Name: studying protein import into chloroplasts using protoplasts
Uploaded: 2018-12-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts at JoVE.com

Dit werk werd uitgevoerd met de ondersteuning van het coöperatieve onderzoeksprogramma voor landbouw wetenschap en technologische ontwikkeling (Project nr. PJ010953012018), Rural Development Administration en de subsidie van de National Research Foundation (Korea) gefinancierd door het ministerie van wetenschap en ICT (nr. 2016R1E1A1A02922014), Republiek Korea.

1. groei van Arabidopsis planten
<ol><li>Bereiden 1 L Gamborg B5 (B5) medium door het toevoegen van 3,2 g van B5 medium zoals vitaminen, 20 g van sacharose, 0,5 g 2-(N-morpholino) ethaan sulfonzuur (MES) tot ca. 800 mL gedeïoniseerd water en breng de pH op 5.7 met kaliumhydroxide (KOH). Toevoegen meer gedeïoniseerd water zodat het totale volume 1 L. toevoegen 8 g phytoagar en autoclaaf gedurende 15 minuten staan bij 121 ° C.</li>
	<li>Toestaan dat het medium tot 55 ° C afkoelen en giet van 20-25 mL B5 voedingsbodem...

<ol>
	<li>Jarvis, P., Lopez-Juez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+and+homeostasis+of+chloroplasts+and+other+plastids.">Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).</li><li>Neuhaus, H. E., Emes, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonphotosynthetic+Metabolism+in+Plastids.">Nonphotosynthetic Metabolism in Plastids.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 51, 111-140 (2000).</li><li>Rolland, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biosynthetic+capacities+of+the+plastids+and+integration+between+cytoplasmic+and+chloroplast+processes.">The biosynthetic capacities of the plastids and integration between cytoplasmic and chloroplast processes.</a> Annual Review of Genetics. 46, 233-264 (2012).</li><li>Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+nucleus-encoded+proteins+to+chloroplasts+in+plants.">Targeting of nucleus-encoded proteins to chloroplasts in plants.</a> New Phytologist. 179 (2), 257-285 (2008).</li><li>Li, H. M., Chiu, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Transport+into+Chloroplasts.">Protein Transport into Chloroplasts.</a> Annual Review of Plant Biology. 61, 157-180 (2010).</li><li>Keegstra, K., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+import+and+routing+systems+of+chloroplasts.">Protein import and routing systems of chloroplasts.</a> Plant Cell. 11 (4), 557-570 (1999).</li><li>Gasser, S. M., Daum, G., Schatz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Import+of+proteins+into+mitochondria.+Energy-dependent+uptake+of+precursors+by+isolated+mitochondria.">Import of proteins into mitochondria. Energy-dependent uptake of precursors by isolated mitochondria.</a> Journal of Biological Chemistry. 257 (21), 13034-13041 (1982).</li><li>Smeekens, S., Bauerle, C., Hageman, J., Keegstra, K., Weisbeek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+transit+peptide+in+the+routing+of+precursors+toward+different+chloroplast+compartments.">The role of the transit peptide in the routing of precursors toward different chloroplast compartments.</a> Cell. 46 (3), 365-375 (1986).</li><li>Lee, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+nuclear-encoded+plastid+transit+peptides+contain+multiple+sequence+subgroups+with+distinctive+chloroplast-targeting+sequence+motifs.">Arabidopsis nuclear-encoded plastid transit peptides contain multiple sequence subgroups with distinctive chloroplast-targeting sequence motifs.</a> Plant Cell. 20 (6), 1603-1622 (2008).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+targeting+of+the+Arabidopsis+F1-ATPase+gamma-subunit+via+multiple+compensatory+and+synergistic+presequence+motifs.">Mitochondrial targeting of the Arabidopsis F1-ATPase gamma-subunit via multiple compensatory and synergistic presequence motifs.</a> Plant Cell. 24 (12), 5037-5057 (2012).</li><li>Jin, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+dynamin-like+protein,+ADL6,+is+involved+in+trafficking+from+the+trans-Golgi+network+to+the+central+vacuole+in+Arabidopsis.">A new dynamin-like protein, ADL6, is involved in trafficking from the trans-Golgi network to the central vacuole in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 13 (7), 1511-1526 (2001).</li><li>Lee, K. H., Kim, D. H., Lee, S. W., Kim, Z. H., Hwang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+import+experiments+in+protoplasts+reveal+the+importance+of+the+overall+context+but+not+specific+amino+acid+residues+of+the+transit+peptide+during+import+into+chloroplasts.">In vivo import experiments in protoplasts reveal the importance of the overall context but not specific amino acid residues of the transit peptide during import into chloroplasts.</a> Molecules and Cells. 14 (3), 388-397 (2002).</li><li>Lee, D. W., Lee, S., Oh, Y. J., Hwang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sequence+motifs+in+the+rubisco+small+subunit+transit+peptide+independently+contribute+to+Toc159-dependent+import+of+proteins+into+chloroplasts.">Multiple sequence motifs in the rubisco small subunit transit peptide independently contribute to Toc159-dependent import of proteins into chloroplasts.</a> Plant Physiology. 151 (1), 129-141 (2009).</li><li>Lee, D. W., Woo, S., Geem, K. R., Hwang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+motifs+in+transit+peptides+act+as+independent+functional+units+and+can+be+transferred+to+new+sequence+contexts.">Sequence motifs in transit peptides act as independent functional units and can be transferred to new sequence contexts.</a> Plant Physiology. 169 (1), 471-484 (2015).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+the+hydrophobicity+and+a+positively+charged+region+flanking+the+C-terminal+region+of+the+transmembrane+domain+of+signal-anchored+proteins+play+critical+roles+in+determining+their+targeting+specificity+to+the+endoplasmic+reticulum+or+endosymbiotic+organelles+in+Arabidopsis+cells.">Both the hydrophobicity and a positively charged region flanking the C-terminal region of the transmembrane domain of signal-anchored proteins play critical roles in determining their targeting specificity to the endoplasmic reticulum or endosymbiotic organelles in Arabidopsis cells.</a> Plant Cell. 23 (4), 1588-1607 (2011).</li><li>Cleary, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+plant+mitochondria+import+chloroplast+precursor+proteins+in+vitro+with+the+same+efficiency+as+chloroplasts.">Isolated plant mitochondria import chloroplast precursor proteins in vitro with the same efficiency as chloroplasts.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (7), 5562-5569 (2002).</li></ol>

