Name: studying protein import into chloroplasts using protoplasts
Uploaded: 2018-12-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts at JoVE.com

نفذ هذا العمل بالدعم من "برنامج البحوث التعاونية" لعلوم الزراعة وتطوير التكنولوجيا (المشروع رقم PJ010953012018)، "إدارة التنمية الريفية"، ومنحة "مؤسسة البحوث الوطنية" (كوريا) الممولة من وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات (رقم 2016R1E1A1A02922014)، جمهورية كوريا.

1-نمو النباتات نبات
<ol><li>تحضير 1 لتر جامبورج B5 المتوسطة (B5) عن طريق إضافة ز 3.2 من B5 المتوسطة بما في ذلك الفيتامينات، 20 غراما من السكروز 0.5 غرام من حامض السلفونيك الإيثان 2-(N-morpholino) (MES) لحوالي 800 مل مياه، وضبط درجة الحموضة إلى 5.7 مع هيدروكسيد البوتاسيوم (KOH). جلب المياه إضافة منزوع أكثر الحجم الإجم?...

<ol>
	<li>Jarvis, P., Lopez-Juez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+and+homeostasis+of+chloroplasts+and+other+plastids.">Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).</li><li>Neuhaus, H. E., Emes, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonphotosynthetic+Metabolism+in+Plastids.">Nonphotosynthetic Metabolism in Plastids.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 51, 111-140 (2000).</li><li>Rolland, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biosynthetic+capacities+of+the+plastids+and+integration+between+cytoplasmic+and+chloroplast+processes.">The biosynthetic capacities of the plastids and integration between cytoplasmic and chloroplast processes.</a> Annual Review of Genetics. 46, 233-264 (2012).</li><li>Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+nucleus-encoded+proteins+to+chloroplasts+in+plants.">Targeting of nucleus-encoded proteins to chloroplasts in plants.</a> New Phytologist. 179 (2), 257-285 (2008).</li><li>Li, H. M., Chiu, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Transport+into+Chloroplasts.">Protein Transport into Chloroplasts.</a> Annual Review of Plant Biology. 61, 157-180 (2010).</li><li>Keegstra, K., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+import+and+routing+systems+of+chloroplasts.">Protein import and routing systems of chloroplasts.</a> Plant Cell. 11 (4), 557-570 (1999).</li><li>Gasser, S. M., Daum, G., Schatz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Import+of+proteins+into+mitochondria.+Energy-dependent+uptake+of+precursors+by+isolated+mitochondria.">Import of proteins into mitochondria. Energy-dependent uptake of precursors by isolated mitochondria.</a> Journal of Biological Chemistry. 257 (21), 13034-13041 (1982).</li><li>Smeekens, S., Bauerle, C., Hageman, J., Keegstra, K., Weisbeek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+transit+peptide+in+the+routing+of+precursors+toward+different+chloroplast+compartments.">The role of the transit peptide in the routing of precursors toward different chloroplast compartments.</a> Cell. 46 (3), 365-375 (1986).</li><li>Lee, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+nuclear-encoded+plastid+transit+peptides+contain+multiple+sequence+subgroups+with+distinctive+chloroplast-targeting+sequence+motifs.">Arabidopsis nuclear-encoded plastid transit peptides contain multiple sequence subgroups with distinctive chloroplast-targeting sequence motifs.</a> Plant Cell. 20 (6), 1603-1622 (2008).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+targeting+of+the+Arabidopsis+F1-ATPase+gamma-subunit+via+multiple+compensatory+and+synergistic+presequence+motifs.">Mitochondrial targeting of the Arabidopsis F1-ATPase gamma-subunit via multiple compensatory and synergistic presequence motifs.</a> Plant Cell. 24 (12), 5037-5057 (2012).</li><li>Jin, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+dynamin-like+protein,+ADL6,+is+involved+in+trafficking+from+the+trans-Golgi+network+to+the+central+vacuole+in+Arabidopsis.">A new dynamin-like protein, ADL6, is involved in trafficking from the trans-Golgi network to the central vacuole in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 13 (7), 1511-1526 (2001).</li><li>Lee, K. H., Kim, D. H., Lee, S. W., Kim, Z. H., Hwang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+import+experiments+in+protoplasts+reveal+the+importance+of+the+overall+context+but+not+specific+amino+acid+residues+of+the+transit+peptide+during+import+into+chloroplasts.">In vivo import experiments in protoplasts reveal the importance of the overall context but not specific amino acid residues of the transit peptide during import into chloroplasts.</a> Molecules and Cells. 14 (3), 388-397 (2002).</li><li>Lee, D. W., Lee, S., Oh, Y. J., Hwang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sequence+motifs+in+the+rubisco+small+subunit+transit+peptide+independently+contribute+to+Toc159-dependent+import+of+proteins+into+chloroplasts.">Multiple sequence motifs in the rubisco small subunit transit peptide independently contribute to Toc159-dependent import of proteins into chloroplasts.</a> Plant Physiology. 151 (1), 129-141 (2009).</li><li>Lee, D. W., Woo, S., Geem, K. R., Hwang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+motifs+in+transit+peptides+act+as+independent+functional+units+and+can+be+transferred+to+new+sequence+contexts.">Sequence motifs in transit peptides act as independent functional units and can be transferred to new sequence contexts.</a> Plant Physiology. 169 (1), 471-484 (2015).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+the+hydrophobicity+and+a+positively+charged+region+flanking+the+C-terminal+region+of+the+transmembrane+domain+of+signal-anchored+proteins+play+critical+roles+in+determining+their+targeting+specificity+to+the+endoplasmic+reticulum+or+endosymbiotic+organelles+in+Arabidopsis+cells.">Both the hydrophobicity and a positively charged region flanking the C-terminal region of the transmembrane domain of signal-anchored proteins play critical roles in determining their targeting specificity to the endoplasmic reticulum or endosymbiotic organelles in Arabidopsis cells.</a> Plant Cell. 23 (4), 1588-1607 (2011).</li><li>Cleary, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+plant+mitochondria+import+chloroplast+precursor+proteins+in+vitro+with+the+same+efficiency+as+chloroplasts.">Isolated plant mitochondria import chloroplast precursor proteins in vitro with the same efficiency as chloroplasts.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (7), 5562-5569 (2002).</li></ol>

