Name: studying protein import into chloroplasts using protoplasts
Uploaded: 2018-12-10T13:00:00
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यह काम कृषि विज्ञान और प्रौद्योगिकी विकास के लिए सहकारी अनुसंधान कार्यक्रम के समर्थन के साथ किया गया (परियोजना सं. PJ010953012018), ग्रामीण विकास प्रशासन, और नेशनल रिसर्च फाउंडेशन (कोरिया) अनुदान विज्ञान और आईसीटी (सं. 2016R1E1A1A02922014), कोरिया गणराज्य के मंत्रालय द्वारा वित्त पोषित ।

1. Arabidopsis संयंत्रों की वृद्धि
<ol><li>1 L Gamborg b5 (b5) मध्यम को विटामिन सहित b5 माध्यम के ३.२ ग्राम को जोड़कर तैयार करें, सुक्रोज के 20 जी, 2 के ०.५ g-(N-morpholino) एतान sulfonic एसिड (एमईएस) के लिए लगभग ८०० मिलीलीटर पानी की एमएल, और पीएच को सम?...

<ol>
	<li>Jarvis, P., Lopez-Juez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+and+homeostasis+of+chloroplasts+and+other+plastids.">Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).</li><li>Neuhaus, H. E., Emes, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonphotosynthetic+Metabolism+in+Plastids.">Nonphotosynthetic Metabolism in Plastids.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 51, 111-140 (2000).</li><li>Rolland, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biosynthetic+capacities+of+the+plastids+and+integration+between+cytoplasmic+and+chloroplast+processes.">The biosynthetic capacities of the plastids and integration between cytoplasmic and chloroplast processes.</a> Annual Review of Genetics. 46, 233-264 (2012).</li><li>Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+nucleus-encoded+proteins+to+chloroplasts+in+plants.">Targeting of nucleus-encoded proteins to chloroplasts in plants.</a> New Phytologist. 179 (2), 257-285 (2008).</li><li>Li, H. M., Chiu, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Transport+into+Chloroplasts.">Protein Transport into Chloroplasts.</a> Annual Review of Plant Biology. 61, 157-180 (2010).</li><li>Keegstra, K., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+import+and+routing+systems+of+chloroplasts.">Protein import and routing systems of chloroplasts.</a> Plant Cell. 11 (4), 557-570 (1999).</li><li>Gasser, S. M., Daum, G., Schatz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Import+of+proteins+into+mitochondria.+Energy-dependent+uptake+of+precursors+by+isolated+mitochondria.">Import of proteins into mitochondria. Energy-dependent uptake of precursors by isolated mitochondria.</a> Journal of Biological Chemistry. 257 (21), 13034-13041 (1982).</li><li>Smeekens, S., Bauerle, C., Hageman, J., Keegstra, K., Weisbeek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+transit+peptide+in+the+routing+of+precursors+toward+different+chloroplast+compartments.">The role of the transit peptide in the routing of precursors toward different chloroplast compartments.</a> Cell. 46 (3), 365-375 (1986).</li><li>Lee, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+nuclear-encoded+plastid+transit+peptides+contain+multiple+sequence+subgroups+with+distinctive+chloroplast-targeting+sequence+motifs.">Arabidopsis nuclear-encoded plastid transit peptides contain multiple sequence subgroups with distinctive chloroplast-targeting sequence motifs.</a> Plant Cell. 20 (6), 1603-1622 (2008).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+targeting+of+the+Arabidopsis+F1-ATPase+gamma-subunit+via+multiple+compensatory+and+synergistic+presequence+motifs.">Mitochondrial targeting of the Arabidopsis F1-ATPase gamma-subunit via multiple compensatory and synergistic presequence motifs.</a> Plant Cell. 24 (12), 5037-5057 (2012).</li><li>Jin, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+dynamin-like+protein,+ADL6,+is+involved+in+trafficking+from+the+trans-Golgi+network+to+the+central+vacuole+in+Arabidopsis.">A new dynamin-like protein, ADL6, is involved in trafficking from the trans-Golgi network to the central vacuole in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 13 (7), 1511-1526 (2001).</li><li>Lee, K. H., Kim, D. H., Lee, S. W., Kim, Z. H., Hwang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+import+experiments+in+protoplasts+reveal+the+importance+of+the+overall+context+but+not+specific+amino+acid+residues+of+the+transit+peptide+during+import+into+chloroplasts.">In vivo import experiments in protoplasts reveal the importance of the overall context but not specific amino acid residues of the transit peptide during import into chloroplasts.</a> Molecules and Cells. 14 (3), 388-397 (2002).</li><li>Lee, D. W., Lee, S., Oh, Y. J., Hwang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sequence+motifs+in+the+rubisco+small+subunit+transit+peptide+independently+contribute+to+Toc159-dependent+import+of+proteins+into+chloroplasts.">Multiple sequence motifs in the rubisco small subunit transit peptide independently contribute to Toc159-dependent import of proteins into chloroplasts.</a> Plant Physiology. 151 (1), 129-141 (2009).</li><li>Lee, D. W., Woo, S., Geem, K. R., Hwang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+motifs+in+transit+peptides+act+as+independent+functional+units+and+can+be+transferred+to+new+sequence+contexts.">Sequence motifs in transit peptides act as independent functional units and can be transferred to new sequence contexts.</a> Plant Physiology. 169 (1), 471-484 (2015).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+the+hydrophobicity+and+a+positively+charged+region+flanking+the+C-terminal+region+of+the+transmembrane+domain+of+signal-anchored+proteins+play+critical+roles+in+determining+their+targeting+specificity+to+the+endoplasmic+reticulum+or+endosymbiotic+organelles+in+Arabidopsis+cells.">Both the hydrophobicity and a positively charged region flanking the C-terminal region of the transmembrane domain of signal-anchored proteins play critical roles in determining their targeting specificity to the endoplasmic reticulum or endosymbiotic organelles in Arabidopsis cells.</a> Plant Cell. 23 (4), 1588-1607 (2011).</li><li>Cleary, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+plant+mitochondria+import+chloroplast+precursor+proteins+in+vitro+with+the+same+efficiency+as+chloroplasts.">Isolated plant mitochondria import chloroplast precursor proteins in vitro with the same efficiency as chloroplasts.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (7), 5562-5569 (2002).</li></ol>

