Name: studying protein import into chloroplasts using protoplasts
Uploaded: 2018-12-10T13:00:00
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Questo lavoro è stato effettuato con il supporto del programma di ricerca cooperativa per la scienza l'agricoltura e lo sviluppo della tecnologia (progetto n ° PJ010953012018), gestione dello sviluppo rurale e la concessione di National Research Foundation (Corea), finanziato dal Ministero della scienza e ICT (n. 2016R1E1A1A02922014), Repubblica di Corea.

1. la crescita di piante di Arabidopsis
<ol><li>Preparare 1 L Gamborg B5 (B5) medio aggiungendo 3,2 g di B5 medio tra cui vitamine, 20 g di saccarosio, 0,5 g di 2-(N-morpholino) etano acido solfonico (MES) a circa 800 mL di acqua deionizzata e regolare il pH a 5,7 con idrossido di potassio (KOH). Aggiungi più deionizzata acqua portare il volume totale a 1 L. aggiungere 8 g di phytoagar e autoclave per 15 min a 121 ° C.</li>
	<li>Lasci che il media raffreddare fino a 55 ° C e versare 20 – 25 mL di terreno B5 in una...

<ol>
	<li>Jarvis, P., Lopez-Juez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+and+homeostasis+of+chloroplasts+and+other+plastids.">Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).</li><li>Neuhaus, H. E., Emes, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonphotosynthetic+Metabolism+in+Plastids.">Nonphotosynthetic Metabolism in Plastids.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 51, 111-140 (2000).</li><li>Rolland, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biosynthetic+capacities+of+the+plastids+and+integration+between+cytoplasmic+and+chloroplast+processes.">The biosynthetic capacities of the plastids and integration between cytoplasmic and chloroplast processes.</a> Annual Review of Genetics. 46, 233-264 (2012).</li><li>Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+nucleus-encoded+proteins+to+chloroplasts+in+plants.">Targeting of nucleus-encoded proteins to chloroplasts in plants.</a> New Phytologist. 179 (2), 257-285 (2008).</li><li>Li, H. M., Chiu, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Transport+into+Chloroplasts.">Protein Transport into Chloroplasts.</a> Annual Review of Plant Biology. 61, 157-180 (2010).</li><li>Keegstra, K., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+import+and+routing+systems+of+chloroplasts.">Protein import and routing systems of chloroplasts.</a> Plant Cell. 11 (4), 557-570 (1999).</li><li>Gasser, S. M., Daum, G., Schatz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Import+of+proteins+into+mitochondria.+Energy-dependent+uptake+of+precursors+by+isolated+mitochondria.">Import of proteins into mitochondria. Energy-dependent uptake of precursors by isolated mitochondria.</a> Journal of Biological Chemistry. 257 (21), 13034-13041 (1982).</li><li>Smeekens, S., Bauerle, C., Hageman, J., Keegstra, K., Weisbeek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+transit+peptide+in+the+routing+of+precursors+toward+different+chloroplast+compartments.">The role of the transit peptide in the routing of precursors toward different chloroplast compartments.</a> Cell. 46 (3), 365-375 (1986).</li><li>Lee, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+nuclear-encoded+plastid+transit+peptides+contain+multiple+sequence+subgroups+with+distinctive+chloroplast-targeting+sequence+motifs.">Arabidopsis nuclear-encoded plastid transit peptides contain multiple sequence subgroups with distinctive chloroplast-targeting sequence motifs.</a> Plant Cell. 20 (6), 1603-1622 (2008).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+targeting+of+the+Arabidopsis+F1-ATPase+gamma-subunit+via+multiple+compensatory+and+synergistic+presequence+motifs.">Mitochondrial targeting of the Arabidopsis F1-ATPase gamma-subunit via multiple compensatory and synergistic presequence motifs.</a> Plant Cell. 24 (12), 5037-5057 (2012).</li><li>Jin, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+dynamin-like+protein,+ADL6,+is+involved+in+trafficking+from+the+trans-Golgi+network+to+the+central+vacuole+in+Arabidopsis.">A new dynamin-like protein, ADL6, is involved in trafficking from the trans-Golgi network to the central vacuole in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 13 (7), 1511-1526 (2001).</li><li>Lee, K. H., Kim, D. H., Lee, S. W., Kim, Z. H., Hwang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+import+experiments+in+protoplasts+reveal+the+importance+of+the+overall+context+but+not+specific+amino+acid+residues+of+the+transit+peptide+during+import+into+chloroplasts.">In vivo import experiments in protoplasts reveal the importance of the overall context but not specific amino acid residues of the transit peptide during import into chloroplasts.</a> Molecules and Cells. 14 (3), 388-397 (2002).</li><li>Lee, D. W., Lee, S., Oh, Y. J., Hwang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sequence+motifs+in+the+rubisco+small+subunit+transit+peptide+independently+contribute+to+Toc159-dependent+import+of+proteins+into+chloroplasts.">Multiple sequence motifs in the rubisco small subunit transit peptide independently contribute to Toc159-dependent import of proteins into chloroplasts.</a> Plant Physiology. 151 (1), 129-141 (2009).</li><li>Lee, D. W., Woo, S., Geem, K. R., Hwang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+motifs+in+transit+peptides+act+as+independent+functional+units+and+can+be+transferred+to+new+sequence+contexts.">Sequence motifs in transit peptides act as independent functional units and can be transferred to new sequence contexts.</a> Plant Physiology. 169 (1), 471-484 (2015).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+the+hydrophobicity+and+a+positively+charged+region+flanking+the+C-terminal+region+of+the+transmembrane+domain+of+signal-anchored+proteins+play+critical+roles+in+determining+their+targeting+specificity+to+the+endoplasmic+reticulum+or+endosymbiotic+organelles+in+Arabidopsis+cells.">Both the hydrophobicity and a positively charged region flanking the C-terminal region of the transmembrane domain of signal-anchored proteins play critical roles in determining their targeting specificity to the endoplasmic reticulum or endosymbiotic organelles in Arabidopsis cells.</a> Plant Cell. 23 (4), 1588-1607 (2011).</li><li>Cleary, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+plant+mitochondria+import+chloroplast+precursor+proteins+in+vitro+with+the+same+efficiency+as+chloroplasts.">Isolated plant mitochondria import chloroplast precursor proteins in vitro with the same efficiency as chloroplasts.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (7), 5562-5569 (2002).</li></ol>