قدمنا بروتوكول مفصلاً لاستخدام بروتوبلاستس نبات لدراسة البروتين استيراد المعايشة. هذا الأسلوب قوية للتحقيق في عملية الاستيراد البروتين. هذا الأسلوب البسيط، تنوعاً مفيد لدراسة استهداف البروتينات البضائع المقصود للمعايشة. باستخدام هذا الأسلوب، يتم إعداد بروتوبلاستس من أنسجة أوراق ...

بلاستيدات الخضراء واحدة من العضيات الأكثر أهمية في النباتات. واحدة من المهام الرئيسية للمعايشة القيام بعملية التمثيل الضوئي1. الجبيلة أيضا الاضطلاع بكثير من التفاعلات الكيميائية الحيوية الأخرى لإنتاج الأحماض الدهنية والأحماض الأمينية، النيوكليوتيدات ونواتج الأيض الثانوية العديدة1،2. لكل ردود الفعل هذه، تتطلب المعايشة عدد كبير من أنواع مختلفة من البروتينات. ومع ذلك، يتضمن الجينوم بلاستيدات الخضراء الجينات فقط حوالي 1003،4. ولذلك، يجب استيراد المعايشة غالبية البروتينات على من سيتوسول. في الواقع، قد أظهرت معظم بلاستيدات الخضراء البروتينات يتم استيراده من سيتوسول بعد الترجمة4،،من56. الخلايا النباتية تتطلب آليات محددة لاستيراد البروتينات من سيتوسول للمعايشة. ومع ذلك، على الرغم من أن هذه الآليات استيراد البروتين حققت على مدى عدة عقود، نحن لا تزال لا يفهمون تماما لهم على المستوى الجزيئي. هنا، نحن نقدم طريقة مفصلة لإعداد بروتوبلاستس ومناشئ التعبير عن الجينات في بروتوبلاستس. هذا الأسلوب يمكن أن يكون قيماً لتوضيح الآليات الجزيئية الكامنة وراء استيراد البروتين المعايشة بالتفصيل.
يمكن دراسة البروتين الاستيراد باستخدام نهج مختلفة كثيرة. أحد هذه الأساليب ينطوي على استخدام في المختبر البروتين استيراد نظام7،8. باستخدام هذا النهج، في المختبر-السلائف البروتين المترجمة هي المحتضنة مع المعايشة المنقاة في المختبر، ويتم تحليل البروتين الاستيراد من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة تليها تحليل لطخة غربية. وميزة هذا النهج أن كل خطوة من البروتين الاستيراد إلى المعايشة يمكن دراستها بالتفصيل. وهكذا، هذه الطريقة قد استخدمت على نطاق واسع لتحديد مكونات البروتين استيراد الأجهزة الجزيئية وتشريح معلومات تسلسل للعبور الببتيدات. في الآونة الأخيرة، تم وضع نهج آخر ينطوي على استخدام بروتوبلاستس من أنسجة نبات وأنها أصبحت تستخدم على نطاق واسع لدراسة البروتين استيراد الجبيلة9،10. وميزة هذا النهج هو أن بروتوبلاستس توفر بيئة خلوية التي أقرب إلى خلايا سليمة من النظام في المختبر . وبالتالي، النظام جبلة مجردة يسمح لنا بمعالجة العديد من جوانب هذه العملية، مثل أحداث سيتوسوليك المرتبطة بها وكيفية تحديد خصوصية استهداف إشارات إضافية. نقدم هنا، بروتوكول مفصل لاستخدام بروتوبلاستس لدراسة البروتين استيراد المعايشة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>GAMBORG B5 MEDIUM INCLUDING VITAMINS</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>G0210.0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUCROSE</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>S0809.5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES MONOHYDRATE</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>M1503.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, powder</td>
			<td>JUNSEI</td>
			<td>24440S1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropore Surgical tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>1530-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade stainless No.10</td>
			<td>FEATHER</td>
			<td>Unavailable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tube, 50ml</td>
			<td>SPL LIFE SCIENCES</td>
			<td>50050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macerozyme R-10</td>
			<td>YAKULT PHARMACEUTICAL IND.</td>
			<td>Unavailable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase ONOZUKA R-10</td>
			<td>YAKULT PHARMACEUTICAL IND.</td>
			<td>Unavailable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALBUMIN, BOVINE (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>M1902-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CALCIUM CHLORIDE, DIHYDRATE</td>
			<td>MP BIOMEDICALS</td>
			<td>0219463505-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Twister</td>
			<td>VISION SCIENTIFIC</td>
			<td>VS-96TW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screen cup for CD-1</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>S1145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screens for CD-1</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>S3895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>SPL LIFE SCIENCES</td>
			<td>10090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>HILGENBERG</td>
			<td>3150102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LABORATORY CENTRIFUGE / BENCH-TOP</td>
			<td>VISION SCIENTIFIC</td>
			<td>VS-5500N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>JUNSEI</td>
			<td>19015S0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P3911-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-GLUCOSE, ANHYDROUS</td>
			<td>BIO BASIC</td>
			<td>GB0219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
			<td>DUKSAN</td>
			<td>40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium nitrate tetrahydrate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C2786-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P2139-2KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>M2393-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube 13ml, 100x16mm, PP</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>55.515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td>1000412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td>101030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting Chamber</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td>650030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axioplan 2 Imaging Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Unavailable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tube 1.5ml</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>M3148-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Proteomics Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M107-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS, Ultra Pure Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0497-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (DL-Dithiothreitol), Biotechnology Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0281-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue sodium salt ACS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0312-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>JUNSEI</td>
			<td>27210S0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8)</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>632381</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying protein import into chloroplasts using protoplasts

بلاستيدات الخضراء هو عضية أساسية المسؤولة عن مختلف العمليات الخلوية في النباتات، مثل عملية التمثيل الضوئي وإنتاج العديد من نواتج الأيض الثانوية والدهون. المعايشة تتطلب عددا كبيرا من البروتينات لهذه العمليات الفسيولوجية المختلفة. أكثر من 95% بروتينات بلاستيدات الخضراء من ترميز نواة واستيرادها في الجبيلة من سيتوسول بعد الترجمة في ريبوسوم سيتوسوليك. وهكذا، استيراد السليم أو استهداف هذه البروتينات المرمزة بنواة بلاستيدات الخضراء للمعايشة أمر أساسي للأداء السليم للمعايشة، فضلا عن الخلية النباتية. البروتينات المرمزة بنواة بلاستيدات الخضراء تحتوي على تسلسلات إشارة لاستهداف محددة للمعايشة. الآلات الجزيئية مترجمة إلى بلاستيدات الخضراء أو سيتوسول تعترف بهذه الإشارات، والقيام بعملية الاستيراد. للتحقيق في آليات الاستيراد البروتين أو استهداف للمعايشة في فيفو، قمنا بتطوير أسلوب المستندة إلى جبلة مجردة سريعة وفعالة لتحليل البروتين استيراد المعايشة لنبات. في هذا الأسلوب، ونحن نستخدم بروتوبلاستس المعزولة من أنسجة أوراق نبات. هنا، نحن نقدم بروتوكول مفصل لاستخدام بروتوبلاستس للتحقيق في الآلية التي يتم استيرادها البروتينات إلى المعايشة.

