Name: studying protein import into chloroplasts using protoplasts
Uploaded: 2018-12-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts at JoVE.com

Diese Arbeiten erfolgten mit den Stützen der Cooperative Research Program für Agrarwissenschaft und Technologie-Entwicklung (Projekt Nr. PJ010953012018), Rural Development Administration und der National Research Foundation (Korea) Zuschuss gefördert durch das Ministerium für Wissenschaft und IKT (Nr. 2016R1E1A1A02922014), Republik Korea.

1. Wachstum von Arabidopsis-Pflanzen
<ol><li>Bereiten Sie 1 L Gamborg B5 (B5) Medium durch Zugabe von 3,2 g B5 Medium einschließlich Vitamine, 20 g Saccharose, 0,5 g des 2-(N-morpholino) Ethan Sulfonsäure (MES), etwa 800 mL entionisiertem Wasser, und stellen Sie den pH-Wert auf 5,7 mit Kalilauge (KOH). Hinzufügen mehr deionisiertes Wasser bringen das Gesamtvolumen auf 1 L. hinzufügen 8 g Phytoagar und Autoklaven für 15 min bei 121 ° C.</li>
	<li>Lassen Sie das Medium bis zu 55 ° C abkühlen und gießen 20 – 25...

<ol>
	<li>Jarvis, P., Lopez-Juez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+and+homeostasis+of+chloroplasts+and+other+plastids.">Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).</li><li>Neuhaus, H. E., Emes, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonphotosynthetic+Metabolism+in+Plastids.">Nonphotosynthetic Metabolism in Plastids.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 51, 111-140 (2000).</li><li>Rolland, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biosynthetic+capacities+of+the+plastids+and+integration+between+cytoplasmic+and+chloroplast+processes.">The biosynthetic capacities of the plastids and integration between cytoplasmic and chloroplast processes.</a> Annual Review of Genetics. 46, 233-264 (2012).</li><li>Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+nucleus-encoded+proteins+to+chloroplasts+in+plants.">Targeting of nucleus-encoded proteins to chloroplasts in plants.</a> New Phytologist. 179 (2), 257-285 (2008).</li><li>Li, H. M., Chiu, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Transport+into+Chloroplasts.">Protein Transport into Chloroplasts.</a> Annual Review of Plant Biology. 61, 157-180 (2010).</li><li>Keegstra, K., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+import+and+routing+systems+of+chloroplasts.">Protein import and routing systems of chloroplasts.</a> Plant Cell. 11 (4), 557-570 (1999).</li><li>Gasser, S. M., Daum, G., Schatz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Import+of+proteins+into+mitochondria.+Energy-dependent+uptake+of+precursors+by+isolated+mitochondria.">Import of proteins into mitochondria. Energy-dependent uptake of precursors by isolated mitochondria.</a> Journal of Biological Chemistry. 257 (21), 13034-13041 (1982).</li><li>Smeekens, S., Bauerle, C., Hageman, J., Keegstra, K., Weisbeek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+transit+peptide+in+the+routing+of+precursors+toward+different+chloroplast+compartments.">The role of the transit peptide in the routing of precursors toward different chloroplast compartments.</a> Cell. 46 (3), 365-375 (1986).</li><li>Lee, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+nuclear-encoded+plastid+transit+peptides+contain+multiple+sequence+subgroups+with+distinctive+chloroplast-targeting+sequence+motifs.">Arabidopsis nuclear-encoded plastid transit peptides contain multiple sequence subgroups with distinctive chloroplast-targeting sequence motifs.</a> Plant Cell. 20 (6), 1603-1622 (2008).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+targeting+of+the+Arabidopsis+F1-ATPase+gamma-subunit+via+multiple+compensatory+and+synergistic+presequence+motifs.">Mitochondrial targeting of the Arabidopsis F1-ATPase gamma-subunit via multiple compensatory and synergistic presequence motifs.</a> Plant Cell. 24 (12), 5037-5057 (2012).</li><li>Jin, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+dynamin-like+protein,+ADL6,+is+involved+in+trafficking+from+the+trans-Golgi+network+to+the+central+vacuole+in+Arabidopsis.">A new dynamin-like protein, ADL6, is involved in trafficking from the trans-Golgi network to the central vacuole in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 13 (7), 1511-1526 (2001).</li><li>Lee, K. H., Kim, D. H., Lee, S. W., Kim, Z. H., Hwang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+import+experiments+in+protoplasts+reveal+the+importance+of+the+overall+context+but+not+specific+amino+acid+residues+of+the+transit+peptide+during+import+into+chloroplasts.">In vivo import experiments in protoplasts reveal the importance of the overall context but not specific amino acid residues of the transit peptide during import into chloroplasts.</a> Molecules and Cells. 14 (3), 388-397 (2002).</li><li>Lee, D. W., Lee, S., Oh, Y. J., Hwang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sequence+motifs+in+the+rubisco+small+subunit+transit+peptide+independently+contribute+to+Toc159-dependent+import+of+proteins+into+chloroplasts.">Multiple sequence motifs in the rubisco small subunit transit peptide independently contribute to Toc159-dependent import of proteins into chloroplasts.</a> Plant Physiology. 151 (1), 129-141 (2009).</li><li>Lee, D. W., Woo, S., Geem, K. R., Hwang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+motifs+in+transit+peptides+act+as+independent+functional+units+and+can+be+transferred+to+new+sequence+contexts.">Sequence motifs in transit peptides act as independent functional units and can be transferred to new sequence contexts.</a> Plant Physiology. 169 (1), 471-484 (2015).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+the+hydrophobicity+and+a+positively+charged+region+flanking+the+C-terminal+region+of+the+transmembrane+domain+of+signal-anchored+proteins+play+critical+roles+in+determining+their+targeting+specificity+to+the+endoplasmic+reticulum+or+endosymbiotic+organelles+in+Arabidopsis+cells.">Both the hydrophobicity and a positively charged region flanking the C-terminal region of the transmembrane domain of signal-anchored proteins play critical roles in determining their targeting specificity to the endoplasmic reticulum or endosymbiotic organelles in Arabidopsis cells.</a> Plant Cell. 23 (4), 1588-1607 (2011).</li><li>Cleary, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+plant+mitochondria+import+chloroplast+precursor+proteins+in+vitro+with+the+same+efficiency+as+chloroplasts.">Isolated plant mitochondria import chloroplast precursor proteins in vitro with the same efficiency as chloroplasts.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (7), 5562-5569 (2002).</li></ol>

