Name: myeloid innate signaling pathway regulation by malt1 paracaspase activity
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Myeloid Innate Signaling Pathway Regulation by MALT1 Paracaspase Activity at JoVE.com

Vi takker Elsevier om deres tillatelse (med lisens antallet 4334770630127) til å gjengi her figur 2A fra Unterreiner et al. (2017).

Eksperimenter ble utført i henhold til retningslinjer og standarder for etikk for Novartis menneskelige forskning.
1. forberedelse til perifert blod mononukleære celler (PBMCs) fra menneskelig Buffy strøk
Merk: Vi fikk buffy strøk fra friske frivillige dagen etter samling, i 50 mL poser. De ble gitt under samtykke og samles inn gjennom Interregionale Blutspende Schweizeriches Rotes Kreuz. Vi behandlet dem ved hjelp av fremgangsmåten nede...

<ol>
	<li>Coornaert, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+antigen+receptor+stimulation+induces+MALT1+paracaspase-mediated+cleavage+of+the+NF-kappaB+inhibitor+A20.">T cell antigen receptor stimulation induces MALT1 paracaspase-mediated cleavage of the NF-kappaB inhibitor A20.</a> Nature immunology. 9 (3), 263-271 (2008).</li><li>Rebeaud, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proteolytic+activity+of+the+paracaspase+MALT1+is+key+in+T+cell+activation.">The proteolytic activity of the paracaspase MALT1 is key in T cell activation.</a> Nature immunology. 9 (3), 272-281 (2008).</li><li>Jaworski, M., Thome, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+paracaspase+MALT1:+Biological+function+and+potential+for+therapeutic+inhibition.">The paracaspase MALT1: Biological function and potential for therapeutic inhibition.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (3), 459-473 (2016).</li><li>Meininger, I., Krappmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+signaling+and+activation+by+the+CARMA1-BCL10-MALT1+signalosome.">Lymphocyte signaling and activation by the CARMA1-BCL10-MALT1 signalosome.</a> Biological Chemistry. 397 (12), 1315-1333 (2016).</li><li>Qiao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+architecture+of+the+CARMA1/Bcl10/MALT1+signalosome:+nucleation-induced+filamentous+assembly.">Structural architecture of the CARMA1/Bcl10/MALT1 signalosome: nucleation-induced filamentous assembly.</a> Molecular cell. 51 (6), 766-779 (2013).</li><li>Gross, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Card9+controls+a+non-TLR+signalling+pathway+for+innate+anti-fungal+immunity.">Card9 controls a non-TLR signalling pathway for innate anti-fungal immunity.</a> Nature. 442 (7103), 651-656 (2006).</li><li>Chiffoleau, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-type+lectin-like+receptors+as+emerging+orchestrators+of+sterile+inflammation+represent+potential+therapeutic+targets.">C-type lectin-like receptors as emerging orchestrators of sterile inflammation represent potential therapeutic targets.</a> Frontiers in Immunology. 9 (FEB), 1-9 (2018).</li><li>Taylor, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dectin-1+is+required+for+beta-glucan+recognition+and+control+of+fungal+infection.">Dectin-1 is required for beta-glucan recognition and control of fungal infection.</a> Nature Immunology. 8 (1), 31-38 (2007).</li><li>Lanternier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+immunodeficiencies+underlying+fungal+infections.">Primary immunodeficiencies underlying fungal infections.</a> Current opinion in pediatrics. 25 (6), 736-747 (2013).</li><li>Thome, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+roles+for+MALT1+in+T-cell+activation.">Multifunctional roles for MALT1 in T-cell activation.</a> Nature reviews. Immunology. 8 (7), 495-500 (2008).</li><li>Unterreiner, A., Stoehr, N., Huppertz, C., Calzascia, T., Farady, C. J., Bornancin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+MALT1+paracaspase+inhibition+does+not+block+TNF-&#945;+production+downstream+of+TLR-4+in+myeloid+cells.">Selective MALT1 paracaspase inhibition does not block TNF-&#945; production downstream of TLR-4 in myeloid cells.</a> Immunology Letters. , 48-51 (2017).</li><li>Strasser, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syk+Kinase-Coupled+C-type+Lectin+Receptors+Engage+Protein+Kinase+C-&#x3B4;+to+Elicit+Card9+Adaptor-Mediated+Innate+Immunity.">Syk Kinase-Coupled C-type Lectin Receptors Engage Protein Kinase C-&#x3B4; to Elicit Card9 Adaptor-Mediated Innate Immunity.</a> Immunity. 36 (1), 32-42 (2012).</li><li>Jaworski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malt1+protease+inactivation+efficiently+dampens+immune+responses+but+causes+spontaneous+autoimmunity.">Malt1 protease inactivation efficiently dampens immune responses but causes spontaneous autoimmunity.</a> The EMBO journal. 33 (23), 2765-2781 (2014).</li><li>Yu, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALT1+protease+activity+is+required+for+innate+and+adaptive+immune+responses.">MALT1 protease activity is required for innate and adaptive immune responses.</a> PLoS ONE. 10 (5), 1-20 (2015).</li><li>Bardet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+T-cell+fingerprint+of+MALT1+paracaspase+revealed+by+selective+inhibition.">The T-cell fingerprint of MALT1 paracaspase revealed by selective inhibition.</a> Immunology and Cell Biology. 96 (1), 81-99 (2018).</li><li>Thoma, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+profiling+of+a+selective+and+efficacious+syk+inhibitor.">Discovery and profiling of a selective and efficacious syk inhibitor.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 58 (4), 1950-1963 (2015).</li><li>Bauer, B., Steinle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HemITAM:+A+single+tyrosine+motif+that+packs+a+punch.">HemITAM: A single tyrosine motif that packs a punch.</a> Science Signaling. 10 (508), 1-10 (2017).</li><li>Gringhuis, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+c-Rel+activation+via+Malt1+controls+anti-fungal+TH-17+immunity+by+dectin-1+and+dectin-2.">Selective c-Rel activation via Malt1 controls anti-fungal TH-17 immunity by dectin-1 and dectin-2.</a> PLoS Pathogens. 7 (1), (2011).</li><li>Dufner, A., Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell+antigen+receptor-induced+activation+of+an+IRAK4-dependent+signaling+pathway+revealed+by+a+MALT1-IRAK4+double+knockout+mouse+model.">B cell antigen receptor-induced activation of an IRAK4-dependent signaling pathway revealed by a MALT1-IRAK4 double knockout mouse model.</a> Cell Communication and Signaling. 9 (1), 6 (2011).</li><li>Phelan, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiprotein+supercomplex+controlling+oncogenic+signalling+in+lymphoma.">A multiprotein supercomplex controlling oncogenic signalling in lymphoma.</a> Nature. , (2018).</li></ol>