Abbiamo fornito un protocollo dettagliato per l'uso dei protoplasti di Arabidopsis per studiare la proteina importazione in cloroplasti. Questo metodo è potente per studiare il processo di importazione di proteine. Questa tecnica semplice, versatile è utile per esaminare il targeting delle proteine del carico previsto di cloroplasti. Utilizzando questo metodo, protoplasti vengono preparati da tessuti fogliari di Arabidopsis11,12 , che può ess...

Il cloroplasto è uno degli organelli più importanti nelle piante. Una delle funzioni principali dei cloroplasti è di svolgere la fotosintesi1. I cloroplasti svolgono anche molte altre reazioni biochimiche per la produzione di acidi grassi, aminoacidi, nucleotidi e numerosi metaboliti secondari1,2. Per tutte queste reazioni, cloroplasti richiedono un gran numero di diversi tipi di proteine. Tuttavia, il genoma del cloroplasto contiene solo circa 100 geni3,4. Di conseguenza, cloroplasti necessario importare la maggior parte delle loro proteine dal cytosol. Infatti, la maggior parte delle proteine del cloroplasto sono stata indicata per essere importati dal cytosol dopo traduzione4,5,6. Cellule vegetali richiedono meccanismi specifici per l'importazione di proteine dal cytosol ai cloroplasti. Tuttavia, anche se questi meccanismi di importazione di proteina sono stati studiati per i parecchi decenni passati, ancora non completamente capiamo loro a livello molecolare. Qui, forniamo un metodo dettagliato per la preparazione di protoplasti ed esogenicamente che esprimono i geni in protoplasti. Questo metodo potrebbe essere prezioso per chiarire i meccanismi molecolari alla base di importazione di proteina in cloroplasti in dettaglio.
Importazione di proteine possa essere studiati utilizzando molti approcci diversi. Uno di questi metodi prevede l'utilizzo di un in vitro della proteina importazione sistema7,8. Utilizzando questo approccio, in vitro-tradotta proteine precursori vengono incubati con cloroplasti purificata in vitro, e importazione di proteina è analizzata da SDS-PAGE seguita da analisi western blot. Il vantaggio di questo approccio è che ogni passaggio dell'importazione di proteina in cloroplasti possa essere studiata in dettaglio. Pertanto, questo metodo è stato ampiamente utilizzato per definire i componenti del macchinario molecolare della proteina importazione e dissezionare informazioni di sequenza per i peptidi di transito. Più recentemente, è stato sviluppato un altro approccio che coinvolge l'uso dei protoplasti da tessuti fogliari e si è diffuso per lo studio di proteine importazione in cloroplasti9,10. Il vantaggio di questo approccio è che i protoplasti forniscono un ambiente cellulare che è più vicino a quella di cellule intatte rispetto al sistema in vitro . Così, il sistema di protoplasti permette di affrontare molti altri aspetti di questo processo, come gli eventi associati citosolici e come viene determinata la specificità dei segnali di targeting. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per l'uso dei protoplasti di studiare proteine importazione in cloroplasti.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>GAMBORG B5 MEDIUM INCLUDING VITAMINS</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>G0210.0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUCROSE</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>S0809.5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES MONOHYDRATE</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>M1503.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, powder</td>
			<td>JUNSEI</td>
			<td>24440S1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropore Surgical tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>1530-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade stainless No.10</td>
			<td>FEATHER</td>
			<td>Unavailable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tube, 50ml</td>
			<td>SPL LIFE SCIENCES</td>
			<td>50050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macerozyme R-10</td>
			<td>YAKULT PHARMACEUTICAL IND.</td>
			<td>Unavailable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase ONOZUKA R-10</td>
			<td>YAKULT PHARMACEUTICAL IND.</td>
