Name: myeloid innate signaling pathway regulation by malt1 paracaspase activity
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Myeloid Innate Signaling Pathway Regulation by MALT1 Paracaspase Activity at JoVE.com

Elsevier burada Şekil 2A Unterreiner vd yeniden kendi yetkilendirme (lisans numarası 4334770630127) için teşekkür ederiz (2017).

Deneyler kuralları ve standartları Novartis insan araştırma etik kurulu göre yapılmıştır.
1. hazırlık periferik kan mononükleer hücre (PBMCs) insan Buffy kat
Not: Bir gün sonra 50 mL çanta koleksiyonunda sağlıklı gönüllü buffy kat aldık. Onlar onam altında sağlanan ve Interregionale Blutspende Schweizeriches Rotes Kreuztoplanan. Aksi belirtilmediği sürece oda sıcaklığında, aşağıdaki yordamı kullanarak idare e...

<ol>
	<li>Coornaert, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+antigen+receptor+stimulation+induces+MALT1+paracaspase-mediated+cleavage+of+the+NF-kappaB+inhibitor+A20.">T cell antigen receptor stimulation induces MALT1 paracaspase-mediated cleavage of the NF-kappaB inhibitor A20.</a> Nature immunology. 9 (3), 263-271 (2008).</li><li>Rebeaud, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proteolytic+activity+of+the+paracaspase+MALT1+is+key+in+T+cell+activation.">The proteolytic activity of the paracaspase MALT1 is key in T cell activation.</a> Nature immunology. 9 (3), 272-281 (2008).</li><li>Jaworski, M., Thome, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+paracaspase+MALT1:+Biological+function+and+potential+for+therapeutic+inhibition.">The paracaspase MALT1: Biological function and potential for therapeutic inhibition.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (3), 459-473 (2016).</li><li>Meininger, I., Krappmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+signaling+and+activation+by+the+CARMA1-BCL10-MALT1+signalosome.">Lymphocyte signaling and activation by the CARMA1-BCL10-MALT1 signalosome.</a> Biological Chemistry. 397 (12), 1315-1333 (2016).</li><li>Qiao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+architecture+of+the+CARMA1/Bcl10/MALT1+signalosome:+nucleation-induced+filamentous+assembly.">Structural architecture of the CARMA1/Bcl10/MALT1 signalosome: nucleation-induced filamentous assembly.</a> Molecular cell. 51 (6), 766-779 (2013).</li><li>Gross, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Card9+controls+a+non-TLR+signalling+pathway+for+innate+anti-fungal+immunity.">Card9 controls a non-TLR signalling pathway for innate anti-fungal immunity.</a> Nature. 442 (7103), 651-656 (2006).</li><li>Chiffoleau, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-type+lectin-like+receptors+as+emerging+orchestrators+of+sterile+inflammation+represent+potential+therapeutic+targets.">C-type lectin-like receptors as emerging orchestrators of sterile inflammation represent potential therapeutic targets.</a> Frontiers in Immunology. 9 (FEB), 1-9 (2018).</li><li>Taylor, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dectin-1+is+required+for+beta-glucan+recognition+and+control+of+fungal+infection.">Dectin-1 is required for beta-glucan recognition and control of fungal infection.</a> Nature Immunology. 8 (1), 31-38 (2007).</li><li>Lanternier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+immunodeficiencies+underlying+fungal+infections.">Primary immunodeficiencies underlying fungal infections.