Name: studying protein import into chloroplasts using protoplasts
Uploaded: 2018-12-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts at JoVE.com

עבודה זו בוצע עם תומך של הקואופרטיב תוכנית מחקר מדעי החקלאות ופיתוח טכנולוגיה (פרויקט מס ' PJ010953012018), ניהול פיתוח כפרי, המענק קרן מחקר לאומי (קוריאה) ממומן על ידי משרד המדע ICT (מספר 2016R1E1A1A02922014), הרפובליקה של קוריאה.

1. גידול של צמחים תודרנית
<ol><li>להכין 1 L Gamborg B5 בינונית (B5) על-ידי הוספת 3.2 g של B5 בינוני כולל ויטמינים, 20 גר' סוכרוז, 0.5 גר' 2-(N-morpholino) אתאן sulfonic חומצה (MES) כדי כ- 800 מ ל מים יונים, והתאימו את ה-pH ל 5.7 עם אשלגן הידרוקסידי (KOH). הוסף יותר יונים מים להביא את הנפח הכולל 8 הוסף ל 1g של phytoagar ו אוטוקלב למשך 15 דקות-121...

<ol>
	<li>Jarvis, P., Lopez-Juez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+and+homeostasis+of+chloroplasts+and+other+plastids.">Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).</li><li>Neuhaus, H. E., Emes, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonphotosynthetic+Metabolism+in+Plastids.">Nonphotosynthetic Metabolism in Plastids.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 51, 111-140 (2000).</li><li>Rolland, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biosynthetic+capacities+of+the+plastids+and+integration+between+cytoplasmic+and+chloroplast+processes.">The biosynthetic capacities of the plastids and integration between cytoplasmic and chloroplast processes.</a> Annual Review of Genetics. 46, 233-264 (2012).</li><li>Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+nucleus-encoded+proteins+to+chloroplasts+in+plants.">Targeting of nucleus-encoded proteins to chloroplasts in plants.</a> New Phytologist. 179 (2), 257-285 (2008).</li><li>Li, H. M., Chiu, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Transport+into+Chloroplasts.">Protein Transport into Chloroplasts.</a> Annual Review of Plant Biology. 61, 157-180 (2010).</li><li>Keegstra, K., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+import+and+routing+systems+of+chloroplasts.">Protein import and routing systems of chloroplasts.</a> Plant Cell. 11 (4), 557-570 (1999).</li><li>Gasser, S. M., Daum, G., Schatz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Import+of+proteins+into+mitochondria.+Energy-dependent+uptake+of+precursors+by+isolated+mitochondria.">Import of proteins into mitochondria. Energy-dependent uptake of precursors by isolated mitochondria.</a> Journal of Biological Chemistry. 257 (21), 13034-13041 (1982).</li><li>Smeekens, S., Bauerle, C., Hageman, J., Keegstra, K., Weisbeek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+transit+peptide+in+the+routing+of+precursors+toward+different+chloroplast+compartments.">The role of the transit peptide in the routing of precursors toward different chloroplast compartments.</a> Cell. 46 (3), 365-375 (1986).</li><li>Lee, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+nuclear-encoded+plastid+transit+peptides+contain+multiple+sequence+subgroups+with+distinctive+chloroplast-targeting+sequence+motifs.">Arabidopsis nuclear-encoded plastid transit peptides contain multiple sequence subgroups with distinctive chloroplast-targeting sequence motifs.</a> Plant Cell. 20 (6), 1603-1622 (2008).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+targeting+of+the+Arabidopsis+F1-ATPase+gamma-subunit+via+multiple+compensatory+and+synergistic+presequence+motifs.">Mitochondrial targeting of the Arabidopsis F1-ATPase gamma-subunit via multiple compensatory and synergistic presequence motifs.</a> Plant Cell. 24 (12), 5037-5057 (2012).</li><li>Jin, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+dynamin-like+protein,+ADL6,+is+involved+in+trafficking+from+the+trans-Golgi+network+to+the+central+vacuole+in+Arabidopsis.">A new dynamin-like protein, ADL6, is involved in trafficking from the trans-Golgi network to the central vacuole in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 13 (7), 1511-1526 (2001).</li><li>Lee, K. H., Kim, D. H., Lee, S. W., Kim, Z. H., Hwang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+import+experiments+in+protoplasts+reveal+the+importance+of+the+overall+context+but+not+specific+amino+acid+residues+of+the+transit+peptide+during+import+into+chloroplasts.">In vivo import experiments in protoplasts reveal the importance of the overall context but not specific amino acid residues of the transit peptide during import into chloroplasts.</a> Molecules and Cells. 14 (3), 388-397 (2002).</li><li>Lee, D. W., Lee, S., Oh, Y. J., Hwang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sequence+motifs+in+the+rubisco+small+subunit+transit+peptide+independently+contribute+to+Toc159-dependent+import+of+proteins+into+chloroplasts.">Multiple sequence motifs in the rubisco small subunit transit peptide independently contribute to Toc159-dependent import of proteins into chloroplasts.</a> Plant Physiology. 151 (1), 129-141 (2009).</li><li>Lee, D. W., Woo, S., Geem, K. R., Hwang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+motifs+in+transit+peptides+act+as+independent+functional+units+and+can+be+transferred+to+new+sequence+contexts.">Sequence motifs in transit peptides act as independent functional units and can be transferred to new sequence contexts.</a> Plant Physiology. 169 (1), 471-484 (2015).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+the+hydrophobicity+and+a+positively+charged+region+flanking+the+C-terminal+region+of+the+transmembrane+domain+of+signal-anchored+proteins+play+critical+roles+in+determining+their+targeting+specificity+to+the+endoplasmic+reticulum+or+endosymbiotic+organelles+in+Arabidopsis+cells.">Both the hydrophobicity and a positively charged region flanking the C-terminal region of the transmembrane domain of signal-anchored proteins play critical roles in determining their targeting specificity to the endoplasmic reticulum or endosymbiotic organelles in Arabidopsis cells.</a> Plant Cell. 23 (4), 1588-1607 (2011).</li><li>Cleary, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+plant+mitochondria+import+chloroplast+precursor+proteins+in+vitro+with+the+same+efficiency+as+chloroplasts.">Isolated plant mitochondria import chloroplast precursor proteins in vitro with the same efficiency as chloroplasts.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (7), 5562-5569 (2002).</li></ol>

