Name: studying protein import into chloroplasts using protoplasts
Uploaded: 2018-12-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts at JoVE.com

Dette arbejde blev udført med støtter af Cooperative Research Program for landbrug videnskab og teknologiudvikling (projekt nr. PJ010953012018), landdistrikternes udvikling Administration og National Research Foundation (Korea) tilskud finansieret af Ministeriet for videnskab og IKT (nr. 2016R1E1A1A02922014), Sydkorea.

1. vækst i Arabidopsis planter
<ol><li>Forberede 1 L Gamborg B5 (B5) medium ved at tilføje 3,2 g B5 medium herunder vitaminer, 20 g saccharose, 0,5 g 2-(N-morpholino) Ethan ethylbenzthiazolinsulfonsyre syre (MES) til ca. 800 mL deioniseret vand, og ph indstilles til 5.7 med kaliumhydroxid (KOH). Tilføj mere deioniseret vand bringe den samlede mængde til 1 L. tilføje 8 g phytoagar og autoklave i 15 min ved 121 ° C.</li>
	<li>Tillad medium til at køle ned til 55 ° C og hæld 20 – 25 mL af B5 medium i en petrisk...

<ol>
	<li>Jarvis, P., Lopez-Juez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+and+homeostasis+of+chloroplasts+and+other+plastids.">Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).</li><li>Neuhaus, H. E., Emes, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonphotosynthetic+Metabolism+in+Plastids.">Nonphotosynthetic Metabolism in Plastids.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 51, 111-140 (2000).</li><li>Rolland, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biosynthetic+capacities+of+the+plastids+and+integration+between+cytoplasmic+and+chloroplast+processes.">The biosynthetic capacities of the plastids and integration between cytoplasmic and chloroplast processes.</a> Annual Review of Genetics. 46, 233-264 (2012).</li><li>Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+nucleus-encoded+proteins+to+chloroplasts+in+plants.">Targeting of nucleus-encoded proteins to chloroplasts in plants.</a> New Phytologist. 179 (2), 257-285 (2008).</li><li>Li, H. M., Chiu, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Transport+into+Chloroplasts.">Protein Transport into Chloroplasts.</a> Annual Review of Plant Biology. 61, 157-180 (2010).</li><li>Keegstra, K., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+import+and+routing+systems+of+chloroplasts.">Protein import and routing systems of chloroplasts.</a> Plant Cell. 11 (4), 557-570 (1999).</li><li>Gasser, S. M., Daum, G., Schatz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Import+of+proteins+into+mitochondria.+Energy-dependent+uptake+of+precursors+by+isolated+mitochondria.">Import of proteins into mitochondria. Energy-dependent uptake of precursors by isolated mitochondria.</a> Journal of Biological Chemistry. 257 (21), 13034-13041 (1982).</li><li>Smeekens, S., Bauerle, C., Hageman, J., Keegstra, K., Weisbeek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+transit+peptide+in+the+routing+of+precursors+toward+different+chloroplast+compartments.">The role of the transit peptide in the routing of precursors toward different chloroplast compartments.</a> Cell. 46 (3), 365-375 (1986).</li><li>Lee, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+nuclear-encoded+plastid+transit+peptides+contain+multiple+sequence+subgroups+with+distinctive+chloroplast-targeting+sequence+motifs.">Arabidopsis nuclear-encoded plastid transit peptides contain multiple sequence subgroups with distinctive chloroplast-targeting sequence motifs.