Wij voorzien een gedetailleerd protocol in het gebruik van protoplasten van Arabidopsis aan studie eiwit invoer in chloroplasten. Deze methode is krachtig voor het onderzoeken van het importproces eiwit. Deze eenvoudige, veelzijdige techniek is nuttig voor de behandeling van de gerichtheid van de beoogde lading eiwitten tot chloroplasten. Met deze methode worden protoplasten bereid met blad weefsels van Arabidopsis11,12 , die kan worden verkrege...

De chloroplast is een van de belangrijkste organellen in planten. Een van de belangrijkste functies van chloroplasten is fotosynthese1uitvoeren. Chloroplasten zijn ook uitvoeren van vele andere biochemische reacties voor de productie van vetzuren, aminozuren en nucleotiden tal secundaire metabolieten1,2. Voor al deze reacties vereist chloroplasten een groot aantal verschillende soorten eiwitten. Het genoom chloroplast bevat echter slechts ongeveer 100 genen3,4. Daarom moeten de chloroplasten de meerderheid van hun eiwitten uit het cytosol importeren. In feite, werden meeste chloroplast eiwitten aangetoond te worden geïmporteerd uit het cytosol na vertaling4,5,6. Plantaardige cellen vereisen specifieke mechanismen eiwitten importeren van het cytosol naar chloroplasten. Echter, hoewel deze eiwitten importeren mechanismen zijn onderzocht voor de afgelopen decennia, wij nog steeds volledig begrijpen niet hen op moleculair niveau. Hier, voorzien wij een gedetailleerde methode voor de voorbereiding van protoplasten en exogenously uiten van genen in protoplasten. Deze methode zou kunnen zijn waardevol voor het ophelderen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan eiwit invoer in chloroplasten in detail.
Eiwit importeren kan worden bestudeerd met behulp van veel verschillende benaderingen. Een van deze methoden impliceert het gebruik van een in vitro eiwit invoer systeem7,8. Met behulp van deze aanpak, in vitro-vertaalde proteïne-precursors worden geïncubeerd met gezuiverde chloroplasten in vitroen eiwitten importeren wordt geanalyseerd door SDS-PAGE gevolgd door westelijke vlekkenanalyse. Het voordeel van deze aanpak is dat elke stap van eiwitten importeren in chloroplasten in detail bestudeerd kan worden. Dus, deze methode heeft wijd gebruikt te bepalen van de componenten van de import van de moleculaire machine van eiwit en te ontleden opeenvolgingsinformatie voor doorvoer peptides. Meer recentelijk, een andere benadering met betrekking tot het gebruik van protoplasten uit blad weefsels werd ontwikkeld en het is geworden wijd gebruikt om te studeren eiwit invoer in chloroplasten9,10. Het voordeel van deze aanpak is dat protoplasten een cellulaire omgeving die dichter bij die van de onbeschadigde cellen dan de in vitro -systeem. Dus, de protoplast-systeem stelt ons in staat om aan te pakken veel extra aspecten van dit proces, zoals de bijbehorende cytosolische gebeurtenissen en hoe de specificiteit van targeting signalen wordt bepaald. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor het gebruik van protoplasten aan studie eiwit invoer in chloroplasten.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>GAMBORG B5 MEDIUM INCLUDING VITAMINS</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>G0210.0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUCROSE</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>S0809.5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES MONOHYDRATE</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>M1503.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, powder</td>
			<td>JUNSEI</td>
			<td>24440S1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropore Surgical tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>1530-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade stainless No.10</td>
			<td>FEATHER</td>
			<td>Unavailable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tube, 50ml</td>
			<td>SPL LIFE SCIENCES</td>
			<td>50050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macerozyme R-10</td>
			<td>YAKULT PHARMACEUTICAL IND.</td>
			<td>Unavailable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase ONOZUKA R-10</td>
			<td>YAKULT PHARMACEUTICAL IND.</td>