</a> Current opinion in pediatrics. 25 (6), 736-747 (2013).</li><li>Thome, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+roles+for+MALT1+in+T-cell+activation.">Multifunctional roles for MALT1 in T-cell activation.</a> Nature reviews. Immunology. 8 (7), 495-500 (2008).</li><li>Unterreiner, A., Stoehr, N., Huppertz, C., Calzascia, T., Farady, C. J., Bornancin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+MALT1+paracaspase+inhibition+does+not+block+TNF-&#945;+production+downstream+of+TLR-4+in+myeloid+cells.">Selective MALT1 paracaspase inhibition does not block TNF-&#945; production downstream of TLR-4 in myeloid cells.</a> Immunology Letters. , 48-51 (2017).</li><li>Strasser, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syk+Kinase-Coupled+C-type+Lectin+Receptors+Engage+Protein+Kinase+C-&#x3B4;+to+Elicit+Card9+Adaptor-Mediated+Innate+Immunity.">Syk Kinase-Coupled C-type Lectin Receptors Engage Protein Kinase C-&#x3B4; to Elicit Card9 Adaptor-Mediated Innate Immunity.</a> Immunity. 36 (1), 32-42 (2012).</li><li>Jaworski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malt1+protease+inactivation+efficiently+dampens+immune+responses+but+causes+spontaneous+autoimmunity.">Malt1 protease inactivation efficiently dampens immune responses but causes spontaneous autoimmunity.</a> The EMBO journal. 33 (23), 2765-2781 (2014).</li><li>Yu, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALT1+protease+activity+is+required+for+innate+and+adaptive+immune+responses.">MALT1 protease activity is required for innate and adaptive immune responses.</a> PLoS ONE. 10 (5), 1-20 (2015).</li><li>Bardet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+T-cell+fingerprint+of+MALT1+paracaspase+revealed+by+selective+inhibition.">The T-cell fingerprint of MALT1 paracaspase revealed by selective inhibition.</a> Immunology and Cell Biology. 96 (1), 81-99 (2018).</li><li>Thoma, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+profiling+of+a+selective+and+efficacious+syk+inhibitor.">Discovery and profiling of a selective and efficacious syk inhibitor.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 58 (4), 1950-1963 (2015).</li><li>Bauer, B., Steinle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HemITAM:+A+single+tyrosine+motif+that+packs+a+punch.">HemITAM: A single tyrosine motif that packs a punch.</a> Science Signaling. 10 (508), 1-10 (2017).</li><li>Gringhuis, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+c-Rel+activation+via+Malt1+controls+anti-fungal+TH-17+immunity+by+dectin-1+and+dectin-2.">Selective c-Rel activation via Malt1 controls anti-fungal TH-17 immunity by dectin-1 and dectin-2.</a> PLoS Pathogens. 7 (1), (2011).</li><li>Dufner, A., Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell+antigen+receptor-induced+activation+of+an+IRAK4-dependent+signaling+pathway+revealed+by+a+MALT1-IRAK4+double+knockout+mouse+model.">B cell antigen receptor-induced activation of an IRAK4-dependent signaling pathway revealed by a MALT1-IRAK4 double knockout mouse model.</a> Cell Communication and Signaling. 9 (1), 6 (2011).</li><li>Phelan, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiprotein+supercomplex+controlling+oncogenic+signalling+in+lymphoma.">A multiprotein supercomplex controlling oncogenic signalling in lymphoma.</a> Nature. , (2018).</li></ol>