I dette arbeidet brukte vi enkle eksperimentelle innstillinger å studere signalveier i menneskelig og mus medfødte celler, og avhøre avhengigheten MALT1 proteolytisk funksjonen. Utvide på tidligere arbeid11, viste vår studie at MALT1 paracaspase aktivitet styrer C-type Lektiner-like reseptor indusert cytokin produksjon, inkludert TNF-α. Derimot var TLR-4-indusert TNF-α uavhengig av MALT1 i begge arter. Samlet bekreftet disse data nøkkel og selektivt bidrag av MALT1/CBM signalosome nedstrø...

Paracaspase aktiviteten til MALT1 (Mucosa-assosiert lymfoid vev lymfom translokasjon protein 1) ble avslørt i 20081,2. Siden da har en rekke studier rapportert sitt viktige bidrag til antigen reseptor svar i lymfocytter. Genetisk modeller i musen samt farmakologi dataene støtter en nøkkelrolle i T-celler, T-celle avhengige autoimmunitet og B-celle lymfom innstillinger3,4. Lymfocytter, MALT1 paracaspase aktivisering oppstår ved montering av CARD11-BCL10-MALT1 komplekse5, som utløses av antigen-reseptor proksimale signalering nedstrøms T - eller B-celle reseptor. Det er også rikelig bevis for at en lignende CARD9-BCL10-MALT1-komplekset er viktig for å spre signaler nedstrøms av C-type Lektiner-like reseptorer (CLLR), f.eks, Dectin-1, Dectin-2 og MINCLE i myeloide celler6,7. Dectin-1 har vært spesielt godt studert fordi denne veien er avgjørende for vert forsvar mot soppinfeksjoner8,9. Implikasjonen av MALT1 i Toll-like reseptor (TLR) veier, men har vært kontroversielle10. Nyere bevis i menneskelige myeloide celler beherske ut en direkte rolle for MALT1 paracaspase aktivitet i regulering av TNF-produksjon nedstrøms TLR-4-11.
I den nåværende arbeidet brukt vi ulike eksperimentelle innstillinger og stimulerende forhold i menneskelig og mus myeloide celler for å undersøke medfødte signalveier, avhengig av spesifikke farmakologiske verktøyet hemmere og måling av cytokiner produksjonen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 &#181;m nylon cell strainer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS431752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 ml Falcon tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plates</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat-bottom plate, with low evaporation lid</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well V-bottom plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>734-1798</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride - NH4Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay diluent RD1-W ELISA</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>895038</td>
			<td>Assay diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture microplate, 384 well, black</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>781986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depleted Zymosan</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>tlrl-dzn</td>
			<td>now: tlrl-zyd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td>DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA-Na2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA muTNF-&#945;</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>SMTA00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C tubes</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS dissociator</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM-CSF</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTRF hu IL-23</td>
			<td>CisBio</td>
			<td>62HIL23PEG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTRF hu TNF-&#945;</td>
			<td>CisBio</td>
			<td>62TNFPEC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTRF reconstitution buffer</td>
			<td>CisBio</td>
			<td>62RB3RDE</td>
			<td>50mM Phosphate buffer, pH 7.0, 0.8M KF, 0.2% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-&#947;</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>L4516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-4</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>Forene</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides (LPS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4391</td>
			<td>LPS used in human samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4516</td>
			<td>LPS used in murine samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis buffer</td>