			<td>Unavailable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALBUMIN, BOVINE (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>M1902-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CALCIUM CHLORIDE, DIHYDRATE</td>
			<td>MP BIOMEDICALS</td>
			<td>0219463505-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Twister</td>
			<td>VISION SCIENTIFIC</td>
			<td>VS-96TW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screen cup for CD-1</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>S1145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screens for CD-1</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>S3895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>SPL LIFE SCIENCES</td>
			<td>10090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>HILGENBERG</td>
			<td>3150102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LABORATORY CENTRIFUGE / BENCH-TOP</td>
			<td>VISION SCIENTIFIC</td>
			<td>VS-5500N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>JUNSEI</td>
			<td>19015S0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P3911-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-GLUCOSE, ANHYDROUS</td>
			<td>BIO BASIC</td>
			<td>GB0219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
			<td>DUKSAN</td>
			<td>40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium nitrate tetrahydrate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C2786-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P2139-2KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>M2393-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube 13ml, 100x16mm, PP</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>55.515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td>1000412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td>101030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting Chamber</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td>650030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axioplan 2 Imaging Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Unavailable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tube 1.5ml</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>M3148-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Proteomics Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M107-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS, Ultra Pure Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0497-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (DL-Dithiothreitol), Biotechnology Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0281-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue sodium salt ACS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0312-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>JUNSEI</td>
			<td>27210S0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8)</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>632381</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying protein import into chloroplasts using protoplasts

De chloroplast is een essentiële organel dat verantwoordelijk is voor diverse cellulaire processen in planten, zoals fotosynthese en de productie van veel secundaire metabolieten en lipiden. Chloroplasten vereist een groot aantal proteïnen voor deze verschillende fysiologische processen. Meer dan zijn 95% van chloroplast eiwitten kern-gecodeerd en geïmporteerd in de chloroplasten van het cytosol na vertaling op cytosolische ribosomen. De juiste invoer of richten van deze kern-gecodeerde chloroplast proteïnen tot chloroplasten is dus essentieel voor de goede werking van chloroplasten, alsmede de plant cel. Nucleus-gecodeerde chloroplast eiwitten bevatten signaal reeksen voor specifieke targeting tot chloroplasten. Moleculaire machines gelokaliseerd op de chloroplast of cytosol deze signalen herkennen en uitvoeren van het importproces. Voor het onderzoek naar de mechanismen van eiwitten importeren of het gericht op chloroplasten in vivo, ontwikkelden we een snelle, efficiënte protoplast gebaseerde methode voor het analyseren van eiwitten invoer in chloroplasten of Arabidopsis. In deze methode gebruiken we geïsoleerd van blad weefsels van Arabidopsisprotoplasten. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor het gebruik van protoplasten te onderzoeken het mechanisme waardoor eiwitten worden geïmporteerd in chloroplasten.

