Name: myeloid innate signaling pathway regulation by malt1 paracaspase activity
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Myeloid Innate Signaling Pathway Regulation by MALT1 Paracaspase Activity at JoVE.com

Vi tackar Elsevier om deras tillstånd (licens antal 4334770630127) att återge här figur 2A från Unterreiner et al. (2017).

Experiment utfördes enligt de riktlinjer och normer av Novartis mänsklig forskning etikkommittén.
1. beredning av perifera mononukleära blodceller (PBMC) från mänskliga Buffy rockar
Obs: Vi fick buffy rockar från friska frivilliga en dag efter insamling, i 50 mL påsar. De var enligt informerat samtycke och som samlats in genom den Interregionale Blutspende Schweizeriches Rotes Kreuz. Vi hanterat dem med hjälp av proceduren nedan, vid...

<ol>
	<li>Coornaert, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+antigen+receptor+stimulation+induces+MALT1+paracaspase-mediated+cleavage+of+the+NF-kappaB+inhibitor+A20.">T cell antigen receptor stimulation induces MALT1 paracaspase-mediated cleavage of the NF-kappaB inhibitor A20.</a> Nature immunology. 9 (3), 263-271 (2008).</li><li>Rebeaud, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proteolytic+activity+of+the+paracaspase+MALT1+is+key+in+T+cell+activation.">The proteolytic activity of the paracaspase MALT1 is key in T cell activation.</a> Nature immunology. 9 (3), 272-281 (2008).</li><li>Jaworski, M., Thome, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+paracaspase+MALT1:+Biological+function+and+potential+for+therapeutic+inhibition.">The paracaspase MALT1: Biological function and potential for therapeutic inhibition.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (3), 459-473 (2016).</li><li>Meininger, I., Krappmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+signaling+and+activation+by+the+CARMA1-BCL10-MALT1+signalosome.">Lymphocyte signaling and activation by the CARMA1-BCL10-MALT1 signalosome.</a> Biological Chemistry. 397 (12), 1315-1333 (2016).</li><li>Qiao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+architecture+of+the+CARMA1/Bcl10/MALT1+signalosome:+nucleation-induced+filamentous+assembly.">Structural architecture of the CARMA1/Bcl10/MALT1 signalosome: nucleation-induced filamentous assembly.</a> Molecular cell. 51 (6), 766-779 (2013).</li><li>Gross, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Card9+controls+a+non-TLR+signalling+pathway+for+innate+anti-fungal+immunity.">Card9 controls a non-TLR signalling pathway for innate anti-fungal immunity.</a> Nature. 442 (7103), 651-656 (2006).</li><li>Chiffoleau, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-type+lectin-like+receptors+as+emerging+orchestrators+of+sterile+inflammation+represent+potential+therapeutic+targets.">C-type lectin-like receptors as emerging orchestrators of sterile inflammation represent potential therapeutic targets.</a> Frontiers in Immunology. 9 (FEB), 1-9 (2018).</li><li>Taylor, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dectin-1+is+required+for+beta-glucan+recognition+and+control+of+fungal+infection.">Dectin-1 is required for beta-glucan recognition and control of fungal infection.</a> Nature Immunology. 8 (1), 31-38 (2007).</li><li>Lanternier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+immunodeficiencies+underlying+fungal+infections.">Primary immunodeficiencies underlying fungal infections.