סיפקנו פרוטוקול מפורט על השימוש protoplasts של תודרנית ללמוד חלבון לייבא לתוך מהכלורופלסט. שיטה זו היא חזקה על חקירת תהליך הייבוא חלבון. טכניקה זו פשוטה, תכליתי שימושית לבחינת הפגיעה המכוונת החלבונים מטענים המיועד ל מהכלורופלסט. באמצעות שיטה זו, protoplasts מוכנות רקמות עלים של תודרנית<sup c...

כלורופלסט הוא אחד organelles החשובים ביותר צמחים. אחת מהפונקציות העיקריות של מהכלורופלסט היא לבצע פוטוסינתזה1. מהכלורופלסט לבצע גם רבים תגובות ביוכימיות אחרות לייצור של חומצות שומן, חומצות אמינו, נוקלאוטידים ו מטבוליטים משניים רבים1,2. עבור כל תגובות אלו, מהכלורופלסט דורשים מספר רב של סוגים שונים של חלבונים. עם זאת, הגנום כלורופלסט מכיל רק כ-100 גנים3,4. לכן, מהכלורופלסט עליך לייבא את רוב החלבונים שלהם ציטוזול. למעשה, רוב החלבונים כלורופלסט הראו להם אפשרות לייבא את ציטוזול לאחר תרגום-4,-5,-6. תאי צמחים דורשים למנגנונים הספציפיים כדי לייבא חלבונים מן ציטוזול מהכלורופלסט. עם זאת, למרות מנגנונים ייבוא חלבונים אלה נחקרו מספר עשורים, אנחנו עדיין לא מבינים לחלוטין אותם ברמה המולקולרית. כאן, אנו מספקים שיטה מפורטת עבור הכנת protoplasts ולבטא exogenously גנים protoplasts. שיטה זו יכולה להיות יקר עבור שחקרתי את המנגנונים המולקולריים שבבסיס חלבון לייבא לתוך מהכלורופלסט בפירוט.
חלבון הייבוא ניתן יהיה ללמוד שימוש בגישות שונות רבות. אחת משיטות אלה כרוכה בשימוש במבחנה חלבון ייבוא מערכת7,8. שימוש בגישה זו במבחנה-חלבון מתורגם מבשרי מודגרת עם מהכלורופלסט מטוהרים במבחנה, ומנותח חלבון הייבוא על-ידי מרחביות-דף ואחריו תספיג ניתוח. היתרון של גישה זו הוא כי כל שלב של חלבון ייבוא לתוך מהכלורופלסט ניתן יהיה ללמוד בפירוט. לכן, בשיטה זו כבר בשימוש נרחב כדי להגדיר את הרכיבים של המנגנון המולקולרי של ייבוא חלבון וכדי לנתח מידע רצף עבור המעבר פפטידים. לאחרונה, גישה אחרת הכרוכות של protoplasts רקמות עלים פותחה, יש להיות בשימוש נרחב ללמוד חלבון לייבא לתוך מהכלורופלסט9,10. היתרון של גישה זו הוא כי protoplasts מספקים סביבה הסלולר זה קרוב לזה של תאים שלמים מאשר מערכת במבחנה . לפיכך, המערכת פרוטופלאסט מאפשרת לנו להתייחס היבטים נוספים של תהליך זה, כגון האירועים הקשורים cytosolic, איך נקבע ייחודה של פילוח אותות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט על השימוש protoplasts ללמוד חלבון לייבא לתוך מהכלורופלסט.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>GAMBORG B5 MEDIUM INCLUDING VITAMINS</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>G0210.0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUCROSE</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>S0809.5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES MONOHYDRATE</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>M1503.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, powder</td>
			<td>JUNSEI</td>
			<td>24440S1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropore Surgical tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>1530-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade stainless No.10</td>
			<td>FEATHER</td>
			<td>Unavailable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tube, 50ml</td>
			<td>SPL LIFE SCIENCES</td>
			<td>50050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macerozyme R-10</td>
			<td>YAKULT PHARMACEUTICAL IND.</td>
			<td>Unavailable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase ONOZUKA R-10</td>
			<td>YAKULT PHARMACEUTICAL IND.</td>
			<td>Unavailable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALBUMIN, BOVINE (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>M1902-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CALCIUM CHLORIDE, DIHYDRATE</td>
			<td>MP BIOMEDICALS</td>
			<td>0219463505-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Twister</td>
			<td>VISION SCIENTIFIC</td>