			<td>Self-made</td>
			<td>-</td>
			<td>155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 1 mM EDTA, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnet</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>18001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, 384 well white</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>784075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monocytes enrichment kit</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>19059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Mr. Frosty Cryo 1 &#176;C Freezing Container</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>cooling device (containing Propanol-2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x pH 7.4 [-] CaCl2 [-] MgCl2</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010</td>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td>Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium bicarbonate - KHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrestoBlue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A13262</td>
			<td>Resazurin solution for viability assessment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propanol-2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.09634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Read buffer</td>
			<td>MesoScale Discovery</td>
			<td>R92TC-3</td>
			<td>Tris-based buffer containing tripropylamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery cell culture freezing medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12648-010</td>
			<td>freezing medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) with Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61870</td>
			<td>+ 10% FBS for iMoDCs 
			+ 10% FBS + 1 mM Sodium Pyruvate + 100 U/mL Pen/Strep + 5 &#181;M &#946;-mercaptoethanol for human PBMCs and monocytes 
			+ 10% FBS + Pen/Strep + 5 &#181;M &#946;-mercaptoethanol for murine splenocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separation buffer</td>
			<td>Self-made</td>
			<td>-</td>
			<td>PBS pH 7.4 + 2% FBS + 1 mM EDTA pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trehalose-6,6-dibehenate</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>tlrl-tdb</td>
			<td>TDB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7949</td>
			<td>Polysorbate 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5 M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15675</td>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viewseal sealer</td>
			<td>Greiner BioOne</td>
			<td>676070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-PLEX Proinflammatory Panel 1 Human Kit</td>
			<td>MesoScale Discovery</td>
			<td>K15049D</td>
			<td>electrochemiluminescent multiplex assay (IL-1&#946;, TNF-&#945;, IL-6, IL-8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

myeloid innate signaling pathway regulation by malt1 paracaspase activity

Foruten dens funksjon i lymfoide celler, som er rettet av en rekke studier, spiller paracaspase MALT1 også en viktig rolle i medfødte cellene nedstrøms i mønster anerkjennelse reseptorer. Best studerte er Dectin-1 og Dectin-2 medlemmer av C-type Lektiner-like reseptor familien som induserer en SYK - og CARD9-avhengige signalering gjennomgripende fører til NF-κB aktivisering, på en måte som MALT1-avhengige. I motsetning Toll-like reseptorer (TLR), for eksempel TLR-4, overføre NF-κB aktivisering men signalet via en MYD88/IRAK-avhengige cascade. Likevel har om MALT1 kan bidra til TLR-4 signalering forblitt uklart. Nyere bevis med MLT-827, en potent og selektiv hemmer MALT1 paracaspase aktivitet, angir at TNF-produksjon nedstrøms av TLR-4 i menneskelige myeloide celler er uavhengig av MALT1, i motsetning til TNF-produksjon nedstrøms av Dectin-1, som er MALT1 avhengige. Her behandlet vi selektiv involvering av MALT1 i mønstergjenkjenning sensing videre, ved hjelp av en rekke menneskelige og mus mobilnettet forberedelser og stimulering av Dectin-1, MINCLE eller TLR-4. Vi har også gitt ytterligere innsikt ved å utforske cytokiner TNF- og sammenligne MLT-827 en SYK hemmer (Cpd11) og en IKK inhibitor (AFN700). Kollektivt, oppgitt ytterligere bevis for MALT1-avhengigheten av C-type Lektiner-like reseptor-signalisering derimot til TLR-signalisering.