</a> Current opinion in pediatrics. 25 (6), 736-747 (2013).</li><li>Thome, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+roles+for+MALT1+in+T-cell+activation.">Multifunctional roles for MALT1 in T-cell activation.</a> Nature reviews. Immunology. 8 (7), 495-500 (2008).</li><li>Unterreiner, A., Stoehr, N., Huppertz, C., Calzascia, T., Farady, C. J., Bornancin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+MALT1+paracaspase+inhibition+does+not+block+TNF-&#945;+production+downstream+of+TLR-4+in+myeloid+cells.">Selective MALT1 paracaspase inhibition does not block TNF-&#945; production downstream of TLR-4 in myeloid cells.</a> Immunology Letters. , 48-51 (2017).</li><li>Strasser, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syk+Kinase-Coupled+C-type+Lectin+Receptors+Engage+Protein+Kinase+C-&#x3B4;+to+Elicit+Card9+Adaptor-Mediated+Innate+Immunity.">Syk Kinase-Coupled C-type Lectin Receptors Engage Protein Kinase C-&#x3B4; to Elicit Card9 Adaptor-Mediated Innate Immunity.</a> Immunity. 36 (1), 32-42 (2012).</li><li>Jaworski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malt1+protease+inactivation+efficiently+dampens+immune+responses+but+causes+spontaneous+autoimmunity.">Malt1 protease inactivation efficiently dampens immune responses but causes spontaneous autoimmunity.</a> The EMBO journal. 33 (23), 2765-2781 (2014).</li><li>Yu, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALT1+protease+activity+is+required+for+innate+and+adaptive+immune+responses.">MALT1 protease activity is required for innate and adaptive immune responses.</a> PLoS ONE. 10 (5), 1-20 (2015).</li><li>Bardet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+T-cell+fingerprint+of+MALT1+paracaspase+revealed+by+selective+inhibition.">The T-cell fingerprint of MALT1 paracaspase revealed by selective inhibition.</a> Immunology and Cell Biology. 96 (1), 81-99 (2018).</li><li>Thoma, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+profiling+of+a+selective+and+efficacious+syk+inhibitor.">Discovery and profiling of a selective and efficacious syk inhibitor.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 58 (4), 1950-1963 (2015).</li><li>Bauer, B., Steinle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HemITAM:+A+single+tyrosine+motif+that+packs+a+punch.">HemITAM: A single tyrosine motif that packs a punch.</a> Science Signaling. 10 (508), 1-10 (2017).</li><li>Gringhuis, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+c-Rel+activation+via+Malt1+controls+anti-fungal+TH-17+immunity+by+dectin-1+and+dectin-2.">Selective c-Rel activation via Malt1 controls anti-fungal TH-17 immunity by dectin-1 and dectin-2.</a> PLoS Pathogens. 7 (1), (2011).</li><li>Dufner, A., Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell+antigen+receptor-induced+activation+of+an+IRAK4-dependent+signaling+pathway+revealed+by+a+MALT1-IRAK4+double+knockout+mouse+model.">B cell antigen receptor-induced activation of an IRAK4-dependent signaling pathway revealed by a MALT1-IRAK4 double knockout mouse model.</a> Cell Communication and Signaling. 9 (1), 6 (2011).</li><li>Phelan, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiprotein+supercomplex+controlling+oncogenic+signalling+in+lymphoma.">A multiprotein supercomplex controlling oncogenic signalling in lymphoma.</a> Nature. , (2018).</li></ol>