يمكن فحص استيراد البروتينات إلى المعايشة باستخدام نهجين اثنين: التحليل المجهري و immunoblot الأسفار بعد فصل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة-بوساطة. وهنا استخدمنا كرات الدم الحمراء-nt:GFP، بناء انصهار ترميز مخلفات الأحماض الأمينية الطرفي ن 79 من كرات الدم الحمراء المحتوية على البب?...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts at JoVE.com

Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

هنا يصف لنا وضع بروتوكول للتعبير عن البروتينات في بروتوبلاستس باستخدام أسلوب التحويل شماعة بوساطة. يوفر الأسلوب التعبير سهلة للبروتينات للفائدة، وتحقيق كفاءة الترجمة البروتين وعملية الاستيراد لمختلف الظروف التجريبية المجراة في.

دراسة البروتين استيراد المعايشة باستخدام بروتوبلاستس

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

هذا اللغز يمكن أن تساعد في الإجابة على بعض الأسئلة في مجال بيولوجيا الخلية مثل البروتين المدخلات في الكلوروبلاست. والميزة الرئيسية لهذه التكنولوجيا هي أن مدخلات البروتين في الكلوروبلاستس يمكن أن تدرس في ظروف الجسم الحي. إثبات الإجراء سيكون جونهو لي وهيانغجو كانغ، اثنين من خارج وظيفة من مختبري.للبدء، حصاد أنسجة أوراق سليمة من النباتات التي يبلغ عمرها أسبوعين من واحد إلى اثنين من لوحات B5. استخدام سكين الجراحية لحصاد الأوراق ووضعها في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر تحتوي على 25 ملليلتر من محلول انزيم. ضع الأنبوب أفقيًا على شاكر دوار وحضن بالتحريض اللطيف عند 22 درجة مئوية في الظلام لمدة ثماني إلى 12 ساعة حتى تبقى السيقان والسيقان فقط في الحل.بعد الانتهاء من الحضانة، فلتر محلول الإنزيم الذي يحتوي على البروتبلاستس المفرج عنه من خلال شبكة بحجم مسام 140 ميكرومتر في طبق بيتري جديد. ثم طبقة بعناية الحل على رأس 15 ملليلتر من محلول السكروز 21٪في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. الطرد المركزي الأنبوب في الدوار دلو يتأرجح في 98 gs لمدة 10 دقائق مع أدنى إعدادات التسارع والتباطؤ.بعد ذلك، استخدم ماصة باتورا لإزالة بعناية الضمورات من الطبقة العليا التي تحتوي على محلول الإنزيم ومن الواجهة بين محلول الإنزيمات وحل السكروز. نقل هذا الحل إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر يحتوي على 30 ملليلتر من محلول W5 وعكس أنبوب لخلط. جهاز طرد مركزي الأنبوب في 51 gs لمدة ست دقائق.استخدام ماصة لتجاهل هذا افرا بعناية دون إزعاج protoplasts في بيليه. إضافة 25 ملليلتر من حل W5 وبلطف إعادة تعليق الضمور. لتحقيق الاستقرار، احتضان في ثلاجة أربعة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل.بعد أربع درجة مئوية الحضانة، بيليه الدمج تماما عن طريق الطرد المركزي لهم في 46 غرام لمدة دقيقتين. بعناية إزالة supernatent تماما وإضافة حل MANG إلى بيليه protoplast لتحقيق خمس مرات عشرة إلى ستة لكل ملليلتر. استخدام ماصة لإضافة 10 ميكروغرام من الحمض النووي البلازما و 300 ميكرولترات من محلول بروبلاست إلى أنبوب جديد 13 ملليلتر جولة القاع.