Bu çalışmada, insan sinyal yolları ve fare doğuştan gelen hücreler çalışma ve kendi bağımlılık MALT1 proteolitik işlevi sorguya basit deneysel ayarları kullanılır. Önceki çalışma11tarihinde genişletilmesi, bizim çalışma MALT1 paracaspase etkinliği C tipi indüklenen lektin benzeri reseptör sitokin üretim, TNF-α da dahil olmak üzere denetler gösterdi. Buna ek olarak, TLR-4-indüklenen TNF-α her iki tür MALT1 bağımsız. Toplu olarak, bu veri hangi önceki çalış...

MALT1 paracaspase etkinliği (mukoza ilişkili lenfoid doku Lenfoma translocation protein 1) 20081,2' ortaya koydu. O zamandan beri çalışmalar bir dizi kritik katkısının antijen reseptör yanıtları lenfositler bildirdin. Genetik modelleri T hücreleri, T-hücre bağımlı otoimmünite ve B hücreli lenfoma ayarları3,4önemli bir rol Farmakoloji veri desteği yanı sıra Mouse. Lenfosit, derleme antijen reseptör proksimal sinyal tarafından tetiklenen bir CARD11-BCL10-MALT1 karmaşık5' in üzerine MALT1 paracaspase etkinleştirme oluşuyor T veya B hücre reseptörü aşağı. Ayrıca benzer bir CARD9-BCL10-MALT1 kompleksi örneğin C tipi lektin-benzeri reseptörler (CLLR), akıntı yönünde sinyaller yayma için önemlidir yeterli kanıt olduğunu, Dectin-1, Dectin-2 ve MINCLE içinde myeloid hücrelerin6,7. Dectin-1, özellikle de bu yolu mantar enfeksiyonları8,9karşı ana savunma için önemli olduğundan çalışılmıştır. MALT1 dolaylı olarak Toll benzeri reseptör (TLR) yollar, ancak, tartışmalı10kalmıştır. Son kanıtlar insan myeloid hücrelerin TNF-üretim aşağı TLR-411tür ile MALT1 paracaspase etkinliği için doğrudan bir rol dışarı karar verdi.
Mevcut çalışma, biz çeşitli deneysel ayarları ve uyarıcı koşullarda insan ve fare myeloid hücrelerin belirli farmakolojik aracı inhibitörleri ve ölçüm sitokin üretiminin güvenerek doğuştan gelen sinyal yolları, soruşturma için kullandık.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 &#181;m nylon cell strainer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS431752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 ml Falcon tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Falcon tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plates</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well flat-bottom plate, with low evaporation lid</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well V-bottom plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>734-1798</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride - NH4Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay diluent RD1-W ELISA</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>895038</td>
			<td>Assay diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture microplate, 384 well, black</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>781986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depleted Zymosan</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>tlrl-dzn</td>
			<td>now: tlrl-zyd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td>DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA-Na2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA muTNF-&#945;</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>SMTA00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C tubes</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS dissociator</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM-CSF</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTRF hu IL-23</td>
			<td>CisBio</td>
			<td>62HIL23PEG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTRF hu TNF-&#945;</td>
			<td>CisBio</td>
			<td>62TNFPEC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTRF reconstitution buffer</td>
			<td>CisBio</td>
			<td>62RB3RDE</td>
			<td>50mM Phosphate buffer, pH 7.0, 0.8M KF, 0.2% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-&#947;</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>L4516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-4</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>Forene</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides (LPS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4391</td>
			<td>LPS used in human samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4516</td>
			<td>LPS used in murine samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis buffer</td>
			<td>Self-made</td>
			<td>-</td>
			<td>155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 1 mM EDTA, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnet</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>18001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate, 384 well white</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>784075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monocytes enrichment kit</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>19059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Mr. Frosty Cryo 1 &#176;C Freezing Container</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>cooling device (containing Propanol-2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x pH 7.4 [-] CaCl2 [-] MgCl2</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010</td>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td>Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium bicarbonate - KHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrestoBlue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A13262</td>
			<td>Resazurin solution for viability assessment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propanol-2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.09634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Read buffer</td>
			<td>MesoScale Discovery</td>
			<td>R92TC-3</td>
			<td>Tris-based buffer containing tripropylamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery cell culture freezing medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12648-010</td>
			<td>freezing medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) with Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61870</td>
			<td>+ 10% FBS for iMoDCs 
			+ 10% FBS + 1 mM Sodium Pyruvate + 100 U/mL Pen/Strep + 5 &#181;M &#946;-mercaptoethanol for human PBMCs and monocytes 
			+ 10% FBS + Pen/Strep + 5 &#181;M &#946;-mercaptoethanol for murine splenocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Separation buffer</td>
			<td>Self-made</td>
			<td>-</td>
			<td>PBS pH 7.4 + 2% FBS + 1 mM EDTA pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trehalose-6,6-dibehenate</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>tlrl-tdb</td>
			<td>TDB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7949</td>
			<td>Polysorbate 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5 M EDTA pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15675</td>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viewseal sealer</td>
			<td>Greiner BioOne</td>
			<td>676070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-PLEX Proinflammatory Panel 1 Human Kit</td>
			<td>MesoScale Discovery</td>
			<td>K15049D</td>
			<td>electrochemiluminescent multiplex assay (IL-1&#946;, TNF-&#945;, IL-6, IL-8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31350</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