I detta arbete använde vi enkla experimentella inställningar att studera signalvägar i mänskliga och mus medfödda celler och förhöra sitt beroende MALT1 proteolytiska funktion. Expanderande på föregående arbete11, visade vår studie att MALT1 paracaspase aktivitet styr typ C lektin-like receptor inducerad cytokin produktion, inklusive TNF-α. Däremot var TLR-4-inducerad TNF-α oberoende av MALT1 hos båda arterna. Sammantaget bekräftas dessa uppgifter den MALT1/CBM signalosome nedströ...

Paracaspase aktiviteten av MALT1 (Mucosa-associerade lymfoida vävnad lymfom translokation protein 1) avslöjades i 20081,2. Sedan dess har har ett antal studier rapporterat sitt kritiska bidrag till antigen receptorn svaren i lymfocyter. Genetiska modeller i musen samt farmakologi data stödjer en nyckelroll i T-celler, T-cells beroende autoimmunitet och B-cells lymfom inställningar3,4. I lymfocyter, MALT1 paracaspase aktivering sker vid montering av en CARD11-BCL10-MALT1 komplexa5, som utlöses av antigen-receptor proximala signalering nedströms av T - eller B-cells receptor. Det finns också gott om bevis för att en liknande CARD9-BCL10-MALT1 komplexet är viktigt för föröknings signaler nedströms av typ C lektin-liknande receptorer (Fullmäktigeledamot), e.g., Dectin-1, Dectin-2 och MINCLE i myeloida celler6,7. Dectin-1 har studerats särskilt väl då denna väg är kritisk för värd försvar mot svampinfektioner8,9. Innebörden av MALT1 i Toll-liknande receptorer (TLR) vägar, dock förblivit kontroversiell10. Senaste rönen i mänskliga myeloida celler uteslutit en direkt roll för MALT1 paracaspase aktivitet i regleringen av TNF-produktion nedströms av TLR-411.
I den nuvarande arbetet använde vi olika experimentella inställningarna och stimulerande förhållanden i mänskliga och mus myeloida celler sond medfödda signalvägar, förlitar sig på specifika farmakologiska verktyg-hämmare och mätning av cytokin produktion.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 &#181;m nylon cell strainer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS431752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 ml Falcon tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plates</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat-bottom plate, with low evaporation lid</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well V-bottom plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>734-1798</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride - NH4Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay diluent RD1-W ELISA</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>895038</td>
			<td>Assay diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture microplate, 384 well, black</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>781986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depleted Zymosan</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>tlrl-dzn</td>
			<td>now: tlrl-zyd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td>DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA-Na2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA muTNF-&#945;</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>SMTA00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C tubes</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS dissociator</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM-CSF</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTRF hu IL-23</td>
			<td>CisBio</td>
			<td>62HIL23PEG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTRF hu TNF-&#945;</td>
			<td>CisBio</td>
			<td>62TNFPEC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTRF reconstitution buffer</td>
			<td>CisBio</td>
			<td>62RB3RDE</td>
			<td>50mM Phosphate buffer, pH 7.0, 0.8M KF, 0.2% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-&#947;</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>L4516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-4</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>Forene</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides (LPS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4391</td>
			<td>LPS used in human samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4516</td>
			<td>LPS used in murine samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis buffer</td>
			<td>Self-made</td>
			<td>-</td>
			<td>155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 1 mM EDTA, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnet</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>18001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, 384 well white</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>784075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monocytes enrichment kit</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>19059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Mr. Frosty Cryo 1 &#176;C Freezing Container</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>cooling device (containing Propanol-2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x pH 7.4 [-] CaCl2 [-] MgCl2</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010</td>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td>Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium bicarbonate - KHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrestoBlue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A13262</td>
			<td>Resazurin solution for viability assessment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propanol-2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.09634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Read buffer</td>
			<td>MesoScale Discovery</td>
			<td>R92TC-3</td>
			<td>Tris-based buffer containing tripropylamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery cell culture freezing medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12648-010</td>
			<td>freezing medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) with Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61870</td>
			<td>+ 10% FBS for iMoDCs 
			+ 10% FBS + 1 mM Sodium Pyruvate + 100 U/mL Pen/Strep + 5 &#181;M &#946;-mercaptoethanol for human PBMCs and monocytes 
			+ 10% FBS + Pen/Strep + 5 &#181;M &#946;-mercaptoethanol for murine splenocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separation buffer</td>
			<td>Self-made</td>
			<td>-</td>
			<td>PBS pH 7.4 + 2% FBS + 1 mM EDTA pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trehalose-6,6-dibehenate</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>tlrl-tdb</td>
			<td>TDB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7949</td>
			<td>Polysorbate 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5 M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15675</td>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viewseal sealer</td>
			<td>Greiner BioOne</td>
			<td>676070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-PLEX Proinflammatory Panel 1 Human Kit</td>
			<td>MesoScale Discovery</td>
			<td>K15049D</td>
			<td>electrochemiluminescent multiplex assay (IL-1&#946;, TNF-&#945;, IL-6, IL-8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

myeloid innate signaling pathway regulation by malt1 paracaspase activity

Förutom sin funktion i lymfoida celler, som har behandlats av ett flertal studier, spelar paracaspase MALT1 också en viktig roll i medfödda celler nedströms mönster erkännande receptorer. Bäst studerade är Dectin-1 och Dectin-2 medlemmarna av familjen typ C lektin-like receptor som inducerar en SYK - och CARD9-beroende signalering kaskad leder till NF-κB aktivering, på ett sätt som MALT1-beroende. Däremot kan Toll-liknande receptorer (TLR), såsom TLR-4, sprida NF-κB aktiveringen utan signal via en MYD88/IRAK-beroende kaskad. Ändå, om MALT1 kan bidra till TLR-4 signalering har förblivit oklar. Senaste bevis med MLT-827, en potent och selektiv hämmare av MALT1 paracaspase aktivitet, indikerar att TNF-produktion nedströms av TLR-4 i mänskliga myeloida celler är oberoende av MALT1, i motsats till TNF-produktion nedströms Dectin-1, vilket är MALT1 beroende. Här tog vi upp MALT1 selektiv engagemang i mönsterigenkänning avkänning ytterligare, med hjälp av olika mänskliga och mus cellulära preparat, och stimulering av Dectin-1, MINCLE eller TLR-4 vägar. Vi gav också ytterligare insikter genom att utforska cytokiner bortom TNF-, och genom att jämföra MLT-827 till en SYK-hämmare (Cpd11) och en IKK hämmare (AFN700). Sammantaget kan informationen ytterligare bevis för MALT1-beroendet av typ C lektin-like receptor — signalering i motsats till TLR-signalering.