			<td>VS-96TW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screen cup for CD-1</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>S1145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screens for CD-1</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>S3895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>SPL LIFE SCIENCES</td>
			<td>10090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>HILGENBERG</td>
			<td>3150102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LABORATORY CENTRIFUGE / BENCH-TOP</td>
			<td>VISION SCIENTIFIC</td>
			<td>VS-5500N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>JUNSEI</td>
			<td>19015S0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P3911-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-GLUCOSE, ANHYDROUS</td>
			<td>BIO BASIC</td>
			<td>GB0219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
			<td>DUKSAN</td>
			<td>40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium nitrate tetrahydrate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C2786-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P2139-2KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>M2393-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube 13ml, 100x16mm, PP</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>55.515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td>1000412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td>101030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting Chamber</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td>650030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axioplan 2 Imaging Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Unavailable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tube 1.5ml</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>M3148-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Proteomics Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M107-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS, Ultra Pure Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0497-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (DL-Dithiothreitol), Biotechnology Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0281-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue sodium salt ACS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0312-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>JUNSEI</td>
			<td>27210S0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8)</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>632381</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying protein import into chloroplasts using protoplasts

כלורופלסט הוא אברון חיוני כי הוא אחראי על תהליכים שונים התאית בצמחים, כגון פוטוסינתזה וייצור של מטבוליטים משניים רבים ושומנים. מהכלורופלסט לדרוש מספר רב של חלבונים אלה תהליכים פיזיולוגיים שונים. מעל 95% של כלורופלסט חלבונים הם מקודד גרעין והן מיובאים לתוך מהכלורופלסט של ציטוזול לאחר התרגום ריבוזומים cytosolic. לפיכך, הייבוא נכונה או פילוח של חלבונים אלה כלורופלסט מקודד גרעין כדי מהכלורופלסט חיוני לתפקוד תקין של מהכלורופלסט, כמו גם על תא צמח. כלורופלסט גרעין מקודדת חלבונים מכילים רצפי אותות פילוח מסוים כדי מהכלורופלסט. מכונות מולקולריות מקומי כלורופלסט או ציטוזול מזהה אותות אלה ולבצע את תהליך הייבוא. כדי לחקור את המנגנונים של חלבון ייבוא או המיקוד מהכלורופלסט ויוו, פיתחנו מהיר, יעיל מבוססי פרוטופלאסט שיטה לנתח חלבון לייבא לתוך מהכלורופלסט של תודרנית. בשיטה זו, אנו משתמשים protoplasts מבודד מן העלים רקמות של תודרנית. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור שימוש protoplasts כדי לחקור את המנגנון שבאמצעותו חלבונים מיובאות לתוך מהכלורופלסט.