हम chloroplasts में प्रोटीन आयात का अध्ययन करने के लिए Arabidopsis के protoplasts के उपयोग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान की है । यह विधि प्रोटीन आयात प्रक्रिया की जांच के लिए शक्तिशाली है । यह सरल, बहुमुखी तकनीक chloroplasts क...

chloroplast पौधों में सबसे महत्वपूर्ण organelles में से एक है । chloroplasts के मुख्य कार्यों में से एक प्रकाश संश्लेषण1बाहर ले जाने के लिए है । Chloroplasts भी फैटी एसिड के उत्पादन के लिए कई अंय जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं ले, एमिनो एसिड, न्यूक्लियोटाइड, और कई माध्यमिक चयापचयों1,2। इन प्रतिक्रियाओं के सभी के लिए, chloroplasts प्रोटीन के विभिंन प्रकार की एक बड़ी संख्या की आवश्यकता होती है । हालांकि, chloroplast जीनोम में केवल लगभग १०० जीन3,4होते हैं । इसलिए, chloroplasts cytosol से अपने प्रोटीन के बहुमत आयात करना होगा । वास्तव में, अधिकांश chloroplast प्रोटीन का अनुवाद4,5,6के बाद cytosol से आयात करने के लिए दिखाया गया था । संयंत्र कोशिकाओं को cytosol से chloroplasts प्रोटीन आयात करने के लिए विशिष्ट तंत्र की आवश्यकता है । हालांकि, हालांकि इन प्रोटीन आयात तंत्र पिछले कई दशकों के लिए जांच की गई है, हम अभी भी उंहें पूरी तरह से आणविक स्तर पर नहीं समझ में आता है । यहां, हम protoplasts में जीन एक्सप्रेस protoplasts और exogenously की तैयारी के लिए एक विस्तृत विधि प्रदान करते हैं । इस विधि elucidating आणविक तंत्र chloroplasts में विस्तार से अंतर्निहित प्रोटीन आयात के लिए मूल्यवान हो सकता है ।
प्रोटीन आयात कई विभिंन तरीकों का उपयोग कर अध्ययन किया जा सकता है । इन तरीकों में से एक इन विट्रो प्रोटीन आयात प्रणाली7,8का उपयोग शामिल है । इस दृष्टिकोण का प्रयोग, इन विट्रो-अनुवादित प्रोटीन अग्रदूतों में इन विट्रो मेंशुद्ध chloroplasts के साथ मशीन हैं, और प्रोटीन आयात एसडीएस द्वारा विश्लेषण किया जाता है-पश्चिमी दाग विश्लेषण द्वारा पीछा पृष्ठ । इस दृष्टिकोण का लाभ यह है कि chloroplasts में प्रोटीन आयात के प्रत्येक कदम का विस्तार से अध्ययन किया जा सकता है. इस प्रकार, इस विधि व्यापक रूप से प्रोटीन आयात आणविक मशीनरी के घटकों को परिभाषित करने के लिए और पारगमन पेप्टाइड्स के लिए अनुक्रम जानकारी काटना करने के लिए प्रयोग किया गया है । हाल ही में, एक और पत्ती के ऊतकों से protoplasts के उपयोग को शामिल दृष्टिकोण विकसित किया गया था और यह व्यापक रूप से9chloroplasts,10में प्रोटीन आयात का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है । इस दृष्टिकोण का लाभ यह है कि protoplasts एक सेलुलर वातावरण है कि बरकरार कोशिकाओं की तुलना में इन विट्रो प्रणाली के करीब है प्रदान करते हैं । इस प्रकार, protoplast प्रणाली हमें इस प्रक्रिया के कई अतिरिक्त पहलुओं को संबोधित करने की अनुमति देता है, जैसे जुड़े cytosolic घटनाओं और कैसे लक्ष्यीकरण संकेतों की विशिष्टता निर्धारित की जाती है । यहां, हम chloroplasts में प्रोटीन आयात का अध्ययन करने के लिए protoplasts के उपयोग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>GAMBORG B5 MEDIUM INCLUDING VITAMINS</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>G0210.0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUCROSE</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>S0809.5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES MONOHYDRATE</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>M1503.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, powder</td>
			<td>JUNSEI</td>
			<td>24440S1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropore Surgical tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>1530-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade stainless No.10</td>
			<td>FEATHER</td>
			<td>Unavailable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tube, 50ml</td>
			<td>SPL LIFE SCIENCES</td>
			<td>50050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macerozyme R-10</td>
			<td>YAKULT PHARMACEUTICAL IND.</td>
			<td>Unavailable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase ONOZUKA R-10</td>
			<td>YAKULT PHARMACEUTICAL IND.</td>
			<td>Unavailable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALBUMIN, BOVINE (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>M1902-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CALCIUM CHLORIDE, DIHYDRATE</td>
			<td>MP BIOMEDICALS</td>
			<td>0219463505-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Twister</td>
			<td>VISION SCIENTIFIC</td>
			<td>VS-96TW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screen cup for CD-1</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>S1145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screens for CD-1</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>S3895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>SPL LIFE SCIENCES</td>
			<td>10090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>HILGENBERG</td>
			<td>3150102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LABORATORY CENTRIFUGE / BENCH-TOP</td>
			<td>VISION SCIENTIFIC</td>
			<td>VS-5500N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>JUNSEI</td>
			<td>19015S0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P3911-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-GLUCOSE, ANHYDROUS</td>
			<td>BIO BASIC</td>
			<td>GB0219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
			<td>DUKSAN</td>
			<td>40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium nitrate tetrahydrate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C2786-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P2139-2KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>M2393-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube 13ml, 100x16mm, PP</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>55.515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td>1000412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td>101030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting Chamber</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td>650030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axioplan 2 Imaging Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Unavailable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tube 1.5ml</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>M3148-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Proteomics Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M107-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS, Ultra Pure Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0497-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (DL-Dithiothreitol), Biotechnology Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0281-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue sodium salt ACS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0312-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>JUNSEI</td>
			<td>27210S0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8)</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>632381</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying protein import into chloroplasts using protoplasts