</a> Plant Cell. 20 (6), 1603-1622 (2008).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+targeting+of+the+Arabidopsis+F1-ATPase+gamma-subunit+via+multiple+compensatory+and+synergistic+presequence+motifs.">Mitochondrial targeting of the Arabidopsis F1-ATPase gamma-subunit via multiple compensatory and synergistic presequence motifs.</a> Plant Cell. 24 (12), 5037-5057 (2012).</li><li>Jin, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+dynamin-like+protein,+ADL6,+is+involved+in+trafficking+from+the+trans-Golgi+network+to+the+central+vacuole+in+Arabidopsis.">A new dynamin-like protein, ADL6, is involved in trafficking from the trans-Golgi network to the central vacuole in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 13 (7), 1511-1526 (2001).</li><li>Lee, K. H., Kim, D. H., Lee, S. W., Kim, Z. H., Hwang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+import+experiments+in+protoplasts+reveal+the+importance+of+the+overall+context+but+not+specific+amino+acid+residues+of+the+transit+peptide+during+import+into+chloroplasts.">In vivo import experiments in protoplasts reveal the importance of the overall context but not specific amino acid residues of the transit peptide during import into chloroplasts.</a> Molecules and Cells. 14 (3), 388-397 (2002).</li><li>Lee, D. W., Lee, S., Oh, Y. J., Hwang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sequence+motifs+in+the+rubisco+small+subunit+transit+peptide+independently+contribute+to+Toc159-dependent+import+of+proteins+into+chloroplasts.">Multiple sequence motifs in the rubisco small subunit transit peptide independently contribute to Toc159-dependent import of proteins into chloroplasts.</a> Plant Physiology. 151 (1), 129-141 (2009).</li><li>Lee, D. W., Woo, S., Geem, K. R., Hwang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+motifs+in+transit+peptides+act+as+independent+functional+units+and+can+be+transferred+to+new+sequence+contexts.">Sequence motifs in transit peptides act as independent functional units and can be transferred to new sequence contexts.</a> Plant Physiology. 169 (1), 471-484 (2015).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+the+hydrophobicity+and+a+positively+charged+region+flanking+the+C-terminal+region+of+the+transmembrane+domain+of+signal-anchored+proteins+play+critical+roles+in+determining+their+targeting+specificity+to+the+endoplasmic+reticulum+or+endosymbiotic+organelles+in+Arabidopsis+cells.">Both the hydrophobicity and a positively charged region flanking the C-terminal region of the transmembrane domain of signal-anchored proteins play critical roles in determining their targeting specificity to the endoplasmic reticulum or endosymbiotic organelles in Arabidopsis cells.</a> Plant Cell. 23 (4), 1588-1607 (2011).</li><li>Cleary, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+plant+mitochondria+import+chloroplast+precursor+proteins+in+vitro+with+the+same+efficiency+as+chloroplasts.">Isolated plant mitochondria import chloroplast precursor proteins in vitro with the same efficiency as chloroplasts.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (7), 5562-5569 (2002).</li></ol>