I myeloide celler reléer MALT1 aktivisering signalene nedstrøms flere C-type Lektiner-like reseptorer, for eksempel Dectin-1, Dectin-2 og MINCLE6. Disse veiene avhengige (hem) ITAM motiv inneholder reseptorer (f.eks, Dectin-1) eller ITAM motiv inneholder co reseptorer (f.eks, FcRγ, for Dectin-2 og MINCLE) som rekruttere og aktivere forhold kinase (figur 1). Dette fører til aktivering av et protein kinase C isoform...

Watch this Scientific Journal Video about Myeloid Innate Signaling Pathway Regulation by MALT1 Paracaspase Activity at JoVE.com

Myeloid Innate Signaling Pathway Regulation by MALT1 Paracaspase Activity

MALT1 regulerer medfødt immunitet men hvordan dette skjer fortsatt dårlig definerte. Vi brukte den selektive MALT1 paracaspase inhibitor MLT-827 for å rakne bidraget fra MALT1 til medfødte signalering nedstrøms Toll-like eller C-type Lektiner-like reseptorer, viser at MALT1 regulerer produksjonen av myelogen cytokiner, og nedstrøms av C-type Lektiner-like reseptorer, selektivt.

Myeloid medfødte signalnettverk Pathway regulering av MALT1 Paracaspase aktivitet

Besides its function in lymphoid cells, which has been addressed by numerous studies, the paracaspase MALT1 also plays an important role in innate cells ...