De invoer van proteïnen in chloroplasten kan worden onderzocht met behulp van twee benaderingen: fluorescentie microscopie en immunoblot analyse na SDS-pagina-gemedieerde scheiding. Hier, we gebruikten RBC-nt:GFP, een fusie bouwen de 79 N-terminale aminozuurresidu's van RBC met de transit peptide gesmolten tot GFP-codering. Wanneer eiwitten zijn geïmporteerd in chloroplasten, groene fluorescentie signalen van het doel eiwit RBC-nt:GFP moeten samenvoegen met de rode fluorescerende signal...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts at JoVE.com

Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

Hier beschrijven we een protocol om het uiten van eiwitten in protoplasten met behulp van PEG-gemedieerde transformatie methode. De methode biedt eenvoudige uitdrukking van proteïnen van belang, en efficiënte opsporing van eiwit lokalisatie en het importproces voor verschillende experimentele omstandigheden in vivo.

Eiwit invoer in chloroplasten met behulp van protoplasten studeren

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

Dit mysterie kan helpen bij het beantwoorden van een paar vragen op het gebied van celbiologie, zoals eiwitinput in chloroplasten. Het belangrijkste voordeel van deze technologie is dat eiwitinput in chloroplasten onder en vivo omstandigheden kan worden bestudeerd. Het aantonen van de procedure zal Junho Lee en Hyangju Kang, twee post outs van mijn laboratorium.Om te beginnen, oogst intacte bladweefsels van twee weken oude planten van een tot twee B5 platen. Gebruik een chirurgisch mes om de bladeren te oogsten en plaats ze in een 50 milliliter conische buis met 25 milliliter enzymoplossing. Plaats de buis horizontaal op een roterende shaker en broed met zachte agitatie bij 22 graden Celsius in het donker gedurende acht tot 12 uur totdat alleen bloemblaadjes en stengels in de oplossing blijven.Na het voltooien van incubatie, filter de enzymoplossing met vrijgegeven protoplasten door een 140 micrometer porie grootte gaas in een verse petrischaal. Leg vervolgens voorzichtig de oplossing op 15 milliliter van 21%sucroseoplossing in een conische buis van 50 milliliter. Centrifugeer de buis in een swingende emmerrotor van 98 gs gedurende 10 minuten met de laagste acceleratie- en vertragingsinstellingen.Gebruik daarna patura pipet om de protoplasten zorgvuldig te verwijderen uit de bovenste laag met enzymoplossing en uit de interface tussen de enzymoplossing en sacharoseoplossing. Breng deze oplossing over naar een 50 milliliter conische buis met 30 milliliter W5-oplossing en keer de buis om te mengen. Centrifuge de buis op 51 gs gedurende zes minuten.Gebruik een pipet om deze supernatant voorzichtig weg te gooien zonder de protoplasten in de pellet te verstoren. Voeg 25 milliliter W5-oplossing toe en schort de protoplasten voorzichtig opnieuw op. Voor stabilisatie, incubeer in een vier Celsius koelkast voor een minimum van een uur.Na vier graden Celsius incubatie, pellet de protoplasten volledig door centrifugeren ze op 46 gs gedurende twee minuten. Verwijder de supernatent voorzichtig volledig en voeg MANG-oplossing toe aan de protoplastpellet om vijf keer tien tot zes tot zes per milliliter te bereiken. Gebruik een pipet om 10 microgram van het plasma-DNA en 300 microliter protoplastoplossing toe te voegen aan een verse 13 milliliter ronde buis met bodem.Meng door de buizen voorzichtig met de hand te draaien en voeg dan onmiddellijk 300 microliters vers bereide 40%PEG-oplossing toe. Meng volledig door het kantelen van de buis bijna horizontaal en draaien het zacht meerdere malen met de hand. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.Voeg vervolgens een milliliter W5-oplossing toe en meng volledig door de buis zoals voorheen voorzichtig met de hand te draaien. Incubeer het monster gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Herhaal nog twee keer met het toevoegen van eerst 1,5 milliliter en vervolgens twee milliliter W5 en na de uiteindelijke toevoeging en het mengen, incubeer gedurende 30 minuten.Centrifuge de buis op 46 gs gedurende vier minuten en gooi de supernatant. Voeg twee milliliter W5-oplossing toe aan de pellet en meng zachtjes, maar volledig, op dezelfde manier als voorheen. Broed op 22 graden Celsius in een donkere kamer gedurende 18 uur.Om de eiwitimport met behulp van florescencemicroscopie te analyseren, gebruikt u een pipet met een bijgesneden tip om 10 microliter van de protoplastoplossing op een glazen glijbaan te plaatsen. Gebruik een afdeksel om de oplossing zorgvuldig te bedekken om beschadiging van de protoplasten te voorkomen. Plaats de dia op het podium van een fluorescentiemicroscoop met een excitatie-toelatingsfilter dat is ingesteld voor het observeren van groen fluorescerend eiwit en chlorofyl autofluorescentie.Gebruik een gekoelde camera voor het koppelen van een lading om beelden vast te leggen en te verwerken met behulp van een imagine-bewerkingssoftware om pseudo-kleurenbeelden te produceren. Voor totale eiwitextractie en immunoblotting, verwijder een milliliter uit de protoplast oplossing en meng de resterende een milliliter. Breng deze protoplastoplossing gedurende vier minuten over in een centrifugebuis en centrifuge op 46 gs.Verwijder de supernatant na het voltooien van centrifugatie en voeg 80 microliter denaturatiebuffer toe. Vortex krachtig voor vijf seconden. Voeg vijf XDS monster buffer, meng goed en kook gedurende 10 minuten tot denature.Ga verder met de standaard STS-pagina en immunoblotting met anti-GFP-antilichaam. RbcS en TGFT, een fusieconstructie die de 79 eindeindige aminozuurresten van RBCS met de doorvoerpeptide bevat die tot GFP is gesmolten, werd gebruikt om de invoer van eiwitten in chloroplasten te bestuderen door florescentiemicroscopie en immunoblotting. Wanneer onderzocht door florescence microscopie, groene fluorescerende signalen van het doel eiwit samengevoegd met de rode fluorescerende signalen van chlorofyl autoflores die eiwit importeren in chloroplasten.Na het isoleren van het totale eiwit worden twee eiwitbanden waargenomen in de immunoblot, waaruit blijkt dat een eiwit goed werd geïmporteerd in chloroplasten. De bovenste band komt overeen met de volledige lengteprecursor en de onderste band met de verwerkte vorm na invoer in chloroplasten. De hoeveelheid van de verwerkte vorm van het eiwit steeg op een tijd-afhankelijke manier, wat suggereert dat het eiwit wordt ingevoerd in chloroplasten.Bij deze ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van celbiologie om eiwitbiedige of membraandraadplukjes in Arabidopsis te onderzoeken.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Gebruik Steiger Liposomen lipide-proximale eiwit-eiwit interacties reconstitueren<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Tijdsgeresolveerde elektrosprayionisatie waterstof-deuterium Exchange Massaspectrometrie voor het bestuderen van Protein Structure en Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

MRNA Interactome Capture van Plant Protoplasts

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Anaërobe EiwitReiniging en kinetische analyse via zuurstof-elektrode voor het bestuderen van de activiteit van de DesB Dioxygenase en inhibitie

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

Oplossing van de structuur van de Fluorescent Protein Cerulean met behulp van MeshAndCollect

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Hoge gevoeligheid meten van transcriptie Factor-DNA-bindende affiniteiten concurrerende getitreerd wordt met behulp van fluorescentie microscopie

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse van de vouwing van eiwitten, vervoer en afbraak in levende cellen door radioactieve Pulse Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Bestuderen van RNA Interactors van proteïne Kinase RNA-geactiveerd tijdens de zoogdieren celcyclus

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Toepassing van Biolayer interferometrie (BLI) voor het bestuderen van eiwit-eiwit interacties in transcriptie

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluatie van eiwit-eiwit interacties met behulp van een on-membraan Vergistings techniek

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...