Vi givet en detaljeret protokol for brug af protoplasts i Arabidopsis at studere protein import i grønkornene. Denne metode er stærk til at undersøge protein importprocessen. Denne enkle, alsidige teknik er nyttig for behandlingen af målretning af de påtænkte cargo proteiner til grønkorn. Du bruger denne metode, er protoplasts fremstillet af blad væv i Arabidopsis11,12 , som kan fås fra planter på mange forskellige vækststadierne spæ...

Chlorplasttransitpeptidsekvensen er en af de vigtigste organeller i planter. En af de vigtigste funktioner i kloroplaster er at foretage fotosyntese1. Kloroplaster også udføre mange andre biokemiske reaktioner for produktionen af fedtsyrer, aminosyrer, nukleotider og talrige sekundære metabolitter1,2. For alle disse reaktioner kræver grønkorn et stort antal forskellige typer af proteiner. Grønkorn genom indeholder imidlertid kun ca. 100 gener3,4. Derfor skal grønkorn importere størstedelen af deres proteiner fra cytosol. Faktisk var de fleste grønkorn proteiner vist skal importeres fra cytosol efter oversættelse4,5,6. Planteceller kræver særlige mekanismer til at importere proteiner fra cytosol til grønkorn. Men selv om disse protein import mekanismer er blevet undersøgt for de sidste mange årtier, vi stadig fuldt ud forstår dem ikke på molekylært niveau. Her give vi en detaljeret metode til at forberede protoplasts og eksogent giver udtryk for gener i protoplasts. Denne metode kunne være værdifuld for belyse de molekylære mekanismer bag protein import til kloroplaster i detaljer.
Protein import kan studeres ved hjælp af mange forskellige tilgange. En af disse metoder indebærer anvendelse af en in vitro- protein import system7,8. Ved hjælp af denne fremgangsmåde i vitro-oversatte protein prækursorer inkuberes med renset kloroplaster i in vitro, og protein import er analyseret af SDS-PAGE efterfulgt af western blot analyse. Fordelen ved denne fremgangsmåde er, at hvert trin af protein import i grønkornene kan studeres i detaljer. Således, denne metode har været meget anvendt til at definere komponenter af protein import molekylære maskineri og dissekere sekvens information til transit peptider. For nylig, en anden tilgang, der involverer brugen af protoplasts fra blad væv blev udviklet og det er blevet udbredt at studere protein import til grønkorn9,10. Fordelen ved denne fremgangsmåde er, at protoplasts giver en cellulære miljø, der er tættere på intakt celler end in vitro -system. Således tillader protoplast systemet os at løse mange flere aspekter af denne proces, som de tilknyttede cytosole begivenheder og hvordan specificitet målretning signaler bestemmes. Vi præsenterer her, en detaljeret protokol for brug af protoplasts til at undersøge protein import i grønkornene.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>GAMBORG B5 MEDIUM INCLUDING VITAMINS</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>G0210.0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUCROSE</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>S0809.5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES MONOHYDRATE</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>M1503.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, powder</td>
			<td>JUNSEI</td>
			<td>24440S1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropore Surgical tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>1530-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade stainless No.10</td>
			<td>FEATHER</td>
			<td>Unavailable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tube, 50ml</td>
			<td>SPL LIFE SCIENCES</td>
			<td>50050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macerozyme R-10</td>
			<td>YAKULT PHARMACEUTICAL IND.</td>
			<td>Unavailable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase ONOZUKA R-10</td>
			<td>YAKULT PHARMACEUTICAL IND.</td>
			<td>Unavailable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALBUMIN, BOVINE (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>M1902-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CALCIUM CHLORIDE, DIHYDRATE</td>
			<td>MP BIOMEDICALS</td>
			<td>0219463505-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Twister</td>
			<td>VISION SCIENTIFIC</td>
			<td>VS-96TW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screen cup for CD-1</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>S1145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screens for CD-1</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>S3895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>SPL LIFE SCIENCES</td>
			<td>10090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>HILGENBERG</td>
			<td>3150102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LABORATORY CENTRIFUGE / BENCH-TOP</td>
			<td>VISION SCIENTIFIC</td>
			<td>VS-5500N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>JUNSEI</td>
			<td>19015S0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P3911-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-GLUCOSE, ANHYDROUS</td>
			<td>BIO BASIC</td>
			<td>GB0219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
			<td>DUKSAN</td>
			<td>40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium nitrate tetrahydrate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C2786-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P2139-2KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>M2393-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube 13ml, 100x16mm, PP</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>55.515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td>1000412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td>101030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting Chamber</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td>650030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axioplan 2 Imaging Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Unavailable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tube 1.5ml</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>M3148-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Proteomics Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M107-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS, Ultra Pure Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0497-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (DL-Dithiothreitol), Biotechnology Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0281-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue sodium salt ACS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0312-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>JUNSEI</td>
			<td>27210S0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8)</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>632381</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying protein import into chloroplasts using protoplasts

Chlorplasttransitpeptidsekvensen er en afgørende organelle, der er ansvarlig for forskellige cellulære processer i planter, såsom fotosyntese og produktion af mange sekundære metabolitter og lipider. Kloroplaster kræver et stort antal proteiner for disse forskellige fysiologiske processer. Over er 95% af grønkorn proteiner kernen-kodet og importerede i grønkornene fra cytosol efter oversættelse på cytosole ribosomer. Således, den rette import- eller målretning af disse kerne-kodet grønkorn proteiner til kloroplaster er afgørende for et velfungerende grønkorn samt plante celle. Nucleus-kodet grønkorn proteiner indeholder signal sekvenser for specifikke målretning til grønkorn. Molekylære maskineri lokaliseret til grønkorn eller cytosol genkende disse signaler og udføre importprocessen. For at undersøge mekanismerne af protein import eller målretning til kloroplaster i vivo, udviklede vi en hurtig, effektiv protoplast-baseret metode til at analysere protein import til kloroplaster i Arabidopsis. I denne metode bruger vi protoplasts isoleret fra blad væv i Arabidopsis. Her give vi en detaljeret protokol for at bruge protoplasts til at efterforske den mekanisme, hvormed proteiner er importeret til grønkorn.