הייבוא של חלבונים לתוך מהכלורופלסט יכולים להיבדק באמצעות שתי גישות: מיקרוסקופ פלורסצנטיות וניתוח immunoblot לאחר ההפרדה מרחביות-דף-מתווכת. כאן השתמשנו RbcS-nt:GFP, פיוז'ן לבנות קידוד N-מסוף 79 חומצת אמינו משקעי RbcS המכיל את פפטיד טרנזיט דבוקה GFP. כאשר חלבונים מיובאות לתוך מהכלורופלס?...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts at JoVE.com

Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

כאן נתאר פרוטוקול כדי להביע את החלבונים לתוך protoplasts באמצעות שיטת שינוי בתיווך פג. השיטה מספקת קל ביטוי של חלבונים עניין ולאחר חקירה יעילה של חלבון לוקליזציה, תהליך הייבוא בתנאי ניסוי שונים ויוו.

לומד חלבון לייבא לתוך מהכלורופלסט באמצעות Protoplasts

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

תעלומה זו יכולה לעזור לענות על כמה שאלות בתחום הביולוגיה של התא כגון קלט חלבון לתוך chloroplasts. היתרון העיקרי של טכנולוגיה זו הוא כי קלט חלבון לתוך chloroplasts ניתן ללמוד בתנאים en vivo. הדגמת ההליך תהיה ג'והו לי והיאנגג'ו קאנג, שני פוסטים מהמעבדה שלי.כדי להתחיל, לקצור רקמות עלים שלמות מצמחים בני שבועיים מאחד עד שתי צלחות B5. השתמש בסכין כירורגית כדי לקצור את העלים ול למקם אותם לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר המכיל 25 מיליליטר של תותבת אנזים. מניחים את הצינור אופקית על שייקר סיבובי ודגירה עם תסיסה עדינה ב 22 מעלות צלזיוס בחושך במשך שמונה עד 12 שעות עד רק petioles וגבעולים להישאר בתסיסה.לאחר השלמת הדגירה, מסננים את תטגם האנזים המכיל פרוטופלסטים משוחררים באמצעות רשת בגודל נקבובית של 140 מיקרומטר לתוך צלחת פטרי טרייה. ואז בזהירות שכבת הפתרון על גבי 15 מיליליטר של 21% פתרון סוכרוז בצינור חרוט 50 מיליליטר. צנטריפוגה הצינור רוטור דלי מתנדנד ב 98 gs במשך 10 דקות עם ההאצה הנמוכה ביותר ואת הגדרות ההאטה.לאחר מכן, השתמשו בפטורה פיפט כדי להסיר בזהירות את הפרוטופלסטים מהשכבה העליונה המכילה תותב אנזימים ומהממשק בין פתרון האנזימים ותתפורת סוכרוז. העבר פתרון זה לצינור חרוט 50 מיליליטר המכיל 30 מיליליטר של פתרון W5 ולהפוך את הצינור לערבב. צנטריפוגה הצינור ב 51 gs במשך שש דקות.השתמש פיפטה כדי להשליך את זה על טבעי בזהירות מבלי להפריע protoplasts גלולה. הוסף 25 מיליליטר של פתרון W5 בעדינות להשעות את protoplasts. לייצוב, דגירה במקרר ארבע צלזיוס למשך שעה לפחות.לאחר דגירה של ארבע מעלות צלזיוס, גלולה protoplasts לחלוטין על ידי צנטריפוגה אותם ב 46 gs במשך שתי דקות. בזהירות להסיר את העל טבעי לחלוטין ולהוסיף פתרון MANG לכדור protoplast כדי להשיג חמש פעמים עשר עד שישה למיליליטר. השתמש פיפטה להוסיף 10 מיקרוגרם של DNA פלזמה ו 300 microliters של פתרון protoplast לצינור 13 מיליליטר עגול תחתית טרי.מערבבים על ידי סיבוב עדין של הצינורות ביד ולאחר מכן מיד להוסיף 300 microliters של 40% פתרון PEG מוכן טרי. מערבבים לחלוטין על ידי הטיית הצינור כמעט אופקית וסיבובו בעדינות מספר פעמים ביד. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.לאחר מכן מוסיפים מיליליטר אחד של פתרון W5 ומערבבים לחלוטין על ידי סיבוב עדין של הצינור ביד כבעבר. הדגירה את המדגם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. חזור פעמיים נוספות עם הוספת הראשון 1.5 מיליליטר ולאחר מכן שני מיליליטר של W5 ואחרי התוספת הסופית ערבוב, דגירה במשך 30 דקות.