myeloid innate signaling pathway regulation by malt1 paracaspase activity

Çok sayıda çalışma tarafından ele onun fonksiyonu yanında lenfoid hücrelerde paracaspase MALT1 da doğuştan gelen hücrelerin aşağı desen tanıma reseptörleri önemli bir rol oynar. En iyi okudu bir SYK ve CARD9 art arda sıralı bir MALT1 bağlı şekilde NF-κB harekete geçirmek için önde gelen sinyal bağımlı neden Dectin-1 ve Dectin 2 C tipi lektin benzeri reseptör aile üyesidir. Buna karşılık, Toll benzeri reseptörler (TLR), TLR-4 gibi NF-κB harekete geçirmek ama bir MYD88/Irak-bağımlı cascade üzerinden sinyal yaymak. Yine de, ister MALT1 TLR-4 sinyal için katkıda belirsiz kalmıştır. Son kanıtlar ile MIT-827, güçlü ve selektif inhibitörü olan MALT1 paracaspase etkinlik, MALT1 olan TNF-üretim aşağı TLR-4 insan myeloid hücrelerin Dectin-1, bağımsız olarak MALT1, TNF-üretim akıntıya karşı olduğunu gösterir bağımlı. Burada, biz MALT1 seçici katılımı daha da algılama, insan ve fare hücresel ürünleri ve Dectin-1, MINCLE veya TLR-4 yolları uyarılması çeşitli kullanarak örüntü tanıma içinde ele. Biz de sitokinler ötesinde TNF-keşfetmek ve MIT-827 SYK inhibitörü (Cpd11) ve bir IKK inhibitörü (AFN700) karşılaştırma ek anlayışlar sağladı. Topluca, sağlanan verileri C tipi lektin benzeri reseptör MALT1-bağımlılık için daha fazla kanıt — buna karşılık TLR sinyalli için sinyal.

Myeloid hücrelerin içinde harekete geçirmek sinyalleri aşağı Dectin-1, Dectin-2 ve MINCLE6gibi birkaç C tipi lektin-benzeri reseptörler MALT1 aktarır. Bu yollar üzerinde (hem) ITAM motifi içeren reseptörleri itimat (örneğin, Dectin-1) veya ITAM motifi içeren ortak reseptörleri (örneğin, FcRγ, Dectin-2 ve MINCLE için) bu işe ve SYK kinaz (Şekil 1) etkinleştirin. Bu bir protein kinaz C izoformu, y...

Watch this Scientific Journal Video about Myeloid Innate Signaling Pathway Regulation by MALT1 Paracaspase Activity at JoVE.com

Myeloid Innate Signaling Pathway Regulation by MALT1 Paracaspase Activity

Doğuştan gelen bağışıklık MALT1 düzenleyen ama nasıl oluşur kötü tanımlanmış kalır. Biz doğuştan gelen sinyal MALT1 myeloid sitokinler, üretimini düzenler gösteren Toll benzeri veya C tipi lektin-benzeri reseptörler aşağı ve aşağı akım için MALT1 katkısını çözülmeye selektif MALT1 paracaspase inhibitörü MLT-827 kullanılan C tipi lektin benzeri reseptörlerinin seçerek.

Myeloid doğuştan gelen sinyal yolu düzenleme MALT1 Paracaspase etkinlik tarafından

Besides its function in lymphoid cells, which has been addressed by numerous studies, the paracaspase MALT1 also plays an important role in innate cells ...