Wir stellten ein detailliertes Protokoll für die Verwendung von Protoplasten von Arabidopsis Protein Import in Chloroplasten zu studieren. Diese Methode ist für die Untersuchung von Protein-Importvorgang mächtig. Diese einfache und vielseitige Technik eignet sich für die Prüfung, die Angriffe auf die vorgesehene Ladung Proteine Chloroplasten. Mit dieser Methode werden Protoplasten von Blatt Gewebe von Arabidopsis11,12 zubereitet zu vielen v...

Die Chloroplasten ist eines der wichtigsten Organellen in Pflanzen. Eine der Hauptfunktionen der Chloroplasten soll Photosynthese1durchführen. Chloroplasten führen auch viele andere biochemischen Reaktionen für die Produktion von Fettsäuren, Aminosäuren, Nukleotide und zahlreiche sekundäre Pflanzenstoffe1,2. Für all diese Reaktionen erfordern Chloroplasten eine große Anzahl von verschiedenen Arten von Proteinen. Das Chloroplast Genom enthält jedoch nur etwa 100 Gene3,4. Daher müssen Chloroplasten den Großteil ihrer Proteine aus dem Cytosol importiert. In der Tat zeigten die meisten Chloroplasten Proteine nach Übersetzung4,5,6aus dem Cytosol importiert werden. Pflanzenzellen erfordern spezifische Mechanismen, Proteine aus dem Zytosol in Chloroplasten zu importieren. Doch obwohl diese Protein Import Mechanismen für die letzten Jahrzehnte untersucht wurden, verstehen wir noch nicht voll sie auf molekularer Ebene. Hier bieten wir eine detaillierte Methode für die Vorbereitung von Protoplasten und Gene im Protoplasten exogen zum Ausdruck zu bringen. Diese Methode kann für die Aufklärung der molekularen Mechanismen Protein Import in Chloroplasten im Detail sein.
Protein Import kann mit viele verschiedene Ansätze untersucht werden. Eine der folgenden Methoden beinhaltet die Verwendung von in-vitro- Protein Import System7,8. Mit diesem Ansatz, in-Vitro-übersetzte Protein Vorstufen sind mit gereinigtem Chloroplasten in Vitroinkubiert und Protein Import von SDS-PAGE gefolgt von western-Blot Analyse analysiert. Der Vorteil dieses Ansatzes ist, dass jeder Schritt von Protein Import in Chloroplasten im Detail untersucht werden kann. Daher hat diese Methode, die Komponenten der Protein Import molekulare Maschinerie zu definieren und Sequenzinformation für Transit Peptide sezieren verbreitet. In jüngerer Zeit, ein weiterer Ansatz unter Verwendung von Protoplasten von Blatt Gewebe wurde entwickelt und es wurde weithin Protein Import in Chloroplasten9,10Studium verwendet werden. Der Vorteil dieses Ansatzes ist, dass Protoplasten eine zelluläre Umgebung bereitstellen, die näher an der intakten Zellen als die in-Vitro -System ist. Die Protoplasten System ermöglicht so viele zusätzliche Aspekte dieses Prozesses, wie die damit verbundenen cytosolischen Ereignisse und wie die Spezifität des Zielens Signale bestimmt wird. Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll für die Verwendung von Protoplasten Protein Import in Chloroplasten zu studieren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>GAMBORG B5 MEDIUM INCLUDING VITAMINS</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>G0210.0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUCROSE</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>S0809.5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES MONOHYDRATE</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>M1503.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, powder</td>
			<td>JUNSEI</td>
			<td>24440S1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropore Surgical tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>1530-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade stainless No.10</td>
			<td>FEATHER</td>
			<td>Unavailable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tube, 50ml</td>
			<td>SPL LIFE SCIENCES</td>
			<td>50050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macerozyme R-10</td>
			<td>YAKULT PHARMACEUTICAL IND.</td>
			<td>Unavailable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase ONOZUKA R-10</td>
			<td>YAKULT PHARMACEUTICAL IND.</td>
			<td>Unavailable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALBUMIN, BOVINE (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>M1902-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CALCIUM CHLORIDE, DIHYDRATE</td>