Så målet med metoden i vårt manuskript er å gi komparativ analyse av signalveier i myeloide celler ved hjelp av menneskelige og musesystemer. Det bidrar til å definere hvilken signalvei som er involvert nedstrøms av utvalgte mønstergjenkjenningsreseptorer. Så denne metoden er enkel å implementere.Det er avhengig av primære cellepreparater og validerte referanseforbindelser, noe som er avgjørende for oppklaring av signalmekanismer. Å demonstrere prosedyren vil være Henholdsvis Ratiba Touil og Adeline Unterreiner, henholdsvis forsker og forskningsmedarbeider i vår gruppe. I en laminær strømningshette satt ut en steril saks, en liter beger og en plastpose.Plasser den tidligere oppnådde buffy pelsen i begeret og bruk saksen til å åpne den forsiktig. Bruk en 25 mm pipette tilsett 100 ml PBS supplert med 2 millimolar EDTA. Bland ved å sakte pipettering opp og ned.Og deretter overføre 25 ml av fortynnet buffy pels i seks 50 ml koniske sentrifuge rør som hver er forhåndsfylt med 15 ml polysakkarid basert tetthet gradient. Sentrifuger rørene i 20 minutter ved 800 g med moderat akselerasjon uten pause for å tillate separasjon av celler basert på deres tettheter. Etter sentrifugering tre lag vil være synlig, en pellet som inneholder røde blodlegemer og granulocytter, et øvre lag laget av plasma, og en hvit ring som inneholder perifere blod mononukleære celler.Bruk en 10 ml pipette til å høste PBMC-ringene og overfør dem til et nytt 50 ml rør. På topp med PBS og EDTA. Utfør tre påfølgende vasker med redusert sentrifugeringstid og -hastighet som beskrevet i tekstprotokollen.Etter den siste vasken, resuspend pellet i 25 ml iskald lysis buffer for å lyse de røde blodlegemene ved osmotisk trykk. Inkuber løsningen ved romtemperatur til den blir klar. Tilsett deretter 25 ml separasjonsbuffer for å stoppe reaksjonen.Sentrifuge ved 150 g i åtte minutter for å vaske oppløsningen. Hell av den overnaturlige og resuspend pellet med separasjonbuffer. Etter å ha talt cellene, fortynne dem i kulturmedium ned til 12 500 celler per brønn.Fordel 30 ml av denne cellefjæringen i hver brønn av en 384 brønnplate. Deretter legger du til 15 mikroliter av fire ganger konsentrerte sammensatte løsninger til hver brønn og forhåndsdesinfnerer platen ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid i en time. Hvis ønskelig, legg enten LPS til endelig konsentrasjon på 1 ng per ml eller utarmet Zymosan til en endelig konsentrasjon på 100 mcg per ml.Deretter inkubere platen over natten ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid. Neste dag tar 10 mikroliter av supernatant for å måle utskillede TNF alfa nivåer. For å starte seriefortynningen, fortynne MLT-827 lagerløsningen med medium for å nå en konsentrasjon på 8 mikromos på en gang.Utfør en sekstrinns 1:5 seriell fortynning ved hjelp av medium med 0,08%DMSO. For å forberede seg på enkeltdosetester, fortynne MLT-827, AFN700 og sammensatte 11 lagerløsninger med medium for å nå en konsentrasjon på 4 mikromos på en gang. Tilsett først 2 ml sterilt endotoksinfritt vann til 10 mg utarmet Zymosan.Vortex denne lagerløsningen for å homogenisere den. Aliquot løsningen og deretter lagre aliquots på 20 grader Celsius. I denne studien stimuleres menneskelige PBMCer og mus miltceller med enten utarmet Zymosan, en Dectin-1 agonist, eller lipopolysakkarid, en TL4 agonist.NTNF alfautgivelse i supernatanten måles etter 20 timer. I både menneskelige og mus analyserer MLT-827 sammensatt selektivt TNF alfa produksjon drevet av Dectin-1 banen, men ikke av TLR4 banen. I monocytter stimulert med LPS, produksjon av TNF alfa er nesten helt avskaffet av AFN700, men det er ikke følsomt for Cpd11, som er i samsvar med TLR4 banens avhengighet av NF-kappa B aktivitet og dens avhengighet av SIC aktivitet.I motsetning TNF alfa produksjon drevet av Dectin-1 og MODCs viser følsomhet for MLT-827, AFN700, og Cpd11. Dette gir ytterligere bevis for involvering av en SIC CBM signalkaskade i Dectin-1 banen. Produksjon av IL-1 beta, IL-6 og IL-23 er også følsom for de tre hemmerne, noe som indikerer regulatoriske mekanismer som ligner på TNF alfa.Den begrensede effekten sett på produksjonen av IL-8 tyder imidlertid på at denne cytokinen har en distinkt regulatorisk mekanisme. Heve trehalose-dibehenate konsentrasjoner over 50 mcg per ml fører til produksjon av TNF alfa, IL-6, og IL-1 beta, som stolte på MALT1 paracaspase aktivitet i henhold til blokkering effekten av MLT-827. Lignende resultater ble sett når utfordrende MODCs med økende konsentrasjoner av utarmet Zymosan å stimulere Dectin-1.Denne metoden gjorde det mulig å vise at paracaspase MALT1 selektivt regulerer C-type lectin-lignende reseptorsignalering. Det er viktig å bruke godt karakteriserte referanseforbindelser. Vær oppmerksom på prosedyren for fortynning av lagerløsninger.Dette er avgjørende for sammensatt med begrenset løselighet.

Research

JoVE Journal

Biology

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

Reaggregate Thymus Cultures

Stromal cells within lymphoid tissues are organized into three-dimensional structures that provide a scaffold that is thought to control the migration and ...

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Visualisering av Vaskulær Ca 2 + Signaling Utløst av parakrine Avledet ROS

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Bruke SecM Arrest sekvens som et verktøy for å isolere ribosom Innbundne polypeptider

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

En High-innhold Imaging arbeidsflyt for å studere Grb2 signalveier Komplekser av Expression kloning

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

Enkelt-molekyl Imaging of Gene Regulation<em&gt; In vivo</em&gt; Ved hjelp av Cotranslational Aktivering av Cleavage (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Mekanisk stimulering-indusert Kalsium wave forplantning i cellemonolagene: The Eksempel på storfe Hornhinnen endotelceller

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabolsk Merking og Membran Fraksjone for komparativ proteomikk analyser av<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Suspension cellekulturer

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...