chloroplast एक आवश्यक organelle है जो पौधों में विभिंन सेलुलर प्रक्रियाओं, जैसे प्रकाश संश्लेषण और कई द्वितीयक चयापचयों और लिपिड के उत्पादन के लिए जिंमेदार है । Chloroplasts इन विभिंन शारीरिक प्रक्रियाओं के लिए प्रोटीन की एक बड़ी संख्या की आवश्यकता होती है । chloroplast प्रोटीन के ९५% से अधिक नाभिक इनकोडिंग और cytosolic ribosomes पर अनुवाद के बाद cytosol से chloroplasts में आयात कर रहे हैं । इस प्रकार, उचित आयात या लक्ष्यीकरण इन नाभिक-इनकोडिंग chloroplast प्रोटीन chloroplasts करने के लिए chloroplasts के रूप में अच्छी तरह के रूप में संयंत्र सेल के समुचित कार्य के लिए आवश्यक है । नाभिक इनकोडिंग chloroplast प्रोटीन chloroplasts करने के लिए विशिष्ट लक्ष्यीकरण के लिए संकेत अनुक्रम होते हैं । chloroplast या cytosol के लिए स्थानीयकृत आणविक मशीनरी इन संकेतों को पहचानती है और आयात प्रक्रिया को पूरा करते हैं । vivo मेंchloroplasts करने के लिए प्रोटीन आयात या लक्ष्यीकरण के तंत्र की जांच करने के लिए, हम Arabidopsis के chloroplasts में प्रोटीन आयात का विश्लेषण करने के लिए एक तेजी से, कुशल protoplast आधारित पद्धति विकसित की है । इस विधि में, हम Arabidopsisकी पत्तियों के ऊतकों से अलग protoplasts का उपयोग करें । यहां, हम तंत्र है जिसके द्वारा प्रोटीन chloroplasts में आयात कर रहे है की जांच करने के लिए protoplasts का उपयोग करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं ।

chloroplasts में प्रोटीन का आयात दो दृष्टिकोण का उपयोग कर जांच की जा सकती है: प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और immunoblot विश्लेषण के बाद एसडीएस-पृष्ठ की मध्यस्थता जुदाई. यहां, हम इस्तेमाल किया RbcS-nt: GFP, एक संलय?...

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Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

यहाँ हम खूंटी मध्यस्थता परिवर्तन विधि का उपयोग करके protoplasts में प्रोटीन व्यक्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. विधि ब्याज की प्रोटीन की आसान अभिव्यक्ति प्रदान करता है, और प्रोटीन स्थानीयकरण की कुशल जांच और vivo में विभिंन प्रायोगिक परिस्थितियों के लिए आयात प्रक्रिया ।