			<td>MP BIOMEDICALS</td>
			<td>0219463505-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Twister</td>
			<td>VISION SCIENTIFIC</td>
			<td>VS-96TW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screen cup for CD-1</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>S1145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screens for CD-1</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>S3895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>SPL LIFE SCIENCES</td>
			<td>10090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>HILGENBERG</td>
			<td>3150102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LABORATORY CENTRIFUGE / BENCH-TOP</td>
			<td>VISION SCIENTIFIC</td>
			<td>VS-5500N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>JUNSEI</td>
			<td>19015S0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P3911-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-GLUCOSE, ANHYDROUS</td>
			<td>BIO BASIC</td>
			<td>GB0219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
			<td>DUKSAN</td>
			<td>40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium nitrate tetrahydrate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C2786-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P2139-2KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>M2393-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube 13ml, 100x16mm, PP</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>55.515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td>1000412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td>101030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting Chamber</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td>650030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axioplan 2 Imaging Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Unavailable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tube 1.5ml</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>M3148-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Proteomics Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M107-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS, Ultra Pure Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0497-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (DL-Dithiothreitol), Biotechnology Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0281-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue sodium salt ACS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0312-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>JUNSEI</td>
			<td>27210S0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8)</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>632381</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying protein import into chloroplasts using protoplasts

Die Chloroplasten ist eine wesentliche Organellen, die für verschiedene zelluläre Prozesse in Pflanzen wie Photosynthese und die Produktion von vielen sekundären Pflanzenstoffen und Lipiden ist. Chloroplasten erfordern eine große Zahl von Proteinen für diese verschiedenen physiologischen Prozesse. Über sind 95 % der Chloroplasten Proteine Zellkern codiert und in Chloroplasten aus dem Cytosol importiert nach der Übersetzung auf cytosolische Ribosomen. Somit ist die ordnungsgemäße Einfuhr oder Ausrichtung dieser Kern-codierte Chloroplasten Proteine zu Chloroplasten entscheidend für das reibungslose Funktionieren der Chloroplasten sowie der Pflanzenzelle. Kern-codierte Chloroplasten Proteine enthalten Signalsequenzen für spezifische Ausrichtung auf Chloroplasten. Molekulare Maschinen, die in den Chloroplasten oder Zytosol lokalisiert diese Signale zu erkennen und führen Sie den Importvorgang. Um die Mechanismen der Protein Import oder Ausrichtung auf Chloroplasten in Vivozu untersuchen, haben wir eine schnelle, effiziente Protoplasten basierende Methode zur Analyse von Protein Import in Chloroplasten von Arabidopsis entwickelt. Bei dieser Methode verwenden wir Protoplasten von Blatt Gewebe von Arabidopsisisoliert. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll für die Verwendung von Protoplasten, um den Mechanismus zu untersuchen, mit dem Proteine in Chloroplasten importiert werden.