مزيج عن طريق تناوب بلطف الأنابيب باليد ثم تضاف على الفور 300 ميكرولترس من الطازجة أعدت 40٪ PEG الحل. تخلط تماما عن طريق إمالة الأنبوب أفقيا تقريبا وتناوب عليه لطيف عدة مرات باليد. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.ثم تضاف ملليلتر واحد من حل W5 ومزيج تماما عن طريق تناوب بلطف الأنبوب باليد كما كان سابقا. احتضان العينة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. كرر مرتين مع إضافة أول 1.5 ملليلتر ثم مليلترين من W5 وبعد الجمع النهائي والاختلاط، احتضان لمدة 30 دقيقة.الطرد المركزي الأنبوب في 46 gs لمدة أربع دقائق ومن ثم التخلص من الفائق. إضافة ملليلترين من حل W5 إلى بيليه ومزيج بلطف، ولكن تماما، بنفس الطريقة كما كان سابقا. احتضان في 22 درجة مئوية في غرفة مظلمة لمدة 18 ساعة.لتحليل استيراد البروتين باستخدام المجهر فلوريسكنس، استخدم ماصة مع طرف مشذب لوضع 10 ميكرولترات من محلول الوُرُب على شريحة زجاجية. استخدم زلة غطاء لتغطية الحل بعناية لتجنب إتلاف الوُرُب البروتبلاست. ضع الشريحة على خشبة مسرح المجهر الفلوري مع مرشح القبول الإثارة التي تم تعيينها لمراقبة البروتين الفلورسنت الأخضر و chlorophyll autofluorescence.استخدام جهاز زوجين تهمة تبريد الكاميرا لالتقاط الصور ومعالجتها باستخدام برنامج تحرير تخيل لإنتاج الصور الملونة الزائفة. لاستخراج البروتين الكلي والتنقية المناعية، وإزالة ملليلتر واحد من محلول بروبلاست وخلط المليلتر واحد المتبقية. نقل هذا الحل بروبلاست إلى أنبوب الطرد المركزي والطرد المركزي في 46 gs لمدة أربع دقائق.إزالة فائقة بعد الانتهاء من الطرد المركزي وإضافة 80 ميكرولترات من عازلة denaturation. دوامة بقوة لمدة خمس ثوان. إضافة خمسة XDS عينة العازلة، مزيج جيدا ويغلي لمدة 10 دقائق لdenature.تابع صفحة STS القياسية والتنقية المناعية مع الأجسام المضادة لـ GFP. RbcS وTGFT، وهو بناء الانصهار ترميز 79 بقايا الأحماض الأمينية الطرفية من RBCS التي تحتوي على ببتيد العبور تنصهر في GFP، واستخدمت لدراسة استيراد البروتينات إلى البلاستكات الكلورية عن طريق المجهر فلوريسكنس ومناعة. عند فحصها بواسطة المجهر فلوريسنس، إشارات الفلورسنت الخضراء من البروتين المستهدف دمجها مع إشارات الفلورسنت الحمراء من فلورورس الكلورو تشير إلى استيراد البروتين إلى البلاستيدات الكلورية.بعد عزل البروتين الكلي ، لوحظ اثنين من نطاقات البروتين في مناعية ، وتبين أن البروتين تم استيرادها بشكل صحيح في الكلوروبلاست. ويتوافق النطاق العلوي مع السلائف الطول الكامل والفرقة السفلية إلى النموذج المجهز بعد الاستيراد إلى chloroplasts. زادت كمية الشكل المجهز للبروتين بطريقة تعتمد على الوقت ، مما يشير إلى أن البروتين يتم استيراده إلى الكلوروبلاست.في هذا التطور، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا الخلايا لاستكشاف البروتين متعبة أو خيط غشاء قطف في Arabidopsis.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