Protoplasts का उपयोग Chloroplasts में प्रोटीन आयात का अध्ययन

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

यह रहस्य सेल बायोलॉजी के क्षेत्र में कुछ सवालों के जवाब देने में मदद कर सकता है जैसे क्लोरोप्लास्ट में प्रोटीन इनपुट । इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि क्लोरोप्लास्ट में प्रोटीन इनपुट का अध्ययन एन वीवो स्थितियों के तहत किया जा सकता है। प्रक्रिया का प्रदर्शन Junho ली और Hyangju कांग, मेरी प्रयोगशाला से दो पोस्ट आउट होगा ।शुरू करने के लिए, एक से दो B5 प्लेटों से दो सप्ताह पुराने पौधों से बरकरार पत्ती ऊतकों फसल । पत्तियों की फसल के लिए एक शल्य चाकू का उपयोग करें और उन्हें एंजाइम समाधान के 25 मिलीलीटर युक्त 50 मिलीलीटर शंकु नली में रखें। ट्यूब को एक रोटरी शेकर पर क्षैतिज रूप से रखें और आठ से 12 घंटे तक अंधेरे में 22 डिग्री सेल्सियस पर कोमल आंदोलन के साथ इनक्यूबेट करें जब तक कि केवल डंठल और उपजी समाधान में न रहें।इनक्यूबेशन पूरा करने के बाद, एक ताजा पेट्री डिश में 140 माइक्रोमीटर पोर आकार जाल के माध्यम से जारी प्रोटोप्लास्ट युक्त एंजाइम समाधान को फ़िल्टर करें। फिर ध्यान से 50 मिलीलीटर शंकु नली में 21% सुक्रोज समाधान के 15 मिलीलीटर के शीर्ष पर समाधान परत। सबसे कम त्वरण और मंदी सेटिंग्स के साथ 10 मिनट के लिए 98 जीएस पर एक झूल बाल्टी रोटर में ट्यूब अपकेंद्रित्र।उसके बाद, एंजाइम समाधान युक्त ऊपरी परत से और एंजाइमों के समाधान और सुक्रोज समाधान के बीच इंटरफेस से प्रोटोप्लास्ट को ध्यान से हटाने के लिए पटुरा पिपेट का उपयोग करें। इस समाधान को 50 मिलीलीटर शंकु नली में स्थानांतरित करें जिसमें 30 मिलीलीटर W5 समाधान होता है और ट्यूब को मिलाने के लिए उलटा करें। छह मिनट के लिए 51 जीएस पर ट्यूब सेंट्रलाइज करें।गोली में प्रोटोप्लास्ट को परेशान किए बिना इस सुपरनेट को सावधानी से त्यागने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें। W5 समाधान के 25 मिलीलीटर जोड़ें और धीरे से प्रोटोप्लास्ट को फिर से निलंबित करें। स्थिरीकरण के लिए, न्यूनतम एक घंटे के लिए चार सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में इनक्यूबेट करें।चार डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेशन के बाद, गोली प्रोटोप्लास्ट को पूरी तरह से दो मिनट के लिए 46 जीएस पर अपकेंद्री करके। ध्यान से सुपरनेट को पूरी तरह से हटा दें और प्रति मिलीलीटर छह से पांच गुना दस को प्राप्त करने के लिए प्रोटोप्लास्ट गोली में MANG समाधान जोड़ें। प्लाज्मा डीएनए के 10 माइक्रोग्राम और एक ताजा 13 मिलीलीटर गोल तली ट्यूब के लिए प्रोटोप्लास्ट समाधान के ३०० माइक्रोलीटर जोड़ने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें ।धीरे-धीरे हाथ से ट्यूबों घूर्णन द्वारा मिश्रण और फिर तुरंत हौसले से तैयार 40% खूंटी समाधान के 300 माइक्रोलीटर जोड़ें। ट्यूब को लगभग क्षैतिज रूप से झुकाकर पूरी तरह से मिलाएं और इसे हाथ से कई बार कोमल घुमाएं। 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट।फिर W5 समाधान का एक मिलीलीटर जोड़ें और पहले की तरह हाथ से ट्यूब को धीरे से घुमाकर पूरी तरह से मिलाएं। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए नमूना इनक्यूबेट। पहले 1.5 मिलीलीटर जोड़ने और फिर W5 के दो मिलीलीटर और अंतिम इसके अलावा और मिश्रण के बाद, 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट के साथ दो और बार दोहराएं।