Import af proteiner i grønkornene kan undersøges ved hjælp af to metoder: Fluorescens mikroskopi og immunblot analyse efter SDS-side-medieret adskillelse. Her, vi brugte RBC-nt:GFP, en fusion konstruere kodning de 79 N-terminale aminosyrerester af røde blodlegemer indeholder transit-peptid smeltet til normal god landbrugspraksis. Når proteiner der importeres til grønkorn, grønne fluorescens signaler fra target proteinet RBC-nt:GFP skal fusionere med de røde fluorescerende signaler...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts at JoVE.com

Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

Her beskriver vi en protokol for at udtrykke proteiner i protoplasts ved hjælp af PEG-medieret transformation metode. Metoden giver nem udtryk af proteiner af interesse og effektiv undersøgelse af protein lokalisering og importprocessen for forskellige eksperimentelle betingelser in vivo.

At studere Protein Import til grønkorn ved hjælp af Protoplasts

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

Dette mysterium kan hjælpe med at besvare et par spørgsmål inden for cellebiologi såsom protein input i kloroplaster. Den største fordel ved denne teknologi er, at proteintilførsel til kloroplaster kan undersøges under en vivo betingelser. Demonstration af proceduren vil være Junho Lee og Hyangju Kang, to indlæg outs fra mit laboratorium.Til at begynde, høst intakt blad væv fra to uger gamle planter fra en til to B5 plader. Brug en kirurgisk kniv til at høste bladene og læg dem i et 50 milliliter konisk rør, der indeholder 25 milliliter enzymopløsning. Røret anbringes vandret på en roterende shaker og inkuberes med forsigtig omrøring ved 22 grader Celsius i mørke i otte til 12 timer, indtil der kun er stilke og stængler tilbage i opløsningen.Efter inkubationen filtreres enzymopløsningen med frigivne protoplaster gennem et 140 mikrometer porestørrelsesnet i en frisk petriskål. Derefter forsigtigt lag opløsningen på toppen af 15 milliliter 21% saccharose opløsning i en 50 milliliter konisk rør. Centrifuge røret i en svingende skovl rotor ved 98 g i 10 minutter med den laveste acceleration og deceleration indstillinger.Derefter anvendes paturapipet til forsigtigt at fjerne protoplasterne fra det øverste lag, der indeholder enzymopløsning, og fra grænsefladen mellem enzymeropløsningen og saccharoseopløsningen. Denne opløsning overføres til et konisk rør på 50 milliliter, der indeholder 30 milliliter W5-opløsning, og rørt informerer det, der skal blandes. Centrifuge røret ved 51 gs i seks minutter.Brug en pipette til at kassere denne supernatant omhyggeligt uden at forstyrre protoplasterne i pellets. Der tilsættes 25 milliliter W5-opløsning, og protoplasterne skal forsigtigt suspenderes igen. For stabilisering, inkubere i en fire Celsius køleskab i mindst en time.Efter fire grader Celsius inkubation, pellet protoplasterne helt ved centrifugering dem på 46 gs i to minutter. Fjern forsigtigt supernatenten helt og tilsæt MANG opløsning til protoplast pellet for at opnå fem gange ti til seks per milliliter. Brug en pipette til at tilsætte 10 mikrogram plasma-DNA og 300 mikroliter af protoplastopløsning til et friskt 13 milliliter rundtbundsrør.Bland ved forsigtigt at dreje rørene i hånden og derefter straks tilføje 300 mikroliter frisklavet 40% PEG opløsning. Bland helt ved at vippe røret næsten vandret og dreje det blid flere gange i hånden. Inkuber ved stuetemperatur i 30 minutter.Derefter tilsættes en milliliter W5 opløsning og blandes helt ved forsigtigt at dreje røret i hånden som tidligere. Prøven inkuberes i 10 minutter ved stuetemperatur. Gentag to gange mere med tilsætning først 1,5 milliliter og derefter to milliliter W5 og efter den endelige tilsætning og blanding, inkuberes i 30 minutter.Centrifuge røret ved 46 gs i fire minutter og kassér derefter supernatanten. Tilsæt to