			<td>Unavailable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALBUMIN, BOVINE (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>M1902-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CALCIUM CHLORIDE, DIHYDRATE</td>
			<td>MP BIOMEDICALS</td>
			<td>0219463505-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Twister</td>
			<td>VISION SCIENTIFIC</td>
			<td>VS-96TW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screen cup for CD-1</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>S1145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screens for CD-1</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>S3895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>SPL LIFE SCIENCES</td>
			<td>10090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>HILGENBERG</td>
			<td>3150102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LABORATORY CENTRIFUGE / BENCH-TOP</td>
			<td>VISION SCIENTIFIC</td>
			<td>VS-5500N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>JUNSEI</td>
			<td>19015S0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P3911-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-GLUCOSE, ANHYDROUS</td>
			<td>BIO BASIC</td>
			<td>GB0219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
			<td>DUKSAN</td>
			<td>40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium nitrate tetrahydrate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>C2786-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P2139-2KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>M2393-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube 13ml, 100x16mm, PP</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>55.515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td>1000412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glasses</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td>101030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting Chamber</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td>650030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axioplan 2 Imaging Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Unavailable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tube 1.5ml</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>M3148-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Proteomics Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M107-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS, Ultra Pure Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0497-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (DL-Dithiothreitol), Biotechnology Grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0281-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue sodium salt ACS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0312-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>JUNSEI</td>
			<td>27210S0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8)</td>
			<td>TAKARA</td>
			<td>632381</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying protein import into chloroplasts using protoplasts

Il cloroplasto è un organulo essenziale che è responsabile di vari processi cellulari nelle piante, come la fotosintesi e la produzione di molti metaboliti secondari e di lipidi. Cloroplasti richiedono un gran numero di proteine per questi vari processi fisiologici. Oltre il 95% delle proteine del cloroplasto sono nucleo-codificato e importati in cloroplasti dal cytosol dopo traduzione sui ribosomi citosolici. Così, targeting di queste proteine di nucleo-codificato cloroplasto a cloroplasti o l'importazione corretta è essenziale per il corretto funzionamento di cloroplasti, come pure la cellula della pianta. Nucleo-codificato cloroplasto proteine contengono sequenze di segnale per il targeting specifico di cloroplasti. Macchinario molecolare localizzata al cloroplasto o citosol riconoscere questi segnali ed eseguire il processo di importazione. Per studiare i meccanismi di importazione di proteina o targeting per cloroplasti in vivo, abbiamo sviluppato un metodo basato su protoplasti rapido, efficiente per analizzare la proteina importazione in cloroplasti di Arabidopsis. In questo metodo, usiamo protoplasti isolati dai tessuti fogliari di Arabidopsis. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per l'utilizzo di protoplasti per studiare il meccanismo mediante il quale le proteine vengono importate in cloroplasti.