Der Import von Proteinen in Chloroplasten kann untersucht werden, mit zwei Ansätzen: Fluoreszenz-Mikroskopie und Immunoblot Analyse nach der SDS-PAGE-vermittelten Trennung. Hier verwendeten wir Erythrozyten-Nt:GFP, eine Fusion konstruieren Codierung die 79 N-terminale Aminosäurereste von Erythrozyten enthalten das Transit-Peptid mit GFP verschmolzen. Beim Importieren von Proteinen in Chloroplasten grün fluoreszieren Signale von das Zielprotein Erythrozyten-Nt:GFP sollten mit den roten ...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts at JoVE.com

Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

Hier beschreiben wir ein Protokoll, um Proteine in Protoplasten zum Ausdruck zu bringen, mit PEG-vermittelten Transformationsmethode. Die Methode bietet einfach Ausdruck der interessierenden Proteine und effiziente Untersuchung von Protein-Lokalisierung und der Importvorgang für verschiedenen experimentellen Bedingungen in-vivo.

Studium der Protein Import in Chloroplasten mit Protoplasten

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

Dieses Geheimnis kann helfen, einige Fragen auf dem Gebiet der Zellbiologie zu beantworten, wie proteininput in Chloroplasten. Der Hauptvorteil dieser Technologie besteht darin, dass der Proteineintrag in Chloroplasten unter en vivo-Bedingungen untersucht werden kann. Demonstrieren datieren das Verfahren werden Junho Lee und Hyangju Kang, zwei Post-Outs aus meinem Labor.Zu Beginn, Ernten Sie intakte Blattgewebe von zwei Wochen alten Pflanzen von einem bis zwei B5-Platten. Verwenden Sie ein chirurgisches Messer, um die Blätter zu ernten und legen Sie sie in eine 50 Milliliter konische Röhre mit 25 Milliliter Enzymlösung. Das Rohr horizontal auf einen Drehschüttler legen und mit sanfter Rührung bei 22 Grad Celsius im Dunkeln acht bis zwölf Stunden lang bebrüten, bis nur noch Petioles und Stiele in der Lösung verbleiben.Filtern Sie nach Abschluss der Inkubation die Enzymlösung, die freigesetzte Protoplaste enthält, durch ein 140 Mikrometer porengroßes Netz in eine frische Petrischale. Dann die Lösung sorgfältig auf 15 Milliliter 21%Saccharoselösung in einem 50 Milliliter konischen Rohr schichten. Zentrifugieren Sie das Rohr in einem schwingenden Schaufelrotor bei 98 g für 10 Minuten mit den niedrigsten Beschleunigungs- und Verzögerungseinstellungen.Danach verwenden Sie PaturaPipetten, um die Protoplaste sorgfältig aus der obersten Schicht, die Enzymlösung enthält, und aus der Schnittstelle zwischen der Enzymlösung und der Saccharoselösung zu entfernen. Übertragen Sie diese Lösung in ein 50 Milliliter konisches Rohr mit 30 Milliliter W5 Lösung und invertieren Sie das Rohr zu mischen. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 51 g für sechs Minuten.Verwenden Sie eine Pipette, um diesen Überstand sorgfältig zu entsorgen, ohne die Protoplaste im Pellet zu stören. Fügen Sie 25 Milliliter W5-Lösung hinzu und hängen Sie die Protoplasten vorsichtig wieder auf. Zur Stabilisierung mindestens eine Stunde in einem Vier-Grad-Kühlschrank brüten.Nach vier Grad Celsius Inkubation, Pellet die Protoplaste vollständig durch Zentrifugieren sie bei 46 g für zwei Minuten. Entfernen Sie den Überstand sorgfältig und fügen Sie dem Protoplastpellet eine MANG-Lösung hinzu, um fünfmal zehn bis sechs Pro Milliliter zu erreichen. Verwenden Sie eine Pipette, um 10 Mikrogramm der Plasma-DNA und 300 Mikroliter Protoplastlösung zu einem frischen 13 Milliliter runden Röhrchen hinzuzufügen.Mischen Sie die Rohre vorsichtig von Hand und fügen Sie dann sofort 300 Mikroliter frisch zubereitete 40%PEG-Lösung hinzu. Mischen Sie das Rohr vollständig, indem Sie das Rohr fast horizontal kippen und es mehrmals von Hand sanft drehen. Bei Raumtemperatur 30 Minuten inkubieren.Dann fügen Sie einen Milliliter W5-Lösung hinzu und mischen Sie vollständig, indem Sie das Rohr vorsichtig von Hand drehen. Inkubieren Sie die Probe für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie zwei weitere Male mit dem Hinzufügen von zuerst 1,5 Milliliter und dann zwei Milliliter W5 und nach dem letzten Hinzufügen und Mischen, inkubieren für 30 Minuten.Zentrifugieren Sie das Rohr vier Minuten lang bei 46 g und entsorgen Sie dann den Überstand. Fügen Sie zwei