milliliter W5 opløsning til pellet og bland forsigtigt, men helt, på samme måde som tidligere. Inkubere ved 22 grader Celsius i et mørkt kammer i 18 timer.For at analysere proteinimporten ved hjælp af florescencemikroskopi skal du bruge en pipette med en trimmet spids til at placere 10 mikroliter af protoplastopløsningen på et glasrutsjebane. Brug en dækseld til omhyggeligt at dække opløsningen for at undgå at beskadige protoplasterne. Placer dias på scenen af en fluorescens mikroskop med en excitation optagelse filter, der er indstillet til observation af grønne fluorescerende protein og klorofyl autofluorescens.Brug en afkølet afgift par enhed kamera til at tage billeder og behandle dem ved hjælp af en forestille redigeringssoftware til at producere pseudo-farvebilleder. Ved total proteinekstraktion og immunudsugning fjernes en milliliter fra protoplastopløsningen, og de resterende en milliliter blandes. Denne protoplastopløsning overføres til et centrifugerør og centrifugeres ved 46 gs i fire minutter.Fjern supernatanten efter centrifugering, og tilsæt 80 mikroliter denatureringsbuffer. Vortex vigoriously i fem sekunder. Tilføj fem XDS prøve buffer, bland godt og kog i 10 minutter til protese.Fortsæt med standard STS side og immunoblotting med anti-GFP antistof. RbcS og TGFT, en fusionskonstruktion, der koderede de 79 ende terminale aminosyrerester af RBCS, der indeholder transit peptid smeltet til GFP, blev anvendt til at undersøge import af proteiner til kloroplaster ved hjælp af florescencemikroskopi og immunblotting. Ved undersøgelse af florescencemikroskopien fusionerede grønne fluorescerende signaler fra målproteinet med de røde fluorescerende signaler fra klorofylselumsæsens, der indikerer proteinimport til kloroplaster.Efter isolering af totalprotein observeres der to proteinbånd i immunoblot, hvilket viser, at et protein blev korrekt importeret til kloroplaster. Det øverste bånd svarer til den fulde længde forløber og det nederste bånd til den forarbejdede form efter import til kloroplaster. Mængden af proteinets forarbejdede form steg på en tidsafhængig måde, hvilket tyder på, at proteinet importeres til kloroplaster.På denne udvikling banede denne teknik vejen for forskere inden for cellebiologi at udforske protein trættende eller membran tråd picking i Arabidopsis.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Brug Stillads Liposomer at Rekonstituer Lipid-proksimal protein-protein interaktioner<em&gt; In vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrosprayioniserings Brint-deuterium Exchange-massespektrometri til at studere proteiners struktur og Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

MRNA Interactome Capture fra Plant Protoplasts

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Anaerob Protein oprensning og kinetisk analyse via ilt elektrode til at studere DesB Dioxygenase aktivitet og hæmning

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

Struktur løsning af fluorescerende proteiner Cerulean ved hjælp af MeshAndCollect

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Høj følsomhed måling af transskription faktor-DNA bindende tilhørsforhold ved konkurrencedygtige titrering med Fluorescens mikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse af proteinfoldning, Transport og nedbrydning i levende celler af radioaktivt puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

At studere RNA Interactors af Protein Kinase RNA-aktiveret under pattedyr cellecyklus

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Anvendelse af Biolayer interferometri (BLI) til undersøgelse af protein-protein interaktioner i transkriptionen

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluering af protein-protein interaktioner ved hjælp af en on-membran fordøjelse teknik

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...