I myeloida celler reläer MALT1 aktiveringen signaler nedströms flera typ C lektin-liknande receptorer, såsom Dectin-1, Dectin-2 och MINCLE6. Dessa vägar är beroende av (nertill) ITAM motiv-innehållande receptorer (t.ex., Dectin-1) eller ITAM motiv-innehållande Co receptorer (t.ex., FcRγ, för Dectin-2 och MINCLE) som rekryterar och aktiverar den SYK kinase (figur 1). Detta leder till aktivering av ett protein ...

Watch this Scientific Journal Video about Myeloid Innate Signaling Pathway Regulation by MALT1 Paracaspase Activity at JoVE.com

Myeloid Innate Signaling Pathway Regulation by MALT1 Paracaspase Activity

MALT1 reglerar medfödd immunitet men hur detta sker är fortfarande oklara. Vi använde den selektiva MALT1 paracaspase hämmaren MLT-827 nysta MALT1 bidrag till medfödda signalering nedströms Toll-like eller C-typen lektin-liknande receptorer, visar att MALT1 reglerar produktionen av myeloisk cytokiner, och nedströms av C-typ lektin-liknande receptorer, selektivt.

Myeloisk medfödda signalering utbildningsavsnitt förordning av MALT1 Paracaspase aktivitet

Besides its function in lymphoid cells, which has been addressed by numerous studies, the paracaspase MALT1 also plays an important role in innate cells ...