चार मिनट के लिए 46 जीएस पर ट्यूब को सेंट्रलाइज करें और फिर सुपरनेट को त्याग दें। गोली के लिए W5 समाधान के दो मिलीलीटर जोड़ें और धीरे से मिश्रण है, लेकिन पूरी तरह से, पहले के रूप में एक ही तरीके से । 18 घंटे के लिए एक अंधेरे कक्ष में 22 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट ।फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके प्रोटीन आयात का विश्लेषण करने के लिए, एक ग्लास स्लाइड पर प्रोटोप्लास्ट समाधान के 10 माइक्रोलीटर रखने के लिए छंटनी की गई टिप के साथ एक पिपेट का उपयोग करें। प्रोटोप्लास्ट को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए समाधान को सावधानीपूर्वक कवर करने के लिए कवर स्लिप का उपयोग करें। एक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के चरण पर स्लाइड रखें जिसमें एक उत्तेजन प्रवेश फिल्टर होता है जो हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन और क्लोरोफिल ऑटोफ्लोरेसेंस को देखने के लिए निर्धारित है।छवियों को कैप्चर करने और छद्म रंग छवियों का उत्पादन करने के लिए एक कल्पना संपादन सॉफ्टवेयर का उपयोग करके उन्हें संसाधित करने के लिए एक ठंडा चार्ज कपल डिवाइस कैमरा का उपयोग करें। कुल प्रोटीन निष्कर्षण और इम्यूनोब्लोटिंग के लिए, प्रोटोप्लास्ट समाधान से एक मिलीलीटर निकालें और शेष एक मिलीलीटर मिलाएं। इस प्रोटोप्लास्ट समाधान को एक सेंट्रलाइज ट्यूब और सेंट्रलाइज में चार मिनट के लिए 46 जीएस पर स्थानांतरित करें।अपकेंद्री को पूरा करने के बाद सुपरनेट निकालें और 80 माइक्रोलीटर डेनैचेशन बफर डालें। पांच सेकंड के लिए भंवर दमखम से। पांच XDS नमूना बफर जोड़ें, अच्छी तरह से मिश्रण और 10 मिनट के लिए फोड़ा denature ।मानक एसटीएस पेज और एंटी-जीएफपी एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोब्लोटिंग के साथ आगे बढ़ें। आरबीसीएस और टीजीएफटी, एक संलयन निर्माण आरबीसी के 79 अंत टर्मिनल अमीनो एसिड अवशेषों को एन्कोडिंग करते हैं, जिसमें ट्रांजिट पेप्टाइड जीएफपी से जुड़े होते हैं, का उपयोग फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी और इम्यूनोब्लोटिंग द्वारा क्लोरोप्लास्ट में प्रोटीन के आयात का अध्ययन करने के लिए किया जाता था। फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा जांच किए जाने पर, क्लोरोफिल ऑटोफ्लोरेसेंस से लाल फ्लोरोसेंट संकेतों के साथ विलय किए गए लक्ष्य प्रोटीन से हरे फ्लोरोसेंट संकेत क्लोरोप्लास्ट में प्रोटीन आयात का संकेत देते हैं।कुल प्रोटीन को अलग करने के बाद इम्यूनोब्लॉट में दो प्रोटीन बैंड देखे जाते हैं, जिससे पता चलता है कि क्लोरोप्लास्ट में एक प्रोटीन का ठीक से आयात किया गया था । ऊपरी बैंड क्लोरोप्लास्ट में आयात के बाद पूर्ण लंबाई अग्रदूत और निचले बैंड से संसाधित रूप से मेल खाती है। प्रोटीन के प्रसंस्कृत रूप की मात्रा समय पर निर्भर तरीके से बढ़ी, जिससे यह सुझाव मिलता है कि प्रोटीन क्लोरोप्लास्ट में आयात किया जाता है।इस विकास में, इस तकनीक ने सेल जीव विज्ञान के क्षेत्र में शोधकर्ताओं के लिए अरबीडोप्सिस में प्रोटीन थका या झिल्ली धागा चुनने का पता लगाने का मार्ग प्रशस्त किया।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