باستخدام سقالة الليبوزومات لإعادة تفاعلات البروتين البروتين، الدهون القريب<em&gt; في المختبر</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

وقت حل التأين electrospray الهيدروجين، الديوتيريوم تبادل الطيف الكتلي لدراسة بنية البروتين وديناميكية

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

مرنا إنتيراكتوم التقاط من بروتوبلاستس النبات

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

تنقية البروتين اللاهوائية وتحليل الحركية عبر مسرى الأوكسجين لدراسة النشاط ديوكسيجيناسي دسب وتثبيط

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

بنية حل أزرق نيون البروتين باستخدام ميشاندكوليكت

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

قياس حساسية عالية من الانتماءات الملزمة الحمض النووي عامل النسخ بالتنافسية معايرة باستخدام مجهر الأسفار

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

تحليل لطي البروتين، والنقل، وتدهور في الخلايا الحية بمطاردة نبض المشعة

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

دراسة التمثيلات الحمض النووي الريبي للبروتين كيناز المنشط الجيش الملكي النيبالي خلال دورة الخلية الثديية

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

تطبيق قياس التداخل الحيوي (BLI) لدراسة تفاعلات البروتين والبروتين في النسخ

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

تقييم تفاعلات البروتين والبروتين باستخدام تقنية الهضم على الغشاء

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...