Bu nedenle makalemizdeki yöntemin amacı, insan ve fare sistemlerini kullanarak miyeloid hücrelerdeki sinyal yollarının karşılaştırmalı analizini sağlamaktır. Seçilen örüntü tanıma reseptörlerinin aşağısında hangi sinyal yolunun yer aldığını tanımlamaya yardımcı olur. Yani bu yöntemin uygulanması basittir.Bu birincil hücre preparatları ve doğrulanmış referans bileşikleri dayanır, hangi sinyal mekanizmalarının açıklanması için gerekli olan. Prosedürü gösteren Ratiba Touil ve Adeline Unterreiner, sırasıyla bilim adamı ve araştırma ortağı grubumuzda olacaktır. Bir laminar akış başlık makas steril bir çift yola, bir litre beher, ve plastik bir torba.Beher içine daha önce elde edilen buffy ceket yerleştirin ve dikkatle açmak için makas kullanın. 25 mm'lik pipet kullanılarak 2 milimolar EDTA ile takviye edilmiş 100 ml PBS ekleyin. Yavaşça yukarı ve aşağı boru ile karıştırın.Ve sonra her biri 15 ml polisakkarit bazlı yoğunluk gradyanı ile önceden doldurulmuş altı 50 ml konik santrifüj tüpler içine seyreltilmiş buffy ceket 25 ml aktarın. Tüpleri 800 g'da 20 dakika boyunca, hücrelere yoğunluklarına göre ayrılmasına izin vermek için mola vermeden orta hızda santrifüj edin. Santrifüjden sonra üç tabaka görünür olacak, kırmızı kan hücreleri ve granülositler içeren bir pelet, plazmadan yapılmış bir üst tabaka, ve periferik kan mononükleer hücreleri içeren beyaz bir halka.PBMC halkaları hasat ve yeni bir 50 ml tüp içine aktarmak için 10 ml pipet kullanın. PBS ve EDTA ile top up. Metin protokolünde belirtildiği gibi azalan santrifüj süresi ve hızı yla art arda üç yıkıntı gerçekleştirin.Son yıkamadan sonra, ozmotik basınç ile kırmızı kan hücrelerini lyse buz soğuk lysis tampon 25 ml pelet resuspend. Çözeltiyi oda sıcaklığında netleşene kadar kuluçkaya yatırın. Daha sonra reaksiyonu durdurmak için 25 ml ayırma tamponu ekleyin.Çözeltiyi yıkamak için sekiz dakika boyunca 150 g'de santrifüj. Supernatant dökün ve ayırma tampon uğrama pelet resuspend. Hücreleri sayarak, kültür orta aşağı 12, kuyu başına 500 hücreleri seyreltmek.384 kuyu plakaher kuyuiçine bu hücre süspansiyon 30 ml dağıtın. Sonraki her kuyuya dört kat konsantre bileşik çözelti15 mikrolitre ekleyin ve bir saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derece plaka preincubate. İstenirse, ml başına 1 ng nihai konsantrasyona LPS ekleyin veya ml başına 100 mcg son konsantrasyona zymosan tükenmiş.Sonra plakayı bir gecede %5 karbondioksitle 37 derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün salgılanan TNF alfa seviyelerini ölçmek için supernatant 10 mikrolitre almak. Seri seyreltmeye başlamak için MLT-827 stok çözeltisini orta ile seyreltin ve tek bir vuruşta 8 mikromolar konsantrasyonuna ulaşın.%0,08 DMSO ile orta kullanarak altı adımlı 1:5 seri seyreltme gerçekleştirin. Tek doz testleri için hazırlamak için, MLT-827, AFN700 seyreltmek ve orta ile bileşik 11 stok çözümleri bir gitmek 4 mikromolar bir konsantrasyonulaşmak için. İlk olarak, 10 mg tükenmiş Zymosan'a 2 ml steril endotoksinsiz su ekleyin.Vortex bu stok çözeltisi homojenize etmek. Aliquot çözeltisi ve sonra 20 santigrat derece aliquots saklayın. Bu çalışmada insan PBMCs ve fare dalak hücreleri ya tükenmiş Zymosan, bir Dectin-1 agonist veya lipopolisakkarit, bir TL4 agonist ile uyarılır.Supernatant NTNF alfa salınımı 20 saat sonra ölçülür. Hem insan hem de fare tahlillerinde MLT-827 bileşiği, DECTin-1 yolu tarafından yönlendirilen TNF alfa üretimini seçici olarak engeller, ancak TLR4 yolu tarafından değil. LPS ile uyarılan monositlerde, TNF alfa üretimi AFN700 ile neredeyse tamamen ortadan kalmaktadır ancak TLR4 yolunun NF-kappa B aktivitesine olan bağımlılığı ve SIC aktivitesine olan bağımlılığı ile tutarlı olan Cpd11'e karşı hassas değildir.Buna karşılık Dectin-1 ve MODC'lar tarafından yönlendirilen TNF alfa üretimi MLT-827, AFN700 ve Cpd1'e duyarlılık gösterir. Bu Dectin-1 yolunda bir SIC CBM sinyal kaskad katılımı için daha fazla kanıt sağlar. IL-1 beta, IL-6 ve IL-23 üretimi de tnf alfabenzer düzenleyici mekanizmaları gösteren, üç inhibitörleri duyarlıdır.Ancak, IL-8 üretimi üzerinde görülen sınırlı etkisi bu sitokin ayrı bir düzenleyici mekanizma olduğunu göstermektedir. Ml başına 50 mcg'nin üzerinde trehalose-dibehenate konsantrasyonlarının yükseltilmesi, MLT-827'nin bloke edici etkisine göre MALT1 parakaspas aktivitesine dayanan TNF alfa, IL-6 ve IL-1 beta üretimine yol açar. Benzer sonuçlar Dectin-1 uyarmak için tükenmiş Zymosan artan konsantrasyonları ile MODCs zorlu görüldü.Bu yöntem, parakasaz MALT1'in C-tipi lektin benzeri reseptör sinyalini seçici olarak düzenlediğini göstermeyi mümkün kAbdirdi. Bu iyi karakterize referans bileşikleri kullanmak esastır. Stok çözeltilerinin seyreltilmesi prosedürüne dikkat edin.Bu sınırlı çözünürlüğe sahip bileşik için çok önemlidir.