L'importazione di proteine in cloroplasti può essere esaminato mediante due approcci: analisi di microscopia e immunoblot di fluorescenza dopo separazione SDS-pagina-mediata. Qui, abbiamo usato RbcS-nt:GFP, una fusione costruire codifica i 79 residui dell'amminoacido N-terminale di RbcS contenente il peptide di transito fuso alla GFP. Quando proteine vengono importate in cloroplasti, i segnali di fluorescenza verde da proteina bersaglio RbcS-nt:GFP dovrebbe fondersi con i segnali fluores...

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Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

Qui descriviamo un protocollo per esprimere proteine in protoplasti utilizzando il metodo di trasformazione PEG-mediata. Il metodo fornisce facile espressione di proteine di interesse e di indagine efficiente di localizzazione della proteina e il processo di importazione per varie condizioni sperimentali in vivo.

Lo studio di proteine importazione in cloroplasti utilizzando protoplasti

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

Questo mistero può aiutare a rispondere ad alcune domande nel campo della biologia cellulare come l'input proteico nei cloroplasti. Il vantaggio principale di questa tecnologia è che l'apporto proteico nei cloroplasti può essere studiato in condizioni en vivo. A dimostrare la procedura saranno Junho Lee e Hyangju Kang, due post out dal mio laboratorio.Per iniziare, raccogli tessuti fogliari intatti da piante vecchie di due settimane da uno a due piatti B5. Utilizzare un coltello chirurgico per raccogliere le foglie e posizionarle in un tubo conico da 50 millilitri contenente 25 millilitri di soluzione enzimatica. Posizionare il tubo orizzontalmente su uno shaker rotante e incubare con delicata agitazione a 22 gradi Celsius al buio per otto-12 ore fino a quando nella soluzione rimangono solo piioli e steli.Dopo aver completato l'incubazione, filtrare la soluzione enzimatica contenente protoplasti rilasciati attraverso una rete di dimensioni dei pori da 140 micrometri in una piastra di Petri fresca. Quindi stratalizza con cura la soluzione sopra 15 millilitri di soluzione di saccarosio al 21% in un tubo conico da 50 millilitri. Centrifugare il tubo in un rotore a benna oscillante a 98 g per 10 minuti con le impostazioni di accelerazione e decelerazione più basse.Successivamente, utilizzare la pipetta di patura per rimuovere accuratamente i protoplasti dallo strato superiore contenente soluzione enzimatica e dall'interfaccia tra la soluzione di enzimi e la soluzione di saccarosio. Trasferire questa soluzione in un tubo conico da 50 millilitri contenente 30 millilitri di soluzione W5 e invertire il tubo per mescolare. Centrifugare il tubo a 51 g per sei minuti.Utilizzare una pipetta per scartare attentamente questo supernatante senza disturbare i protoplasti nel pellet. Aggiungere 25 millilitri di soluzione W5 e sospendere delicatamente i protoplasti. Per la stabilizzazione, incubare in un frigorifero di quattro Celsius per un minimo di un'ora.Dopo quattro gradi Celsius di incubazione, pellet i protoplasti completamente centrifugandoli a 46 g per due minuti. Rimuovere con cura il supernatore completamente e aggiungere la soluzione MANG al pellet di protoplasto per ottenere cinque volte dieci a sei per millilitro. Utilizzare una pipetta per aggiungere 10 microgrammi del DNA plasmatico e 300 microlitri di soluzione di protoplasto a un tubo dal fondo rotondo fresco da 13 millilitri.Mescolare ruotando delicatamente i tubi a mano e quindi aggiungere immediatamente 300 microlitri di soluzione 40%PEG preparata al momento. Mescolare completamente inclinando il tubo quasi orizzontalmente e ruotandolo dolcemente più volte a mano. Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.Quindi aggiungere un millilitro di soluzione W5 e mescolare completamente ruotando delicatamente il tubo a mano come in precedenza. Incubare il campione per 10 minuti a temperatura ambiente. Ripetere altre due volte aggiungendo prima 1,5 millilitri e poi due millilitri di W5 e dopo l'aggiunta finale e la miscelazione, incubare per 30 minuti.Centrifugare il tubo a 46 g per quattro minuti e quindi scartare il supernatante. Aggiungere due millilitri di soluzione W5 al pellet e mescolare delicatamente, ma completamente, allo stesso modo di prima. Incubare a 22 gradi Celsius in una camera scura per 18 ore.Per analizzare l'importazione di proteine utilizzando la microscopia a florescence, utilizzare una pipetta con una punta tagliata per posizionare 10 microlitri della soluzione di protoplasto su uno scivolo di vetro. Utilizzare una lapsus per coprire attentamente la soluzione per evitare di danneggiare i protoplasti. Posizionare lo scivolo sul palco di un microscopio a fluorescenza con un filtro di ammissione all'eccitazione impostato per osservare la proteina fluorescente verde e l'autofluorescenza della clorofilla.Utilizza una fotocamera del dispositivo di coppia di carica raffreddata per acquisire immagini ed elaborarle utilizzando un software di editing immaginato per produrre immagini pseudocolori. Per l'estrazione totale di proteine e l'immunoblotting, rimuovere un millilitro dalla soluzione di protoplasto e mescolare il restante millilitro. Trasferire questa soluzione di protoplasto in un tubo di centrifuga e centrifugare a 46 g per quattro minuti.Rimuovere il supernatante dopo aver completato la centrifugazione e aggiungere 80 microlitri di tampone di denaturazione. Vortice con vigore per cinque secondi. Aggiungere cinque tamponi campione XDS, mescolare bene e far bollire per 10 minuti alla denaturazione.Procedere con la pagina STS standard e l'immunoblotting con anticorpo anti-GFP. RbcS e TGFT, un costrutto di fusione che codifica per i 79 residui terminali di amminoacidi terminali di RBCS contenenti il peptide di transito fuso alla GFP, è stato utilizzato per studiare l'importazione di proteine nei cloroplasti mediante microscopia a florescence e immunoblotting. Se esaminati dalla microscopia a florescence, i segnali fluorescenti verdi della proteina bersaglio si sono fusi con i segnali fluorescenti rossi dell'autoflorescenza della clorofilla che indicano l'importazione di proteine nei cloroplasti.Dopo aver isolato la proteina totale, due bande proteiche sono osservate nell'immunoblot, dimostrando che una proteina è stata correttamente importata nei cloroplasti. La banda superiore corrisponde al precursore di tutta la lunghezza e alla banda inferiore alla forma lavorata dopo l'importazione in cloroplasti. La quantità della forma trasformata della proteina è aumentata in modo dipendente dal tempo, suggerendo che la proteina viene importata in cloroplasti.In questo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della biologia cellulare per esplorare il stancante proteico o la raccolta del filo di membrana in Arabidopsis.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Utilizzando impalcatura liposomi per ricostituire interazioni proteina-proteina lipidi-prossimale<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Ricerca

Biochimica

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Scambio risolta in tempo ionizzazione elettrospray idrogeno-deuterio Spettrometria di Massa per lo studio delle proteine ​​Struttura e dinamica

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

Cattura di Interactome mRNA da protoplasti vegetali

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Purificazione della proteina anaerobica e analisi cinetica tramite elettrodo di ossigeno per lo studio di inibizione e attività di Dioxygenase di Giuroma90

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

Soluzione di strutture della proteina fluorescente Cerulean utilizzando MeshAndCollect

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Alta sensibilità misura dell'affinità di legame di DNA di fattore di trascrizione per titolazione competitivo mediante microscopia a fluorescenza

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analisi della piegatura della proteina, trasporto e degradazione in cellule viventi di radioattivo Pulse Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Lo studio di RNA interattori della chinasi proteica RNA-attivato durante il ciclo cellulare dei mammiferi

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Applicazione dell'interferometria biostrato (BLI) per lo studio delle interazioni tra proteine e proteine nella trascrizione

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Valutazione delle interazioni tra proteine e proteine utilizzando una tecnica di digestione On-Membrane

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...