Så syftet med metoden i vårt manuskript är att ge jämförande analys av signalvägar i myeloida celler med hjälp av mänskliga och mussystem. Det hjälper till att definiera vilken signaleringsväg som är involverad nedströms utvalda receptorer för igenkänning av mönster. Så denna metod är enkel att genomföra.Den bygger på primära cellberedningar och validerade referensföreningar, vilket är avgörande för att klarera signalmekanismer. Demonstrerar proceduren kommer att vara Ratiba Touil och Adeline Unterreiner, respektive forskare och forskarassistent i vår grupp. I en laminär flöde huva anges en steril sax, en en liter bägare, och en plastpåse.Placera den tidigare erhållna buffy pälsen i bägaren och använd saxen för att försiktigt öppna den. Använda en 25 mm pipett tillsätt 100 ml PBS kompletteras med 2 millimolar av EDTA. Blanda genom att långsamt pipettera upp och ner.Och överför sedan 25 ml av den utspädda buffy coat till sex 50 ml koniska centrifugrör som var och en har förfyllts med 15 ml polysackarid baserad densitetsgradient. Centrifugera rören i 20 minuter vid 800 g med måttlig acceleration utan paus för att möjliggöra separation av celler baserat på deras tätheter. Efter centrifugeringen tre skikt kommer att vara synlig, en pellet som innehåller röda blodkroppar och granulocyter, ett övre skikt av plasma, och en vit ring som innehåller perifert blod mononukleära celler.Använd en 10 ml-pipett för att skörda PBMC-ringarna och för över dem till ett nytt 50 ml-rör. Fylla på med PBS och EDTA. Utför tre på varandra följande tvättar med minskande centrifugeringstid och hastighet som beskrivs i textprotokollet.Efter den slutliga tvätten, resuspend pelleten i 25 ml iskall lysbuffert för att lysa de röda blodkropparna genom osmotisk tryck. Inkubera lösningen i rumstemperatur tills den blir klar. Tillsätt sedan 25 ml separationsbuffert för att stoppa reaktionen.Centrifugera vid 150 g i åtta minuter för att tvätta lösningen. Häll av supernatanten och resuspend pelleten med separationsbuffert. Efter att ha räknat cellerna, späd dem i odlingsmedium ner till 12, 500 celler per brunn.Fördela 30 ml av denna cellupphängning i varje brunn av en 384 brunnsplatta. Nästa tillsätt 15 mikroliter av fyra gånger koncentrerade sammansatta lösningar till varje brunn och preincubate plattan vid 37 grader Celsius med 5%koldioxid i en timme. Om så önskas, tillsätt antingen LPS till slutkoncentrationen på 1 ng per ml eller utarmat Zymosan till en slutkoncentration på 100 mcg per ml.Sedan inkubera plattan över natten vid 37 grader Celsius med 5%koldioxid. Nästa dag ta 10 mikroliter av supernatanten för att mäta de utsöndade TNF alfanivåerna. För att påbörja den seriella utspädningen, späda mlt-827 stamlösning med medium för att nå en koncentration av 8 mikromolar på en gång.Utför en serieutspädning i sex steg 1:5 med hjälp av medium med 0,08%DMSO. För att förbereda för enstaka dos tester, späd MLT-827, AFN700, och sammansatta 11 lager lösningar med medium för att nå en koncentration av 4 mikromolar på en gång. Tillsätt först 2 ml sterilt endotoxinfritt vatten till 10 mg utarmat Zymosan.Vortexa denna stamlösning för att homogenisera den. Aliquot lösningen och sedan lagra alikvoterna vid 20 grader Celsius. I denna studie mänskliga PBMCs och mus mjälte celler stimuleras med antingen utarmat Zymosan, en Dectin-1 agonist, eller lipopolysackarid, en TL4 agonist.NTNF alfautsättning i supernatanten mäts efter 20 timmar. I både människa och mus analyser MLT-827 förening selektivt blockerar TNF alfa produktion drivs av Dectin-1 väg men inte av TLR4 väg. I monocyter stimuleras med LPS, produktion av TNF alfa är nästan helt upphävs av AFN700 men det är inte känslig för Cpd11, vilket är förenligt med TLR4 utbildningsavsnitt beroende av NF-kappa B verksamhet och dess independency på SIC verksamhet.I motsats TNF alfa produktion som drivs av Dectin-1 och MODC visar känslighet för MLT-827, AFN700 och Cpd11. Detta ger ytterligare bevis för medverkan av en SIC CBM signalering kaskad i Dectin-1 utbildningsavsnitt. Produktion av IL-1 beta, IL-6, och IL-23 är också känslig för de tre hämmare, vilket indikerar regleringsmekanismer som liknar TNF alfa.Den begränsade effekten som ses på produktionen av IL-8 tyder dock på att denna cytokin har en distinkt regleringsmekanism. Att höja Trehalose-dibehenate koncentrationer över 50 mcg per ml leder till produktion av TNF alfa, IL-6, och IL-1 beta, som förlitade sig på MALT1 paracaspase aktivitet enligt den blockerande effekten av MLT-827. Liknande resultat sågs när utmanande modcerna med ökande koncentrationer av utarmat Zymosan att stimulera Dectin-1.Denna metod gjorde det möjligt att visa att paracaspase MALT1 selektivt reglerar C-typlectin-liknande receptorsignalering. Det är väsentligt att använda väl karakteriserade referensföreningar. Var uppmärksam på förfarandet för utspädning av stamlösningar.Detta är avgörande för förening med begränsad löslighet.

Research

JoVE Journal

Biology

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Kultur av myeloisk dendritiska celler från benmärg prekursorer

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

Reaggregate Thymus Cultures

Reaggregate Thymus kulturer

Stromal cells within lymphoid tissues are organized into three-dimensional structures that provide a scaffold that is thought to control the migration and ...

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

Beredning av 2-dGuo-behandlade Thymus Organ kulturer

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Dissektion och färgning av Drosophila Larvernas Äggstockar

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Visualisering av Vascular Ca 2 + Signalering Triggade av parakrina Härledda ROS

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Använda SecM Arrest sekvens som ett verktyg för Isolera ribosom Bundna Polypeptider

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

En hög halt Imaging arbetsflöde för att studera Grb2 signalering komplex genom expressionskloning

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

Enda molekyl avbildning av genreglering<em&gt; In vivo</em&gt; Använda Cotranslational Aktivering genom klyvning (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Mekanisk stimulering-inducerad Kalcium vågutbredning i cellmonoskikt: exemplet Nötkreatur hornhinnan endotelceller

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabola Märkning och Membrane Fraktione för jämförande proteomik analys av<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Fjädring cellkulturer

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...