צנטריפוגה הצינור ב 46 gs במשך ארבע דקות ולאחר מכן להשליך את העל טבעי. מוסיפים שני מיליליטר של פתרון W5 לכדור ומערבבים בעדינות, אבל לגמרי, באותו אופן כמו בעבר. דגירה ב 22 מעלות צלזיוס בתא חשוך במשך 18 שעות.כדי לנתח את יבוא החלבון באמצעות מיקרוסקופיה של florescence, השתמשו בפיגט עם קצה גזוז כדי למקם 10 מיקרוליטרים של תותבת הפרוטופלסט על מגלשת זכוכית. השתמש להחליק כיסוי כדי לכסות בזהירות את הפתרון, כדי למנוע פגיעה protoplasts. מניחים את השקופית על הבמה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מסנן כניסה העירור כי הוא מוגדר להתבוננות חלבון פלואורסצנטי ירוק ושפעת אוטומטית כלורופיל.השתמש במצלמת מכשירים זוגיים של טעינה מקוררת כדי ללכוד תמונות ולעבד אותן באמצעות תוכנת עריכה מדומה כדי להפיק תמונות בצבע מדומה. עבור מיצוי חלבון הכולל immunoblotting, להסיר מיליליטר אחד מתסמת protoplast ומערבבים את מיליליטר הנותרים. העבר פתרון protoplast זה לתוך צינור צנטריפוגה צנטריפוגה ב 46 gs במשך ארבע דקות.הסר את supernatant לאחר השלמת צנטריפוגה ולהוסיף 80 microliters של מאגר denaturation. וורטקס במרץ למשך חמש שניות. מוסיפים חמישה מאגר מדגם XDS, מערבבים היטב ומרתיחים במשך 10 דקות כדי denature.המשך עם דף STS סטנדרטי ו immunoblotting עם נוגדן נגד GFP. RbcS ו- TGFT, מבנה היתוך המאדים את שאריות חומצות האמינו של מסוף 79 של RBCS המכילות את פפטיד המעבר התמזגו ל- GFP, שימשו לחקר ייבוא חלבונים לכלורופלסטים על ידי מיקרוסקופיה של פלורנס ואימונובלוט. כאשר נבדק על ידי מיקרוסקופיה florescence, אותות פלואורסצנטיים ירוקים מחלבון היעד התמזגו עם אותות פלואורסצנטיים אדומים מתפרחת כלורופיל אוטומטית המציינת יבוא חלבון לכלורופלסטים.לאחר בידוד החלבון הכולל, שתי רצועות חלבון נצפו immunoblot, מראה כי חלבון יובא כראוי לתוך chloroplasts. הרצועה העליונה תואמת למבשר באורך מלא ולרצועה התחתונה לטופס המעובד לאחר הייבוא לכלורופלסטים. כמות הצורה המעובדת של החלבון גדלה באופן תלוי זמן, מה שמרמז על כך שהחלבון מיובא לכלורופלסטים.בהתפתחות זו, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של התא לחקור חלבון מעייף או קטיף חוט קרום ב Arabidopsis.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים<em&gt; במבחנה</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

MRNA Interactome ללכוד מן Protoplasts הצמח

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

חלבון אנאירובית טיהור וניתוח קינטי באמצעות אלקטרודה חמצן ללמוד DesB Dioxygenase פעילות וניגוד

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

מבנה תמיסת Cerulean חלבון פלואורסצנטי באמצעות MeshAndCollect

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

רגישות גבוהה מדידה של שעתוק הזיקות איגוד מקדם-DNA על ידי טיטור תחרותי באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

ניתוח של קיפול חלבונים, תחבורה, והשפלה בתאים חיים על ידי הדופק רדיואקטיבי צ'ייס

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

לומד RNA Interactors של חלבון ה-RNA-מופעל במהלך מחזור התא בתרבית

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

יישום של ביואולייר אינטרפרומטריה (בלי) ללימוד אינטראקציות חלבונים-חלבונים בתמלול

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

הערכה של אינטראקציות חלבונים-חלבונים באמצעות טכניקת העיכול האנטי-ממברנה

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...