पाड़ Liposomes का उपयोग लिपिड-समीपस्थ प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत पुनर्गठित करने<em&gt; इन विट्रो</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

प्रोटीन संरचना और गतिशीलता के अध्ययन के लिए समय का समाधान electrospray ionization हाइड्रोजन-ड्यूटेरियम एक्सचेंज मास स्पेक्ट्रोमेट्री

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

MRNA संयंत्र Protoplasts से इंटरैक्टियम कैद

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Anaerobic प्रोटीन शुद्धि और काइनेटिक विश्लेषण DesB Dioxygenase गतिविधि और संकोच का अध्ययन करने के लिए ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड के माध्यम से

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

MeshAndCollect का उपयोग कर फ्लोरोसेंट प्रोटीन सेरुलियन की संरचना समाधान

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

प्रतिलेखन फैक्टर के उच्च संवेदनशीलता माप-प्रतिस्पर्धी अनुमापन द्वारा डीएनए बाध्यकारी समानताएं प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

प्रोटीन तह, परिवहन, और रेडियोधर्मी पल्स चेस द्वारा जीवित कोशिकाओं में क्षरण का विश्लेषण

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

स्तनधारी कोशिका चक्र के दौरान सक्रिय प्रोटीन काइनेज आरएनए के आरएनए इंटरएक्टर्स का अध्ययन

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

ट्रांसक्रिप्शन में प्रोटीन-प्रोटिन इंटरेक्शन के अध्ययन के लिए बायोलेयर इंटरफेरोमेट्री (बीआईएलआई) का अनुप्रयोग

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

एक पर झिल्ली पाचन तकनीक का उपयोग कर प्रोटीन-प्रोटीन इंटरेक्शन का मूल्यांकन

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...