Milliliter W5-Lösung in das Pellet und mischen Sie sanft, aber vollständig, in der gleichen Weise wie zuvor. Inkubieren Bei 22 Grad Celsius in einer dunklen Kammer für 18 Stunden.Um den Proteinimport mittels Floreszenzmikroskopie zu analysieren, verwenden Sie eine Pipette mit einer getrimmten Spitze, um 10 Mikroliter der Protoplastlösung auf einem Glasschlitten zu platzieren. Verwenden Sie einen Abdeckzettel, um die Lösung sorgfältig abzudecken, um eine Beschädigung der Protoplaste zu vermeiden. Platzieren Sie die Folie auf der Bühne eines Fluoreszenzmikroskops mit einem Anregungsaufnahmefilter, der für die Beobachtung von grünem fluoreszierendem Protein und Chlorophyll-Autofluoreszenz eingestellt ist.Verwenden Sie eine gekühlte Ladepaar-Gerätekamera, um Bilder zu erfassen und sie mit einer Software zur Bearbeitung von Pseudofarben zu verarbeiten. Für die gesamte Proteinextraktion und Immunoblotting, entfernen Sie einen Milliliter aus der Protoplastlösung und mischen Sie die restlichen einen Milliliter. Diese Protoplastlösung vier Minuten lang in ein Zentrifugenrohr und eine Zentrifuge mit 46 g geben.Entfernen Sie den Überstand nach Abschluss der Zentrifugation und fügen Sie 80 Mikroliter Denaturierungspuffer hinzu. Wirbel für fünf Sekunden. Fügen Sie fünf XDS-Probenpuffer hinzu, mischen Sie gut und kochen Sie für 10 Minuten, um zu denaturieren.Fahren Sie mit der Standard-STS-Seite und der Immunoblotting mit Anti-GFP-Antikörper. RbcS und TGFT, ein Fusionskonstrukt, das die 79 End-Terminal-Aminosäurerückstände von RBCS kodiert, die das mit GFP verschmolzene Transitpeptid enthalten, wurde verwendet, um den Import von Proteinen in Chloroplasten durch Floreszenzmikroskopie und Immunoblotting zu untersuchen. Bei der Untersuchung durch Floreszenzmikroskopie verschmolzen grüne fluoreszierende Signale des Zielproteins mit den roten fluoreszierenden Signalen der Chlorophyll-Autofloreszenz, die auf den Proteinimport in Chloroplasten hinweisen.Nach der Isolierung des Gesamtproteins werden im Immunoblot zwei Proteinbänder beobachtet, die zeigen, dass ein Protein ordnungsgemäß in Chloroplasten eingeführt wurde. Das obere Band entspricht dem Vorläufer in voller Länge und dem unteren Band der verarbeiteten Form nach dem Import in Chloroplasten. Die Menge der verarbeiteten Form des Proteins erhöhte sich zeitabhängig, was darauf hindeutet, dass das Protein in Chloroplasten eingeführt wird.Bei dieser Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Zellbiologie, um Proteinermüdung oder Membranfadenpickung in Arabidopsis zu erforschen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Scaffold Liposomen zu rekonstituieren Lipid-proximalen Protein-Protein-Wechselwirkungen<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Forschung

Biochemie

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisations Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie zur Struktur Protein Studium und Dynamik

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

MRNA Interactome Capture aus Pflanzenprotoplasten

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Anaerobe Proteinreinigung und kinetische Analyse über Sauerstoff-Elektrode für das Studium DesB Dioxygenase Aktivität und Hemmung

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

Struktur-Lösung von den fluoreszierenden Proteins Himmelblau mit MeshAndCollect

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Hohe Empfindlichkeit Messung der Transkription Faktor-DNA verbindlichen Affinitäten durch wettbewerbsfähige Titration mit Fluoreszenz-Mikroskopie

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse der Proteinfaltung, Transport und Abbau in lebenden Zellen durch radioaktive Puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Studium der RNA Interaktoren des RNA während der Säugetier-Zelle Zyklus aktiviert Proteinkinase

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Anwendung der Biolayer-Interferometrie (BLI) zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen bei der Transkription

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Bewertung von Protein-Protein-Wechselwirkungen mit einer On-Membrane-Verdauungstechnik

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...