Research

JoVE Journal

Biology

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Myeloid dendritik hücreler kemik iliği öncüleri Kültür

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

Reaggregate Thymus Cultures

Thymus Kültürler Reaggregate

Stromal cells within lymphoid tissues are organized into three-dimensional structures that provide a scaffold that is thought to control the migration and ...

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

2-dGuo Boyalı Thymus Organ Kültürleri hazırlanması

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Diseksiyon ve boyanması Drosophila Larvaların Yumurtalıkların

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Vasküler Ca Görselleştirme 2 + Parakrin Türetilmiş ROS tarafından tetiklenmiş Sinyal

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Ribozom Ciltli Polipeptitler izole bir aracı olarak SECM Tutuklanma sırası kullanılarak

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

İfade Klonlama tarafından Grb2 Sinyal Kompleksi Eğitim için bir Yüksek içerik Görüntüleme İş Akışı

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

Gen Yönetmelik Tek molekül Görüntüleme<em&gt; In vivo</em&gt; Dilinim tarafından Cotranslational Aktivasyon (CoTrAC) kullanma

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Hücre Tek katmanlar mekanik uyarılması bağlı Kalsiyum Dalga Yayılım: Sığır Kornea Endotel Hücreleri Örneği

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Mukayeseli Proteomik Analizi Metabolik Etiketleme ve Membran Fraksiyonasyon<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Süspansiyon Hücre Kültürleri

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...