFN700) を比較することによって、我々 はまた追加の洞察力を提供しました。総称して、提供されたデータがさらに MALT1 C 型レクチン様受容体依存性の証拠-対照的に TLR シグナルをシグナリングします。

骨髄細胞における MALT1 自己免疫 1、ヒトデクチン 2、MINCLE6など、いくつかの C 型レクチン様受容体活性化シグナルを下流に中継します。(裾) ITAM モチーフ含んでいる受容体に依存してこれらの経路 (例えば,自己免疫 1) または ITAM モチーフを含む共同受容体 (例えば, FcRγ、ヒトデクチン 2、MINCLE の) 募集、SYK キナーゼ (図 1...

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Myeloid Innate Signaling Pathway Regulation by MALT1 Paracaspase Activity

MALT1 免疫を調節するが、不明確のままどのようにこれが発生します。MALT1 の生得的なシグナリング Toll 様や C 型レクチン様受容体、MALT1 が骨髄性サイトカインの生産を調節することを示すの下流と下流への貢献を解明する選択的 MALT1 paracaspase 阻害剤 MLT 827 を使いました。C 型レクチン様受容体の選択的に。

MALT1 Paracaspase 活動による骨髄性生得的なシグナル伝達経路制御

Besides its function in lymphoid cells, which has been addressed by numerous studies, the paracaspase MALT1 also plays an important role in innate cells ...

そこで、私たちの原稿の方法の目的は、ヒトとマウスのシステムを用いて骨髄細胞のシグナル経路の比較分析を提供することです。これは、選択されたパターン認識受容体の下流に関与するシグナル経路を定義するのに役立ちます。したがって、このメソッドは実装が簡単です。これは、シグナル伝達機構の解明に不可欠な一次細胞製剤および検証された基準化合物に依存しています。この手順を実証するのは、ラティバ・トゥイールとアデリーン・ウンテライナー、それぞれ私たちのグループの科学者と研究員です。ラミナーフローフードでは、無菌のハサミ、1リットルのビーカー、ビニール袋をセットしました。以前に入手したバフィーコートをビーカーに入れ、はさみを使用して慎重に開きます。25 mm ピペットを使用して、EDTA の 2 ミリモルを添加した PBS の 100 ml を追加します。ゆっくりと上下にピペットで混ぜます。そして、希釈したバフィーコートの25mlを、それぞれ15mlの多糖ベースの密度勾配で予め充填された6つの50ml円錐遠心管に移す。チューブを800gで20分間遠心分離し、その密度に基づいて細胞を分離できるように、休憩なしで適度な加速を行います。遠心分離後、赤血球と顆粒球を含むペレット、血漿で作られた上層、および末梢血単核細胞を含む白い環が見える。PBMCリングを収穫し、新しい50 mlの管にそれらを移すために10 mlのピペットを使用してください。PBSとEDTAでトップアップ。テキスト プロトコルで説明されているように、遠心時間と速度を減少させる 3 つの連続したのスケーションを実行します。最後の洗浄後、25mlの氷冷ライシスバッファーでペレットを再懸濁し、浸透圧で赤血球を分解します。溶液が明らかになるまで室温でインキュベートする。その後、25mlの分離バッファーを加え、反応を停止します。遠心分離機を150gで8分間洗浄し、溶液を洗浄する。上清を注ぎ、分離バッファーでペレットを再懸濁します。細胞を数えた後、1ウェルあたり12,500細胞まで培養培地で希釈する。384ウェルプレートの各ウェルにこの細胞懸濁液の30 mlを配布します。次に、各ウェルに4倍の濃縮化合物溶液の15マイクロリットルを加え、1時間5%の二酸化炭素で摂氏37度でプレートを前キューバベートします。必要に応じて、 LPS を 1 ml あたり 1 ng の最終濃度に追加するか、または 1ml あたり 100 mcg の最終濃度に Zymosan を枯渇させた。その後、5%の二酸化炭素で摂氏37度で一晩プレートをインキュベートします。翌日は、分泌されたTNFアルファレベルを測定するために上清の10マイクロリットルを取る。シリアル希釈を開始するには、MLT-827ストック溶液を培地で希釈し、一度に8マイクロモルの濃度に達します。0.08%DMSOの培地を使用して、6ステップ1:5シリアル希釈を行います。単回投与試験の準備のために、MLT-827、AFN700、および化合物11ストック溶液を培地で希釈し、一度に4マイクロモル濃度に達する。まず、枯渇したZymosanの10mgに無菌内毒素フリー水2mlを加えます。このストック溶液を均質化するボルテックス。溶液をアリコートし、その後、摂氏20度でアリコートを保存します。本研究では、ヒトPBMCsおよびマウス脾臓細胞は、枯渇したZymosan、デクチン-1アゴニスト、またはリポ多糖(TL4アゴニスト)のいずれかで刺激される。上清中のNTNFα放出は、20時間後に測定される。ヒトとマウスの両方のアッセイにおいて、MLT-827化合物は、Dectin-1経路によって駆動されるTNFアルファ産生を選択的にブロックするが、TLR4経路によってはブロックしない。LPSで刺激された単球では、TNFアルファの産生はほぼ完全にAFN700によって除化されるが、それはTLR4経路のNF-κB活性への依存性およびSIC活性への依存性と一致するCpd11に敏感ではない。対照的に、Dectin-1およびMODが駆動するTNFアルファ産生は、MLT-827、AFN700、およびCpd11に対する感受性を示す。これは、Dectin-1経路におけるSIC CBMシグナル伝達カスケードの関与に関するさらなる証拠を提供する。IL-1 β、IL-6、およびIL-23の産生は、3つの阻害剤にも敏感であり、TNFアルファに類似した調節機構を示す。しかし、IL-8の産生に見られる限られた効果は、このサイトカインが明確な調節メカニズムを有することを示唆している。トレハロース-ジベヘン酸濃度を1ml当たり50mcg以上に上げると、MLT-827のブロッキング効果に応じてMALT1パラカスパーゼ活性に依存していたTNFアルファ、IL-6、IL-1ベータの産生が可能です。同様の結果は、デクチン-1を刺激するために枯渇したZymosanの濃度を増加させるとモッズに挑戦したときに見られました。この方法により、パラカスパーゼMALT1がC型レクチン様受容体シグナル伝達を選択的に調節することを示すことを可能にした。それは、よく特徴付け参照化合物を使用することが不可欠です。ストックソリューションの希釈手順に注意してください。これは、限られた溶解性を有する化合物にとって重要である。

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Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

2 - dGuo処理した胸腺器官培養の準備

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

の解剖と染色ショウジョウバエ幼虫卵巣

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

血管のCaの可視化 2 +パラクリン派生ROSをきっかけにシグナリング

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

リボソーム結合したポリペプチドを単離するためのツールと​​してSECM逮捕シーケンスを使用して、

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

発現クローニングによりGrb2のシグナル伝達複合体を研究するために高コンテンツイメージングワークフロー

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

遺伝子調節の1分子蛍光イメージング<emインビボ&gt;</em&gt;開裂により同時翻訳アクティベーションの使用（CoTrAC）

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

細胞単層に機械的刺激によって誘発されるカルシウム波の伝播：ウシ角膜内皮細胞の例

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

比較プロテオーム解析のための代謝標識および膜分画<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;サスペンション細胞培養

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...